Gli autori desiderano ringraziare Tammy Esmaili per la sua assistenza nella gestione dei materiali di consumo di laboratorio. AA è il destinatario di una borsa di studio di dottorato di ricerca del Centro di Eccellenza per la ricerca sulle malattie di Alzheimer e cura, Scuola di Scienze Mediche, Edith Cowan University. MC riceve il dottorato sostegno finanziario del Rotary Club, Perth. AM, GV, KT, e la RNM sono finanziati dalla fondazione di ricerca della malattia di Alzheimer di McCusker.

1. Manutenzione del sistema <ol><li> Zebrafish sono conservati in un sistema di circolazione che continuamente filtri e arieggia il sistema di acqua per mantenere la qualità dell&#39;acqua necessaria per un ambiente acquatico sano. Il sistema di circolazione consente inoltre di filtrare l&#39;eccesso di cibo e gli escrementi dei pesci. Diverse aziende di fornire sistemi di zebrafish, ma usiamo i sistemi di habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America nel nostro laboratorio. La temperatura ambiente o la temperatura del serbatoio è generalmente mantenuta tra 26-28,5 ° C e le condizioni di luce sono ore 14:10 (luce: buio). Un sistema di zebrafish da habitat acquatici (ad esempio, sistema da banco) costi ~ 9,000 USD. Questo sistema da banco a due ripiani può contenere sei da 10 litri, dodici da 3 litri, o 20 da 1,5 litri serbatoi su ogni singolo ripiano. Linee multiple di pesce (es. transgenica, mutante, wild type) possono anche essere alloggiati nello stesso sistema. </li><li> Un insieme di diversi tipi di filtri sono utilizzati nel sistema. Nel nostro sistema, l&#39;acqua da tutte le vasche di paSSEs attraverso un filtro da 120 micron pad, 50-micron cartuccia del filtro, filtro biologico, filtro a carboni attivi assorbimento e filtro UV disinfezione prima di essere rimessi in circolo nella vasca. Acqua De-chlorinated/aged viene utilizzato nel sistema zebrafish. L&#39;acqua può essere de-clorurati con l&#39;invecchiamento per almeno 48 ore. In condizioni ideali, l&#39;acqua deve essere conservato in un serbatoio con una pompa di circolazione dell&#39;acqua per mantenerlo caldo, e accelerare la de-clorazione. </li><li> Il pH dell&#39;acqua dell&#39;impianto deve essere controllata quotidianamente e mantenuto tra 6,8 e 7,5. Quando necessario, bicarbonato di sodio deve essere utilizzato per aumentare il pH. </li><li> Acquari devono essere puliti regolarmente. Per pulire un acquario, chiudere il flusso di acqua a questo serbatoio, lo scarico dell&#39;acqua in eccesso inclinando il serbatoio all&#39;indietro e rimuovere il serbatoio accuratamente dal sistema. Lo sporco e la crescita delle alghe saranno evidenti sul fondo e sui lati del serbatoio. </li><li> Posizionare il deflettore in un serbatoio pulito, e riempire con acqua de-clorurati (aka sistema water). Cura trasferire il pesce in questo serbatoio con una rete da pesca. Chiudere il coperchio e trasferire la targhetta con il nome del serbatoio. Disporre con attenzione il serbatoio pulito nel sistema e attivare la fornitura di acqua. </li><li> Per decontaminare la rete pesce, spruzzare con il 70% di etanolo, sciacquare in acqua, e lasciarlo asciugare prima di riutilizzare. Rimuovere il deflettore dal serbatoio sporco e spruzzare due parti con etanolo 70%. Sciacquare accuratamente con acqua di rubinetto e lasciare il serbatoio e deflettore per asciugare completamente prima di riutilizzare. </li><li> I filtri del sistema di circolazione deve essere controllato e sostituito regolarmente per garantire la loro funzione. Questi filtri devono essere cambiati regolarmente per garantire l&#39;approvvigionamento idrico adeguato e pulita a tutti gli