NIHの助成金RC1-HL-101102、P01-CA039542、T32-HL007622、ハートウェル財団、ドリス·デューク慈善財団によってサポートされています。博士PaczesnyはエリックハートウェルファンドとエイミーStrelzer Manasevit研究プログラムの研究者でもある。

1。実験0日目：IL-2Rα、REG3αとHGFの捕捉抗体とサンプルの調製およびELISAテストプレートコーティング<ol><li>分析される血漿アリコートサンプルを解凍し、プラズマからの上に底や脂質で血栓を分離するために10分間、12,000 rpmで遠心し、プルアップされます。未希釈血漿150μlをあらかじめ定義されたマップに従って手動ピペッティング（ソースプレート）を96ウェルV底プレートに各サンプルからメッキされます。アリコートをパラフィルムで包み、全体のプロセスの間に、4℃で湿潤チャンバー内に保持されます。もはやより72時間。 </li><li> IL-2RαおよびHGFの捕捉抗体が再構成し、メーカーの仕様および50μl当たり希釈後、密封し、4℃で一晩インキュベートして、それぞれ96ウェル高結合ハーフウェルプレートの各ウェル℃にメッキされされますまた、多くのプレートを37℃で乾燥し、℃、後で使用するために、依存して4℃で保存することができますタンパク質の安定性にる。 </li><li> REG3α捕捉抗体を密封し、4℃で一晩インキュベートし、384ウェルNuncマキシSORPプレートの各ウェル℃でめっきされるメーカーのコーティング緩衝液と25μlを用いて製造元のプロトコールに従って希釈化されることになります</li></ol> 2。実験1日目：IL-2RαELISA法（図1） <ol><li> IL-2Rαテストプレートを洗浄し、TBSでBLOTTOでブロックし、規格が再構成され、8点標準曲線は、メーカーのプロトコルごとに用意されています。 </li><li>ブロッキング工程の後にプレートを洗浄後、希釈していない血漿50μLをELISA試験板にソースプレートから複製でメッキされており、各標準液50μlを二重にメッキが施されている。プレートを300rpmに設定したプレート回転子に密封し、室温で2時間インキュベートする。 </li><li>プラズマは、IL-2RαELISA試験板から回収され、国連に戻されプラズマ源プレートを希釈した。 ELISAは、製造業者のプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 </li></ol> 3。実験1日目：REG3αELISA法（図1） <ol><li>未希釈血漿10μlを別のVボトムソースプレートに転送されます。メーカー提供の希釈緩衝液90μlを1:10希釈ソースプレートを作成するために、各ウェルに添加する。 </li><li> REG3αELISAは、製造業者のプロトコルごとに実行されます（ボリュームで384ウェルプレート用に調整）、各ウェルの光学濃度を450から620 nmに設定プレートリーダーを使用して読み込まれ、データが保存され、分析されます。 </li></ol> 4。実験1日目：捕獲抗体とエラフィンとTNFR1テストプレートコーティング<ol><li>エラフィンとTNFR1の捕捉抗体は、再構成およびDILになります製造元の仕様および50μl当たりutedを密封し、エラフィン室温で一晩インキュベートし、それぞれ96ウェル高結合ハーフウェルプレートの各ウェルに播種し、4°Cで一TNFR1のためでしょう。 </li></ol> 5。実験日1-2：HGF ELISA法（図1） <ol><li> IL-2RαELISAを完了し、試験を確保した後に繰り返される必要はありません、無希釈血漿60μlのは、新しいソースプレートに転送し、その後、1×PBS中1％BSAの60μlを作るために各ウェルに添加し、 1：02希釈したプラズマ源プレート。 </li><li> HGFの試験板は、洗浄後にTBSでBLOTTOでブロックし、規格が再構成されると8ポイントの検量線は、製造業者のプロトコルごとに用意されています。 </li><li>ブロッキング工程の後にプレートを洗浄した後、1:2希釈した血漿50μLをELISA試験板上に二重にメッキが施されており、各標準液50μlを二重にメッキが施されている。プレートは密封され、300RPMでセットプレートローテーター上で室温で一晩インキュベートした。 </li><li> 1：02希釈した血漿は、HGF ELISA試験板から埋め立てと1:2希釈したプラズマ源プレートに戻される。 ELISAは、製造業者のプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 </li></ol> 6。実験2日目：エラフィンELISA <ol><li>未希釈血漿10μlを新しいソースプレートに転送され、その後1×PBS中1％BSAを190μLのは、プラズマdluted 1:20の200μlを作るために各ウェルに追加されます。 </li><li>エラフィンELISAは、製造業者のプロトコル（ボリュームのハーフウェルプレート用に調整）に従って実施し、各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 </li></ol> 7。実験ダY 2：TNFR1 ELISA <ol><li> PBS中1％BSAを含む25μlの1時25希釈した血漿125μlのを得るために、1:20のソースプレート（現在午前1時20分血漿100μlを含む）に追加されます。 </li><li> TNFR1 ELISAは、製造業者のプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 </li></ol> 8。実験2日目：IL-8 ELISA <ol><li> 1：02希釈した血漿60μlのは、新しいソースプレートに移しし、その後、IL-8希釈液180μlを、1:6希釈したプラズマ源プレートを作るために各ウェルに添加する。 </li><li> IL-8 ELISAはメーカーのプロトコルごとに完了した（ハーフウェルプレートに合わせて調整ボリューム付）と各ウェルの吸光度を450から570 nmに設定プレートリーダーを用いて読み取ると、データが保存され、分析されます。 </li></ol>すべてのELISAは、unuseを完了したあとDストック血漿を解凍アリコートに交換し、将来の使用のために凍結されます。

