נתמך על ידי מענקי NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​הארטוול הקרן, וקרן הצדקה של דוריס הדיוק. ד&quot;ר Paczesny הוא חוקר של אריק הארטוול הקרן ותכנית מחקר Manasevit Strelzer איימי.

1. יום הניסוי 0: לדוגמא הכנה וציפוי פלייט מבחן ELISA עם נוגדן ללכידת IL-2Rα, REG3α וHGF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות aliquot פלזמה כדי להיות מנותח תהיינה משכה מופשרים, והסתובב במהירות 12,000 סיבובים לדקה למשך 10 דקות כדי להפריד את הקרישים בתחתית והשומנים על גבי מהפלזמה. 150 μl של פלזמה לא מדוללת יהיה מצופה מכל דגימה לצלחת גם 96-V-תחתונה (צלחת מקור) על ידי pipetting הידני על פי מפות מוגדרות מראש. את aliquots יהיה עטוף בparafilm ושמר בתא לח ב 4 מעלות צלזיוס במשך כל התהליך; לא יותר מ 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוגדנים ללכוד HGF IL-2Rα ויהיה מחדש ודילול לפי מפרט יצרן ו 50 μl יהיו מצופה בכל באר של צלחות 96-כן גבוה מחייב בהתאמה גם חצי אז שנאטמו ודגרו הלילה ב 4 ° C. לחלופין, צלחות רבות ניתן לייבש על 37 מעלות צלזיוס ומאוחסנות ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר, תלויing על יציבותו של החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן ללכוד REG3α ידולל על פי פרוטוקול יצרן באמצעות חיץ ציפוי יצרן ו25 μl יהיה מצופה בכל אחד גם מצלחת 384 גם Nunc מקסי Sorp אשר לאחר מכן נאטם ודגר הלילה ב 4 ° C. </li></ol> 2. יום ניסוי 1: IL-2Rα ELISA (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מבחן IL-2Rα היא שטפה, נחסמה במשתגע בכפות, וההתקן מחדש ועקומת סטנדרט 8-נקודה מוכנה לפרוטוקול יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הצלחת בעקבות צעד החסימה, 50 μl של פלזמה חייה הוא מצופה בשני עותקים מצלחת המקור לצלחת מבחן ELISA, ו 50 μl של כל התקן מצופה בשני עותקים. הצלחת היא חתומה ודגרה על 2 שעות בטמפרטורת חדר במסובב צלחת להגדיר ב 300 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלזמה היא קולחת מצלחת מבחן ELISA IL-2Rα והניחה חזרה באו&quot;םדילול צלחת מקור פלזמה. ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה ל450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 3. יום ניסוי 1: REG3α ELISA (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl של פלזמה חייה יועבר לצלחת מקור נפרדת V-תחתונה. 90 μl של חיץ דילול יצרן בתנאי שמתווסף לכל גם ליצור צלחת מקור דילול 1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> REG3α ELISA מתבצעת לפי פרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות 384 גם) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-620 ננומטר, והנתונים יישמרו ונותחו. </li></ol> 4. יום הניסוי 1: Elafin וציפוי פלייט מבחן TNFR1 עם נוגדן לכיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים ללכוד TNFR1 Elafin ויהיו משוחזרים ודילuted לפי מפרט יצרן ו 50 μl יהיה מצופה בכל באר של צלחות 96-כן גבוה מחייב בהתאמה גם חצי אז שנאטמו וטופחו במשך הלילה בטמפרטורת חדר למשך Elafin, ועל 4 מעלות צלזיוס במשך TNFR1. </li></ol> 5. ניסוי יום 1-2: HGF ELISA (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיימתי את IL-2Rα ELISA ומבטיח בדיקה לא יהיה צורך לחזור, 60 μl של פלזמה לא מדוללת יהיה מועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 60 μl של BSA 1% בx PBS 1 נוסף לכל גם לעשות צלחת 1:02 מדוללת פלזמת מקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מבחן HGF היא שטפה, נחסמה במשתגע בכפות, וההתקן מחדש ועקומת סטנדרט 8-נקודה מוכנה לפרוטוקול יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הצלחת בעקבות צעד החסימה, 50 μl של פלזמה מדוללת 01:02 הוא מצופה בשני עותקים על צלחת מבחן ELISA, ו 50 μl של כל התקן מצופה בשני עותקים. הצלחת היא חתומה ודגר לילה בטמפרטורת חדר במסובב צלחת להגדיר ב 300 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלזמה המדוללת 1:02 היא קולח מצלחת מבחן ELISA HGF והניחה חזרה בצלחת מקור הפלזמה המדוללת 1:2. ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה ל450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 6. יום הניסוי 2: Elafin ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl של פלזמה חייה יועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 190 μl של BSA 1% בx PBS 1 יתווסף לכל אחד גם לעשות 200 μl של 1:20 dluted פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elafin ELISA כפי שמתבצע על פי פרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן), והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 7. הניסוי דאy 2: TNFR1 ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl של BSA 1% בPBS יתווסף לצלחת המקור 01:20 (כרגע מכיל 100 μl של 1:20 פלזמה) כדי לקבל 125 μl של פלזמה מדוללת 1:25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TNFR1 ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> 8. יום הניסוי 2: IL-8 ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 μl של פלזמה מדוללת 01:02 יהיה מועבר לצלחת מקור חדשה ולאחר מכן 180 μl של IL-8 diluent נוסף לכל גם להפוך את צלחת מקור פלזמה מדוללת 01:06. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-8 ELISA יושלם לפרוטוקול יצרן (עם נפחים מותאמים לצלחות חצי כן) והצפיפות האופטית של כל גם תהיה לקרוא באמצעות קורא צלחת המוגדרת 450-570 ננומטר, ואת הנתונים שנשמרו ונותחו. </li></ol> ברגע שכל ELISAs כבר הושלם, unuseד מניית פלזמה תוחלף לaliquots הפשיר והוקפאה לשימוש עתידי.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> שיטת ELISA הרציפה מוצגת כאן מאפשרת מדידה של חלבוני פלזמה מרובות בנפחים קטנים של פלזמה שעשויה להיות קשה להשגה ו / או תחליף כגון דגימות מבני אדם עם מחל נדירות או דגימות פלזמה שהתקבלו בעכברי 9,10. את ELISAs הרציף מבוצעים בדרך כלל בצו של גורם דילול פלזמה גוברת, עם ELISAs דורש פלזמה מדוללת ≥ 1:10 בדרך כלל לא זקוק לשם תיקח, למרות שזה יכול להיעשות אם רוצה. היכולת לבצע ELISA סדרתית מוגבלת על ידי ערכות ELISA / פרוטוקולים שבפלזמה היא מעורבת עם חומרים כימיים אחרים או למאגרי שדילול שונים נדרשות לפלזמה, זה מונע ablility לדגימה מחדש להשתמש בשל חששות שאינם תואמים חיץ / מגיב יפריע לביצועים של בדיקה מסוימת. עם תכנון קפדני, 10 או יותר ELISAs יכול להיות מבוצע באותה דגימת פלזמה. ent &quot;&gt; מעבדות בודדות הנדרשות להסתגל דילולי פלזמה על מנת שתהיינה תוצאות לפירוש המבוססות על ריכוזי פלזמה צפויות של החלבון של עניין בדגימות מהנבדקים. הבדלים בציוד מעבדה עלולה לגרום לצורך לייעל את הדגירה והתפתחות colorimetric פעמים, מספר הכביסות ו / או לשטוף לספוג פעמים על מנת לייעל את כל ELISA נתון. כדי להגדיל את כושר תפוקה גבוהה ודיוק ולבצע ניתוחים באופן יעיל וחסכוני, השימוש בפלטפורמה רובוטית טיפול נוזל מסוגלת לבצע ניתוחים על 384 גם צלחות ומכונת כביסת צלחת אוטומטית עם יחידה לערום מומלץ. ציוד זה יכול להגביר את הדיוק והדיוק של ניתוח שבוצע על ידי משתמשים מרובים, ויעזור לספק עקביות של ניתוח כדי להפחית ובין שונות התוך assay. אנחנו השתמשנו ELISA הרציף על גבי פלטפורמות זמינות זמנית משתי סיבות: 1) רובזוגות נוגדנים לחלבונים חדשים לא יכולים בקלות להיות מצומדת בחרוזים או חומר אחר, כמו גם זמן רב ויקרים: 2) מבחני ELISA בודדים הם מדויקים יותר מאשר microarray זמנית או חרוזים, משני להעדר תגובה צולבת 11. אם שיטה אמינה הוא הוקם כדי לבצע microarrays multiplexed, חרוז מבוסס, זה עשוי להיות מסוגל להחליף את תהליך ELISA הרציף, אך הוא עשוי להיות מוגבל על ידי היכולת להטות את הנוגדנים לחרוזים ו / או במספר החלבונים הרצויים להיות מנותח.