acquari. </li><li> Il 120-micron tampone filtro è solitamente riposizionato o sostituito giornalmente; riposizionare verso il flusso dell&#39;acqua di utilizzare completamente prima di sostituire con uno nuovo. </li><li> Il filtro Canister deve essere cambiato ogni settimana. Per cambiare il filtro a canestro, rimuovere l&#39;unità filtro ruotando formicaiclockwise con una chiave o con le mani. Posizionare un foglio di plastica o un asciugamano di seguito per evitare o assorbire fuoriuscite d&#39;acqua. Sostituire il filtro a canestro con una nuova e rimontare il filtro di unità nel sistema, serrare accuratamente con le mani e una chiave, se necessario. </li><li> Il filtro a carbone deve essere sostituito ogni due settimane (ogni due settimane). Per cambiare il filtro a carbone, rimuovere l&#39;unità filtro a carboni accuratamente con una chiave. Scartare il carbone attivo utilizzato e sostituirlo con nuovo carbone attivo. Rimontare il supporto di carbonio e rimettere poi il gruppo filtro. Rimontare il filtro dell&#39;unità nel sistema. Accendere il sistema e controllare che l&#39;acqua scorra al filtro. Se necessario, pulire l&#39;acqua attraverso i tubi per pulire lo sporco nei tubi prima di montare il filtro nel sistema. </li><li> Il filtro biologico dovrebbe essere pulito ogni sei mesi. Un filtro biologico è generalmente situato tra il filtro e il filtro carbonio nel sistema di circolazione. Per cambiare il filtro biologico, remOve l&#39;unità filtro dal sistema. Rilasciare la pressione dal filtro premendo il pulsante di rilascio della pressione. Svitare il filtro con una chiave. Generalmente sono necessarie due persone per questo passo. Rimuovere il coperchio dell&#39;unità filtro. Svuotare il contenuto del filtro in un contenitore setacciata per separare il siporax dall&#39;acqua. Nota: siporax è un bel poro bio-filtro dei media che ha la capacità di eseguire sia la nitrificazione e denitrificazione. </li><li> Se il siporax è molto sporca, sostituirla con una nuova. Riempire l&#39;unità filtro con acqua di sistema (de-acqua clorata), chiudere il coperchio, restituire l&#39;unità filtro per il sistema e attivare la fornitura di acqua. Nota: In un acquario acclimatati, il siporax sarà sede di numerosi batteri nitrificanti. Questi microrganismi sono fondamentali per il mantenimento del ciclo dell&#39;azoto in acquario, e rimuovendo l&#39;alloggiamento primario per il filtro biologico (la siporax sporco) può causare un picco di ammoniaca grave, seguito da un picco nitrito mentre il new filtro biologico (con siporax nuovo) è ristabilire. Entrambi questi stati intermedi del ciclo dell&#39;azoto può essere tossico per gli organismi acquatici, e può uccidere zebrafish se non ha risposto in modo appropriato. Pertanto, è importante avere un filtro biologico secondario altrove nel sistema alloggiamento zebrafish (ad esempio, nella vasca di raccolta in Aquatic sistema habitat) per consentire una rapida ripopolazione di questi microrganismi importanti sul siporax nuovo. </li><li> Filtri UV sono utilizzati per controllare i contaminanti biologici di sistema (come batteri) e deve essere sostituito ogni 9-10 mesi. Va notato che filtro UV dose disinfezione è ~ 110 mJ / cm 2, all&#39;inizio della durata della lampada e la dose diminuisce nel corso del tempo, quindi è necessario sostituire il globo anche quando appare ancora funzionale. </li></ol> 2. Alimentazione <ol><li> Zebrafish possono essere alimentati con alimenti secchi (dimensione cibo da 100 micron per t larveo 300/400 micron per i pesci adulti) o cibo vivo (artemie). Salamoia gamberetti (Artemia sp.) Le uova sono disponibili presso negozi di animali