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	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

<html>ここに提示され、順次、ELISA法を得ることが困難および/ ​​またはそのような稀な疾患またはマウス9,10から得られた血漿サンプルでのヒト被験者から採取したサンプルのようにかけがえのないかもしれないプラズマの小さなボリュームに複数の血漿タンパク質の測定が可能になる。シーケンシャルELISAは、一般的に希釈した血漿を必要とするELISA法で、増加血漿希釈係数の順序で実行されます。≥必要に応じてこれを行うことができますが、1時10分は、典型的には、再利用することする必要はない。シーケンシャルELISAを実行する能力がプラズマは他の試薬、または異なる希釈バッファはプラズマのため必要とされるために混合されているELISAキット/プロトコルによって制限されますが、これは、その互換性の懸念のために再利用するサンプルにablilityを排除バッファ/試薬は、特定のテストのパフォーマンスを妨害する可能性があります。綿密な計画と、10以上のELISAは同じ血漿試料に対して行ってもよい。 ENT &quot;&gt;個々の研究室では、被験者から採取したサンプル中の目的のタンパク質の予想される血漿中濃度に基づいて解釈可能な結果を​​得るために、血漿希釈液を調整する必要があります。実験装置の違いは、インキュベーション及び比色開発を最適化するために必要になることがあり回、洗浄の回数および/または任意の与えられたELISA法を最適化するために時間を浸し洗浄する。 高スループット能力と精度を向上させるために、費用対効果の高い方法で解析を実行するために、384ウェルプレート上で解析し、スタッキングユニットと自動プレート洗浄が可能なロボットのリキッドハンドリングプラットフォームの利用が推奨されています。この装置は、複数のユーザーによって実行された分析の正確さと精度を向上させ、間およびアッセイ内変動を低減するために分析の一貫性を提供するのに役立ちます。 我々は2つ​​の理由のために利用できる多重プラットフォーム上でシーケンシャルELISAを使用した：1）のほとんどは、新規タンパク質に対する抗体のペアは、簡単にビーズまたは他の材料と同様にかかり、高価で時間通りにコンジュゲートすることができない、2）個々のELISAアッセイは、交差反応性11の不在に二次多重マイクロアレイまたはビーズよりも正確です。信頼性の高い方法が多重、ビーズベースのマイクロアレイを行うために設立されている場合は、シーケンシャルのELISAプロセスを置き換えることができるかもしれませんが、ビーズに抗体をコンジュゲートする能力によって、および/またはであることが所望のタンパク質の数が制限される場合があり分析した。