locali e possono essere nati in laboratorio, seguendo i semplici passi descritti di seguito. <ol class="lalpha"><li> Sciogliere il sale in acqua di mare rosso invecchiato ponendo un becher con sale su un agitatore magnetico per una migliore solubilità. In alternativa, il sale può essere dissolto in acqua mediante aerazione con il tubo areatore. Sale marino istantanea può essere utilizzato anche come soluzione cova se rosso sale marino non è disponibile. Artemie possono tollerare una vasta gamma di salinità, tuttavia, ci schiudono il nostro gambero di salamoia (10-15 g) nel 30-35 g / L di acqua salata del mare rosso. Nota: In caso di uova di artemia salina non sono facilmente reperibili nei negozi di animali locali poi artemie incapsulati possono essere utilizzati anche dopo &quot;decapping&quot; in batch prima di aggiungerli all&#39;incubatoio gamberetti. Questo potrebbe anche evitare di frequenti viaggi al negozio di animali. </li><li> Riempire la schiusa artemie con salt acqua e aggiungere le uova gamberetti ad una concentrazione di 1,2 cucchiai / litro. Aerare la schiusa energicamente con una pompa ad aria e lasciare le uova salamoia gamberetti a schiudersi per ~ 48 ore. Nota: Si noti che il non-arricchito artemia perdere valore nutrizionale ogni ora dopo la schiusa. Pertanto, può essere opportuno o botola oltre 24 ore o arricchire oltre 48 ore in modo da ottenere il massimo valore nutritivo dal artemie. </li><li> Acque di scarico dal sistema di schiusa viene aggiunto ai rifiuti quarantena per essere disinfettate con candeggina e disposto in seguito. </li></ol></li><li> Per raccogliere le artemie, rimuovere il tubo dell&#39;aria e consentire la cultura riposare per 4-5 minuti, ma non per più di 10 min. Le artemie tratteggiate si riuniscono nella parte inferiore della Hatcher. <ol class="lalpha"><li> Raccogliere artemie con il rubinetto in fondo della schiusa. Eliminare il flusso iniziale che consiste di uova salamoia non-nati gamberetti. </li><li&gt; Dopo aver scartato i non-nati artemie, raccogliere le artemie nati che saranno utilizzati come cibo zebrafish. </li><li> Separare le artemie dall&#39;acqua salata, con una rete di salamoia gambero raccolta (~ 350 micron maglia di nylon). Lavare i gamberetti salamoia dalla rete in un contenitore con acqua del sistema. </li></ol></li><li> Le artemie raccolti sono generalmente presenti in elevata concentrazione sul fondo del contenitore dando un colore piuttosto arancione. </li><li> Inserire le artemie al zebrafish utilizzando una pipetta o un contagocce / squeezy bottiglia. La quantità di cibo erogato dipende dalla dimensione della popolazione singoli serbatoi. Il rapporto comunemente accettato per zebrafish è ricevere 4% del peso corporeo in alimento al giorno. Zebrafish non dovrebbe mai essere sovralimentati in quanto ciò può aumentare il livello di nitrati nell&#39;acqua, la riduzione dei suoi allevamento, o la vitalità, come alcuni pesci possono morire a causa di eccesso di cibo. <ol class="lalpha"><li> Dopo l&#39;iniezione di cibo nelacqua, nuotano pesci affamati per prendere le artemie. </li></ol></li><li> Alimentazione a secco può essere effettuata utilizzando un ecosistema acquatico di / habitat acquatici semplice molla a base di dispenser cibo per pesci. In alternativa, l&#39;alimentazione secca può anche essere eseguita usando un semplice cucchiaio o tagliando un contagocce di plastica diagonalmente con le forbici per dare un aspetto di un cucchiaino. </li></ol> 3. Allevamento <ol><li> Zebrafish avviare allevamento all&#39;inizio della luce. Uova fecondate può essere ottenuta o attraverso in-vasca di allevamento o di allevamento a coppie. Mentre