急性移植片対宿主病（GVHD）、同種造血幹細胞移植（HSCT）後の非再発死亡率（NRM）の主要な原因は、3臓器系の機能不全によって測定される：皮膚、肝臓、消化管（GI）路4。急性GVHDは、通常2〜8週間、移植後に発生したが、後に発生する可能性があり、しばしばこのようなコンディショニングレジメンの毒性、感染症や薬の副作用などの他のポスト造血幹細胞移植の合併症から臨床的に区別することはできません。プロテオミクス戦略とシーケンシャルELISA法を用いた高スループット検証を使用することにより、我々はその濃度GVHDの臨床症状の発症時に上昇している6タンパク質を同定した。 IL-2Rα、TNFR1、4バイオマーカーパネルにまとめ、HGFおよびIL-8は、臨床症状の発症時GVHD診断できるとGVHDの重症度1の独立後の造血幹細胞の生存率を予測することができます。エラフィン、SKの移植片対宿主病（GVHD）のためのバイオマーカーには、このような薬疹など他の原因によるGVHDの発疹と発疹を区別することができ、移植の生存率2を予測することができます。我々は最近、下部消化管、最もNRMに関連付けられた標的臓器の移植片対宿主病（GVHD）のバイオマーカーとしてREG3α同定した。プラズマREG3α濃度は確実にポストHSCT下痢の原因として、GVHDを特定し、診断腸の生検に移植片対宿主病（GVHD）の組織学的重症度に相関させることができます。 GIの移植片対宿主病（GVHD）の発症時REG3α濃度もGVHDの治療とNRM 3への反応を予測することができます。臨床ケアにこれらの検証移植片対宿主病（GVHD）のバイオマーカーの取り込みは、現在臨床試験で検討されている。 これらの実験は、かけがえのないと数量限定となっており、GVHD発症時の2000年から2010年の間に造血幹細胞移植を受けた患者から採取した小さなプラズマアリコートで行った。これらのサンプルの貴重な自然のために、我々はMETを開発した過剰凍結融解サイクル、解凍時間と血漿の使用状況を解消するための効率的、再現可能な方法で、複数の血漿タンパク質濃度を測定hodで。この手法は、同じ試料上の関心のある複数のタンパク質/サイトカインのELISAを実行するために適用することができます（複数可）提供されたサンプルは、他の試薬と混合する必要はありません。 ELISAキットがプレコーティングされたプレート、96ウェルハーフウェルプレートまたは384ウェルプレートが付属していない場合は、さらにサンプル/試薬の使用を最小限に抑えるために使用することができます。本稿では、移植片対宿主病（GVHD）のバイオマーカーを測定することの技術的側面に焦点を当てています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ヒトIL-2、RアルファDuoset </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトHGF Duoset </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-8 OptEIA·KITⅡ </td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> AB-マッチASSEMBLY人間PAP1（REG3α）キット</td><td> MBLインターナショナル</td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> AB-マッチユニバーサルキット</td><td> MBLインターナショナル</td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td>人間sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td>人間Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R＆Dのサイ茎</td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルのポリスチレン円錐形の底板</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 249570 </td><td>プラズマ源プレートに使用</td></tr><tr><td>コスター半よく高結合96ウェルプレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3690 </td><td> IL-2Rα、HGF、TNFR1とエラフィンELISAのための</td></tr><tr><td>ヌンク384ウェルMaxiSorpプレート</td><td>ヌンク</td><td> 464718 </td><td> REG3αELISA用</td></tr><tr><td> Hyclone社リンは、1x、緩衝生理食塩水</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクションV、熱処理ショック</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> TBSでブロッカーBLOTTO </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 37530 </td><td> IL-2RαHGFおよびTNFR1 ELISAのためのブロッキング剤</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水</td><td>ギブコ</td><td> 21600-069 </td><td> IL-2Rα、HGF、エラフィンとTNFR1 ELISAのためのバッファを洗う</td></tr><tr><td> TMB過酸化水素Susbtrate </td><td> Kirkegaardとペリーラボラトリーズ</td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>アクロスオーガニック</td><td> 233362500 </td><td> IL-2Rα、HGF、エラフィンとTNFR1 ELISAのためのバッファを洗う</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 84720 </td><td> （2Nに希釈したもの）·ストップ·ソリューションのために</td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

公平ディスカバリープロテオミクス戦略は臨床現場での診断および予後のテストを改善することができ、治療的介入を導くのを助けることができる新たなバイオマーカーの大規模な番号を識別するために可能性を秘めている。候補タンパク質の大規模な番号が識別されると、それはそのような急性の発症として有限体積の、イベントドリブンとかけがえのない患者の血漿サンプルから、タイムリーかつ効率的な方法でバイオマーカー候補を検証することは困難である移植片対宿主病（GVHD）、同種造血幹細胞移植（HSCT）の潜在的に生命を脅かす合併症。 最小限にするために順番に、IL-2Rα5、TNFR1 6、HGF 7、IL-8の8、エラフィン2、REG3α3（またPAP1として知られている）：ここでは、6つの検証済みの移植片対宿主病（GVHD）のタンパク質を市販のELISAを行う処理を記述凍結融解サイクル、プラズマ時間と血漿の使用量を解凍した。最適なシーケンシャルELISAの性能を容易にするためのマイナーな調整とメーカーのELISAキットとプロトコルを使用して我々の研究室で確立されたサンプルの希釈率によって決定されるように、この手順のために私達は順番にELISAを行う。得られた血漿バイオマーカーの濃度は、患者コホート内の重要な発見のためにコンパイルして解析することができます。これらのバイオマーカーは、研究目的のために現在であるが、臨床ケアへの取り込みは、現在臨床試験で検討されている。 この手法は、同じ試料上の関心のある複数のタンパク質/サイトカインのELISAを実行するために適用することができます（複数可）提供されたサンプルは、他の試薬と混合する必要はありません。 ELISAキットがプレコーティングされたプレート、96ウェルハーフウェルプレートまたは384ウェルプレートが付属していない場合は、さらにサンプル/試薬の使用を最小限に抑えるために使用することができます。