nella vasca di allevamento è più lavoro efficiente e che sia attuato raccolta di embrioni regolare nel nostro laboratorio, allevamento a due a due è preferibile quando i geni o mutazioni devono essere sottoposti a screening di singoli pesci. </li><li> Per in-vasca di allevamento, montare il serbatoio in allevatore e rilasciare lentamente nella vasca di pesci dopo l&#39;inizio della luce. In alternativa, nella vasca da riproduzione di set-up può essere lasciato durante la notte nella vasca dei pesci. </li><li> Lgronda in-serbatoio allevatore per circa 15 min per permettere il pesce di accoppiarsi prima di rimuovere l&#39;allevatore dal serbatoio e raccolta delle uova. </li><li> Allevamento a coppie in genere costituito nel tardo pomeriggio dopo il pasto. </li><li> Montare il serbatoio allevamento e riempirlo con acqua sistema invecchiato. </li><li> Trasferire una femmina e un maschio per lati opposti della vasca di riproduzione. Femmine possono essere distinte da maschi a causa della loro grande ventre. I maschi possono anche essere distinti dalle femmine perché sono più sottili e di colore più scuro rispetto alle femmine. Inoltre, i maschi hanno colorazione più giallo nella pinna anale rispetto alle femmine (vedi Figura 1). Quando nel look dubbio per l&#39;ovopositore in zebrafish femminile (vedi Figura 4). </li><li> Rimuovere il divisore la mattina seguente poco dopo l&#39;inizio della luce. Consentire l&#39;accoppiamento a verificarsi indisturbata per 20 minuti o fino a quando un numero sufficiente di embrioni sono fissate al fondo del serbatoio. </li><li> Dopo l&#39;allevamento,riportare il pesce per i loro carri armati. Raccogliere le uova con un colino. </li><li> Lavare gli embrioni accuratamente con acqua del sistema. </li><li> Trasferire gli embrioni ad una piastra di Petri risciacquando il filtro con mezzo embrione alias EM3 (NaCl, 13,7 mM, KCl, 0,54 mM; MgSO 4, 1,0 mM, CaCl 2, 1,3 mM, Na 2 HPO 4, 0,025 mM, KH 2 PO 4, 0,044 mM, NaHCO3, 4,2 mm). </li><li> Embrioni possono essere osservati al microscopio. Ovuli fecondati vengono separate dalle uova fecondate utilizzando un ago e una pipetta (vedi Figura 3). </li></ol> 4. Allevamento di larve <ol><li> Uova fecondate sono conservati in un incubatore (~ 28.5 ° C) per 72 ore fino a quando le larve sono schiuse. </li><li> Ora le larve sono fuori dal corion e nuotare liberamente sono pronti a trasferire in un acquario principale. Le larve hanno bisogno di essere nutriti da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) e sono tenuti in mezzo embrione (composizione descritta inParte 3, 10) o acqua sistema. Larve possono essere tenuti in piatti rotondi con ~ 50% o più di acqua in esso cambiata su base giornaliera. Il cambio d&#39;acqua dovrebbe includere la rimozione di larve morte o malate e altri detriti. </li><li> Trasferire le larve dolcemente in un serbatoio contenente un deflettore di piccole dimensioni (circa 300-400 micron). Larve morte e malato deve essere rimosso e qualche millilitro di acqua dovrebbe essere aggiunto lentamente su una base quotidiana. </li><li> Dopo 14 giorni, i carri armati larve può essere archiviato nel sistema, e fornito con un flusso d&#39;acqua in bicicletta (1-2 gocce al secondo). Come le larve crescono, il flusso d&#39;acqua può essere aumentata. Diverse dimensioni di deflettori può essere utilizzato a seconda delle dimensioni delle larve (deflettore esempio dimensione 300-400, 500, 700-750, e 1000 micron) e un deflettore di plastica normale dovrebbe essere utilizzato per il pesce adulto. </li><li> Di solito ci vogliono 3 mesi per gli embrioni di svilupparsi in adulti sessualmente maturi. </li></ol>

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+color+preference+in+zebrafish+for+learning+and+memory.">Evaluation of color preference in zebrafish for learning and memory.</a> J. Alzheimers Dis. 28, 459-469 (2012).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 83, 13-34 (2008).</li><li>Best, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-associative+learning+in+larval+zebrafish.">Non-associative learning in larval zebrafish.</a> Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).</li><li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish.">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15468-15473 (2011).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebra+fish:+an+uncharted+behavior+genetic+model.">Zebra fish: an uncharted behavior genetic model.</a> Behav. Genet. 33, 461-468 (2003).</li><li>Eddins, D., Petro, A., Williams, P., Cerutti, D. T., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+effects+on+learning+in+zebrafish:+the+role+of+dopaminergic+systems.">Nicotine effects on learning in zebrafish: the role of dopaminergic systems.</a> Psychopharmacology. (Berl). 202, 103-109 (2009).</li><li>Colwill, R. M., Raymond, M. P., Ferreira, L., Escudero, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+discrimination+learning+in+zebrafish+(Danio+rerio.">Visual discrimination learning in zebrafish (Danio rerio.</a> Behav. Processes. 70, 19-31 (2005).</li><li>Blaser, R. E., Chadwick, L., McGinnis, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+measures+of+anxiety+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Behavioral measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav. Brain Res. 208, 56-62 (2010).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Delaney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interaction+and+distribution+of+female+zebrafish+(Danio+rerio)+in+a+large+aquarium.">Social interaction and distribution of female zebrafish (Danio rerio) in a large aquarium.</a> Biol. Bull. 203, 240-241 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Zebrafish provengono dal fiume Gange nel nord dell&#39;India e stanno diventando sempre più popolare nel campo della ricerca, sia con gli adulti e stadi larvali 2, recensione da Spence et al. 3. Zebrafish in possesso di diversi vantaggi rispetto ad altri modelli animali, come fecondità elevata, facilità di manutenzione, la clearance ottica di embrioni, il rapido sviluppo embrionale, e bassi costi di manutenzione. Esse sono suscettibili di manipolazione genetica 6 e adatto per high throughput screening di farmaci 4,5. Loro fecondazione è esterna che è vantaggioso per il loro uso da biologi dello sviluppo. Grazie a queste caratteristiche favorevoli, pesce zebra stanno guadagnando popolarità in genetica 7, farmacologico 8 e ricerca comportamentale 9,10. Ci sono una serie di sfide per mantenere un impianto di zebrafish e allevamento zebrafish per ottenere embrioni. Qui, descriviamo le nostre esperienze e le raccomandazioni per affrontare queste sfide e outline un protocollo per la manutenzione del sistema, alimentazione, allevamento e raccolta delle larve. Manutenzione del sistema Per mantenere zebrafish in condizioni di buona salute, è importante fornire loro un ambiente pulito in un sistema di acquario ben funzionante. Una parte importante di questo sistema sta cambiando filtri regolarmente in modo che tutti i serbatoi ricevono corretto flusso d&#39;acqua e acqua pulita. E &#39;fondamentale per evitare il fallimento della fornitura d&#39;acqua in bicicletta per ogni serbatoio a causa di tubi di sistema bloccati. I tubi possono essere puliti con una portata superiore a quella normale, la pressione dell&#39;acqua e se il blocco si verifica. Idealmente, circa il 10% di acqua del sistema dovrebbe essere sostituito ogni giorno per mantenere una buona qualità dell&#39;acqua. In alternativa, l&#39;acqua può essere sostituito durante la sostituzione della scatola metallica o di un filtro al carbonio. Questo assicura che lo sporco depositato nei tubi di collegamento questi filtri viene rimosso. La qualità dell&#39;acqua deve essere controllata regolarmente. Parametri come l&#39;alcalinità, pH, temperature, durezza, ammoniaca, ossigeno disciolto, salinità, conducibilità e dovrebbe essere considerata come fattori importanti che rappresenta la qualità dell&#39;acqua dell&#39;impianto (vedi Tabella 2 per i dettagli). Al nitrato meno, il pH e la temperatura devono essere monitorati regolarmente per garantire una buona qualità dell&#39;acqua per zebrafish abitazioni. Ideale nitrato (NO 3 -) livelli sono &lt;50 mg / L 11; alta se questi livelli può essere ridotto sostituendo l&#39;acqua nel sistema di circolazione con il sistema di acqua fresca. Di tanto in tanto, i filtri non si adattano bene e perdere quindi si consiglia di verificare la presenza di eventuali perdite dopo una sostituzione del filtro. Se il flusso di acqua dal serbatoio principale è bloccato o dopo aver cambiato la pompa dell&#39;acqua o sostituire un filtro, il flusso d&#39;acqua può essere ripristinata o allentare o rimuovere il filtro per alcuni secondi per rilasciare il vuoto viene generato nei tubi. Il tempo necessario per cambiare i filtri possono variare a seconda di vari fattori come il carico totale o biologican il sistema, la pulizia di filtri altri, e lo sporco depositato nei tubi. Di conseguenza, i filtri devono essere immediatamente sostituiti se appaiono sporchi o se tutti i serbatoi non ricevono la corretta alimentazione dell&#39;acqua. Si raccomanda inoltre che il pesce netto essere puliti con etanolo al 70%, e risciacquato con acqua per decontaminare, e lasciati asciugare prima di essere riutilizzati. Essiccazione garantisce evaporazione di etanolo che altrimenti è tossico per i pesci. La maggior parte dei sistemi di zebrafish utilizzare de-clorurati acqua del rubinetto, ma alcuni sistemi usare acqua deionizzata. È