<html>バイオマーカーのワークフローとタイムラインを、それぞれ表1、表2に詳述されている。完了すると、6つの異なったタンパク質の濃度は現在、プラズマの150μLの合計を使用して、同じ血漿試料に定量化されている。重複あたりのテストのサンプルをめっきするCVの10％未満が最適であることと、内部質保証が可能になります。複数のプレートでシーケンシャルELISAを行っている場合は、高い水準の一貫した光学濃度が好まれており、測定値の改善されたプレート間の信頼性を考慮し、標準曲線ODSは、ELISAの性能（ 図2）の矛盾のために査定探すためにプレートの間で比較することができます。 ODSは、我々の研究室で各バイオマーカーについて観察されたメチルベンジジン発色基質と高濃度を使用した開発時間を表3に記載されています。 tp_upload/4247/4247fig1.jpgの &quot;alt =&quot;図1 &quot;/&gt; 図1、IL-2Rα、REG3αとHGF ELISAのためのワークフロー。血漿サンプルは、IL-2RαELISA試験プレート上に播種された後、他のELISA用希釈ソースプレートを作るために再利用されます。 HGF ELISAのために、プラズマは、IL-8は1:6希釈プレートを準備するために再利用されます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">拡大図はこちらをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：初期REG3αGI GVHDのバイオマーカーのレポート3のためにテストされ1084人の患者に対応するREG3α濃度を測定する7種類のELISAプレートの標準曲線のための光学密度。プレート間の一貫したODSはプレート間の一貫性のタンパク濃度の測定を保証します。タンパク質の濃度血漿サンプル中の標準曲線光学濃度にサンプルの光学密度を比較することによって計算されます。 <table border="1"><tbody><tr><td> 実験0日目 </td><td> 1。サンプルを準備します</td></tr><tr><td></td><td> 2。 IL-2Rα、HGFとREG3αキャプチャアブ</td></tr><tr><td> 実験1日目 </td><td> 1。 IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2。 REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3。 HGF ELISA（サンプルメッキを介して） </td></tr><tr><td></td><td> 4。エラフィンおよびTNFRキャプチャアブ</td></tr><tr><td> 実験2日目 </td><td> 1。 HGF ELISAの完了</td></tr><tr><td></td><td> 2。エラフィンELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3。 TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4。 IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5。未使用の再凍結プラズマ</td></tr></tbody></table> 表1。GVHDバイオマーカーワークフローの概要<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 0日目 </td><td colspan="3"> 試料調製と一夜捕獲体のインキュベーション </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> エラフィン </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8の </td></tr><tr><td> 時間（hr） </td><td> 0.0 </td><td>ブロッキング</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td>メッキサンプル</td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td>検出AB;血漿試料を取り戻す</td><td>ブロッキング;準備サンプル（1:10希釈） </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td>メッキされたサンプル（1:10） </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td>ストレプトアビジン-H​​RP </td><td>検出抗体</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td>ストレプトアビジン-H​​RP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td>プレート読み取り</td><td> TMB </td><td>ブロッキング;準備サンプル（1:2希釈） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td>プレート読み取り</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td>メッキされたサンプル（1:2） </td><td>アブ（一晩のインキュベーション）をキャプチャ</td><td>アブ（一晩のインキュベーション）をキャプチャ</td><td></td></tr><tr><td> 2日目 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 時間（hr） </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td>プラズマ、検出Abを取り戻す</td><td>ブロッキング;準備サンプル（1:20） </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td>サンプルめっき（1:2） </td><td>ブロッキング; 1:25希釈1:20〜サンプルのさらなる希薄化を</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td>サンプルめっき（1:25） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td>プレート読み取り</td><td>検出抗体</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>サンプル（1:6希釈）を準備</td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>検出抗体</td><td>サンプルめっき（1:6） </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td>プレート読み取り</td&gt; <td> HRP </td><td>検出抗体</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>プレート読み取り</td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>プレート読み取り</td></tr><tr><td colspan="2"> 完成後 </td><td colspan="6">アリコートに原料血漿を交換して、後で使用するために凍結</td></tr></tbody></table> 表2。ELISAを行うためのタイムライン。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 血漿希釈率 </td><td> 高い標準濃度 </td><td> 基板開発時間（分） </td><td> 高いOD </td><td> 曲線 </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td>午前1時01分</td><td> 2000 pg / mlで</td><td> 5 </td><td> 1 </td><td>線形</td></tr><tr><td> HGF </td><td>午前1時02分</td><td> 4000 pg / mlで</td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4パラメータ</td></tr><tr><td> IL-8の</td><td> 1時06分</td><td> 200 pg / mlで</td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4パラメータ</td></tr><tr><td> REG3α </td><td>午前1時10分</td><td> 100 ng / mlの</td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4パラメータ</td></tr><tr><td>エラフィン</td><td> 1時20分</td><td> 2000 pg / mlで</td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4パラメータ</td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1時25 </td><td> 800 pg / mlで</td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td>線形</td></tr></tbody></table> 6 GVHDのバイオマーカーについては、 表3。ELISA法の詳細。

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

複数のバイオマーカー候補のハイスループットの検証は凍結/融解サイクルを最小限に抑え、貴重な血漿検体を使用するために、シーケンシャルELISA法により行うことができる。ここでは、連続して6つの異なる検証血漿バイオマーカーのELISAを実行する方法を示し<sup&gt; 1月3日</sup&gt;移植片対宿主病（GVHD）の<sup&gt; 4</sup&gt;同じ血漿試料に。

急性移植片対宿主病のバイオマーカーの検証のためのハイスループットシーケンシャルELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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15.7K ビュー.  University of Michigan. 複数のバイオマーカー候補のハイスループットの検証は凍結/融解サイクルを最小限に抑え、貴重な血漿検体を使用するために、シーケンシャルELISA法により行うことができる。ここでは、連続して6つの異なる検証血漿バイオマーカーのELISAを実行する方法を示し 1月3日移植片対宿主病（GVHD）の 4同じ血漿試料に。

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

医学

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

リモートハイスループット表現型解析のためのマウスの目の摘出

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

シーケンシャル<em&gt;インビボ</em&gt;骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

人間A53T変異αシヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳における強化ELISAによる疾患関連αシヌクレインの検出

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

一次多発性骨髄腫細胞の薬剤感受性の特徴付けのための器官のハイスループットシステム

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...