importante mantenere la conducibilità dell&#39;acqua di sistema tra 300 e 1.500 ~ mS quanto riduce l&#39;energia del pesce deve mantenere sali corporei. Pertanto, zebrafish non può essere conservato in acqua deionizzata a meno sali sono aggiunti per mantenere i livelli ottimali di conducibilità. Vi è il rischio di possibili concentrazioni elevate di rame in acqua di rubinetto sistema se viene utilizzato perché il filtro al carbone non rimuove rame. Pertanto, users dovrebbe verificare per le concentrazioni di rame e tubazioni di rame evitare, ove possibile. Alimentazione Zebrafish non dovrebbe mai essere sovralimentati in quanto ciò può aumentare il livello di nitrati nell&#39;acqua, la riduzione dei suoi allevamento 11, o la vitalità, come alcuni pesci possono morire a causa di eccesso di cibo. Si consiglia di fornire più cibo nel corso di uno di alimentazione di un serbatoio di pesce può finire in 10 minuti. E &#39;molto importante per eliminare il sale dai artemie prima di espellerle alla zebrafish come concentrazione di sale in eccesso provoca la morte. Se uova zebrafish sono necessari più, pesce può essere alimentato tre volte al giorno. Pulizia dei serbatoi allevatore di pesce tutti i giorni migliora anche i livelli di produzione di uova. Durante l&#39;alimentazione sui sistemi acquatici habitat di solito spegnere la pompa dell&#39;acqua e la pompa d&#39;aria per permettere al pesce di mangiare il cibo per 10 minuti. Questo diminuisce la quantità di cibo che viene lavata nei filtri. Tuttavia, gli utenti devono fare attenzione a remEmber per accendere queste pompe di nuovo in seguito. Allevamento Zebrafish sono di solito in condizioni di allevamento ottimale tra ~ 3 e 18 mesi di età. Allevamento a coppie non deve essere eseguita per due giorni consecutivi, 11; tuttavia, in vasca da riproduzione può essere effettuata tutti i giorni come un serbatoio può contenere molti pesci che riduce la possibilità della stessa coppia di pesci vengono allevati per due giorni di fila. Allevamento dovrebbe essere effettuata ad intervalli regolari, anche se le uova non sono necessarie. Questo processo assicurarsi che il ciclo di allevamento del pesce è mantenuta. Si raccomanda che non ci sono più femmine che maschi in un allevamento di set-up. Zebrafish Maschio cambiare le loro partner femminili su un 12 base giornaliera che supporta ulteriormente questa raccomandazione. Inoltre, nel nostro laboratorio abbiamo inizialmente avuto problemi con l&#39;allevamento, tuttavia, utilizzando più femmine che maschi in un allevamento di set-up aiutato a risolvere il problema. Inoltre, alimentando con una proteina conte altont dieta e artemia due-tre volte al giorno, pesce di miscelazione da serbatoi diversi (diversi dai genitori), mantenendo la temperatura del allevamento set-up tra 27 e 28 ° C, e stringendo la pancia delle femmine con tubi ovariche bloccate con leggero massaggio ulteriormente migliorato la produzione di uova. Si consiglia di mantenere una registrazione di linee di pesce / origini per evitare in-allevamento tra fratelli. Questo incrementa la produzione di embrioni. Mantenere una registrazione del numero di embrioni di cui cattura di pesci di ogni serbatoio è anche raccomandato. Questo aiuta a mantenere una traccia delle vasche di allevamento dei pesci migliori e prendere misure volte a migliorare l&#39;allevamento del pesce non deporre le uova. Allevamento di larve Alimentazione delle larve dovrebbe iniziare da 5 dpf (giorni dopo la fecondazione). Larve giovani possono essere nutriti con cibo secco di circa 100 micron di dimensione (ad esempio, ZM100) o cibo vivo come paramecio e rotiferi (che stimola la crescita). La dimensione cibo può essere aumentata lentamentea 200 micron (es. ZM200) o 300/400 micron (es. ZM300). Una popolazione di pesci adulti dovrebbe essere di circa 6-7 pesci per litro d&#39;acqua. Questa pratica è consigliata per una migliore manutenzione della BOD (domanda biologica di ossigeno) ai serbatoi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafish sistema di circolazione </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Achab stand-alone, da banco sistemi </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di Sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Pesce dispenser cibo / alimentatore cibo secco </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> AH19 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> SZX12 </td><td></td></tr><tr><td> Cibo secco </td><td> ZM cibo per pesci, Regno Unito </td><td> ZM100, ZM200, ZM300 </td><td></td></tr><tr><td> Salamoia gamberetti uova </td><td> Salt Creek, Inc., USA </td><td> Premium Grade </td><td></td></tr><tr><td> In-tank allevatori</td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> ITSTS-A </td><td></td></tr><tr><td> Carbone attivo </td><td> Penn-Plax Pro-granchio, Stati Uniti d&#39;America </td><td> PBC3MF </td><td></td></tr><tr><td> Allevamento serbatoi </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> SBTANK (1L) Allevatore Tank-2 (2L) </td><td></td></tr><tr><td> Red sale marino </td><td> Red sale marino, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Negozio di animali locale / <a href="http://www.redseafish.com" target="_blank">www.redseafish.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Filtri (scatola metallica, pastiglie filtro e UV) </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Siporax media </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> BF 820 </td><td></td></tr><tr><td> Brine shrimp net </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> BSN1 </td><td></td></tr><tr><td> Brine shrimp schiusa </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> BS252 </td><td></td></tr><tr><td> Baffles </td><td> Habitat acquatici, Stati Uniti d&#39;America </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche utilizzati in questo protocollo. </td></tr></tbody></table>

regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: an introduction

Questo protocollo descrive la cura e la manutenzione regolare di un laboratorio zebrafish. Zebrafish stanno guadagnando popolarità nel campo della genetica, la ricerca farmacologica e comportamentale. Come un vertebrato, parti zebrafish considerevole genetica similarità di sequenza con gli esseri umani e vengono utilizzati come modello animale per varie patologie umane. I vantaggi di zebrafish in confronto ad altri modelli di vertebrati comuni includono fecondità elevata, bassi costi di manutenzione, embrioni trasparenti, e di rapido sviluppo. A causa della sperone di interesse per la ricerca zebrafish, la necessità di stabilire e mantenere una struttura alloggiativa produttiva zebrafish è in aumento. Sebbene la letteratura è disponibile per il mantenimento di un laboratorio zebrafish, un protocollo video concisa manca. Questo video illustra il protocollo di abitazioni regolari, alimentazione, riproduzione e allevamento di larve di zebrafish. Questo processo consentirà ai ricercatori di comprendere il comportamento naturale e le condizioni ottimali di zebrafish allevamento e quindi risolvere i problemi sperimentali che provengono da condizioni di allevamento dei pesci. Questo protocollo sarà di grande aiuto per i ricercatori che intendono creare un laboratorio zebrafish, e anche a studenti laureati che intendono utilizzare zebrafish come modello animale.

Alloggiamento Zebrafish e la manutenzione è più facile e meno costoso rispetto ai modelli tradizionali di roditori. Diverse migliaia zebrafish può essere alloggiato in un piccolo laboratorio. Come risultato di questo protocollo, i ricercatori saranno in grado di gestire un impianto zebrafish che fornirà condizioni sani al zebrafish. Inoltre, le seguenti figure aiuterà uova fecondate identificare, zebrafish adulti, e il loro cibo. L&#39;illustrazione di un pesce zebra maschio (Figura 1A) e zebrafish femminile (Figura 1B e 1C) è indicato per aiutare i ricercatori a distinguere tra un maschio e una femmina per l&#39;allevamento di pesce zebra scopo la figura 2 illustra una visione microscopica,. Artemie a 12X (Figura 2A), un gambero di salamoia singolo a 90X (Figura 2B), e un uovo non fecondato artemia a 90X (Figura 2C). Questo aiuterà a capire la differenza tra artemie non fecondate e fecondato per proper mangimi. Uova fecondate e non fecondato sono mostrati in Figura 3. Figura 3A illustra una vista microscopico di embrioni fecondati e non fecondato. Embrioni non fecondate sono generalmente opachi e / o con celle rottura (s) all&#39;interno del corion (freccia nera) mentre embrioni fecondati appare intatto e crescente allo stato successivo divisione cellulare (per la lettura dettagliata delle diverse fasi embrioni di zebrafish vedi 1). Vista ingrandimento superiore di una figura fecondato e un ovulo non fecondato è mostrato in figura 3B e 3C, rispettivamente. 4 illustra un ovopositore zebrafish femminile per aiutare i ricercatori a distinguere tra un maschio e una femmina zebrafish. Diversi problemi critici che potrebbero verificarsi in un laboratorio zebrafish includono il blocco di approvvigionamento di acqua ad una persona / tutti i serbatoi del sistema di allevamento, cattiva qualità dell&#39;acqua, e le perdite in tubazioni o serbatoio del sistema di circolazione. Inoltre,problemi per ottenere embrioni da allevamento potrebbe essere un altro problema. Risoluzione dei problemi di questi aspetti è discusso di seguito. <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. L&#39;illustrazione di un pesce zebra maschio (A) e femminile zebrafish (B, C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un punto di vista microscopico di artemie a 12X (A), un gambero di salamoia singolo a 90X (B), e un uovo non fecondato artemia a 90X (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Vista microscopico (16X) di uova fecondate e non fecondato, in cui vengono fecondate solo due uova, le uova non fecondate sono indicate con frecce nere (A). Maggiore ingrandimentoview (90X) di un fecondato (B) e un uovo fecondato (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un pesce zebra femmina ovopositore (indicata con la freccia nera) illustrazione. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Parametro </td><td fo:width="3in"> Gamma ottimale </td></tr><tr><td> Alcalinità </td><td> 50-150 mg / L CaCO3 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 6,8-7,5 (6,0-8,5 tollerata) </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 26-28,5 ° C </td></tr><tr><td> Durezza </td><td> 50-100 mg / L CaCO3 </td></tr><tr><td> Un-ionizzato Ammoniaca </td><td> &lt;0,02 mg / L </td></tr><tr><td> Nitrato (NO 3 -) </td><td> &lt;50 mg / L </td></tr><tr><td> Nitriti (NO 2 -) </td><td> &lt;0,1 mg / L </td></tr><tr><td> Di ossigeno disciolto </td><td> &gt; 6,0 mg / L </td></tr><tr><td> Salinità </td><td> 0,5-1 g / L </td></tr><tr><td> Conducibilità </td><td> 300 -1500 mS </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Parametri di qualità dell&#39;acqua. Qualità dell&#39;acqua parametri. Intervallo ottimale di parametri ambientali in acquario zebrafish 11.

Watch this Scientific Journal Video about Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction at JoVE.com

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Questo protocollo descrive una regolare manutenzione e cura per mantenere le condizioni ottimali per zebrafish allevamento. Il video illustra il protocollo per la manutenzione del sistema, regolarmente ad una casa, l&#39;alimentazione, l&#39;allevamento, e l&#39;aumento di larve di zebrafish.

Cura e manutenzione periodiche di Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorio: Introduzione

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

regular-care-maintenance-zebrafish-danio-rerio-laboratory-an

Research

JoVE Journal

Biology

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

88.6K Views.  Edith Cowan University. Questo protocollo descrive una regolare manutenzione e cura per mantenere le condizioni ottimali per zebrafish allevamento. Il video illustra il protocollo per la manutenzione del sistema, regolarmente ad una casa, l'alimentazione, l'allevamento, e l'aumento di larve di zebrafish.

Video: Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Ricerca

Biologia

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Istituzione e manutenzione di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.