מחלה אקוטית שתל נגד מארח (GVHD), גורם מוביל לתמותה שאינה הישנות (NRM) לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT), נמדדת על ידי חוסר תפקוד בשלוש מערכות איברים: העור, בכבד ובמערכת עיכול (GI) מערכה 4. GVHD האקוטי מתרחש בדרך כלל בין שניים לשמונה שבועות לאחר השתלה, אך עלול להתרחש מאוחר יותר, ולעתים קרובות הוא קליני נבדל מסיבוכים שלאחר HSCT אחרים כגון רעילות מיזוג משטר, זיהום או תופעות לוואי של תרופות. באמצעות השימוש באסטרטגיות proteomic ואימות תפוקה גבוהה באמצעות ELISA הרציף, זיהו 6 חלבונים שריכוזים הם גבוהים בתחילת ביטויים קליניים של GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF ו IL-8, כאשר הוא משולב לתוך לוח 4-סמן ביולוגי יכול לאבחן GVHD בהופעת תסמינים קליניים ויכול לחזות הישרדות לאחר HSCT עצמאי של חומרת GVHD 1. Elafin, סמן ביולוגי לGVHD של skב, יכול להפלות בין הפריחה והפריחה GVHD מגורמים אחרים כגון התפרצויות סמים ויכול לחזות הישרדות השתלה 2. אנו זיהינו לאחרונה REG3α כמו סמן של GVHD של מערכת העיכול התחתונה, איבר המטרה הכי קשור NRM. ריכוז REG3α פלזמה אמין ניתן לזהות GVHD כסיבה לשלשולים לאחר HSCT ולתאם את החומרה היסטולוגית של GVHD בביופסיות מעי אבחון. ריכוזי REG3α בתחילת GVHD עיכול יכולים גם לחזות את ההיענות לטיפול וGVHD NRM 3. שילוב של הסמנים ביולוגיים GVHD האלה תקפים לטיפול קליני כעת נחקר בניסויים קליניים. ניסויים אלה בוצעו על aliquots פלזמה הקטנה שנאסף מהחולים שקבלו HSCT בין שנתי 2000 ו 2010 בזמן הופעת GVHD שהם חסרי תחליף וכמות מוגבלת. בשל האופי היקר של דגימות אלה, פתחו נפגשהוד של מדידת ריכוזי חלבוני פלזמה מרובים בצורה יעילה, לשעתק לחסל מחזורים עודפים הקפאת הפשרה, בזמן הפשרה ושימוש בפלזמה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים. כתב יד זה מתמקד בהיבטים הטכנולוגיים של מדידת סמנים ביולוגיים GVHD.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אדם IL-2 R אלפא Duoset </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> האדם HGF Duoset </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> IL-8 אדם OptEIA KIT השני </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-התאמת ההרכבה האנושית PAP1 (REG3α) ערכה </td><td> MBL הבינלאומי </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-התאמת UNIVERSAL קיט </td><td> MBL הבינלאומי </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> אדם sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> אדם Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> מו&quot;פ סאיםנובע </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-גם צלחות תחתונות חרוטי קלקר </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> משמש לצלחות מקור פלזמה </td></tr><tr><td> כוכב משנה חצי גם גבוהה מחייבות צלחות 96-כן </td><td> קורנינג </td><td> 3690 </td><td> לIL-2Rα, HGF, TNFR1 וelafin ELISAs </td></tr><tr><td> Nunc צלחות MaxiSorp 384 גם </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> לREG3α אליסה </td></tr><tr><td> HyClone נאגר מלוח פוספט, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין, Fraction V, הלם טיפול בחום </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> החוסם משתגע בTBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> סוכן חסימה לIL-2Rα HGF וTNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> Dulbecco שלפוספט נאגר מלוח </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> לשטוף חיץ לIL-2Rα, HGF, Elafin וTNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> Susbtrate החמצן TMB </td><td> Kirkegaard ומעבדות פרי </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> אורגניקס acros </td><td> 233362500 </td><td> לשטוף חיץ לIL-2Rα, HGF, Elafin וTNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 84720 </td><td> (דילול ל2N) ללהפסיק פתרון </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

אסטרטגיות proteomics גילוי משוחדות יש פוטנציאל לזהות מספר גדול של סמנים ביולוגיים חדשניים שיכול לשפר את בדיקות אבחון ופרוגנוזה בסביבה קלינית ועשויים לעזור התערבויות מדריך טיפוליות. כאשר מספר גדול של חלבוני מועמד מזוהה, זה עלול להיות קשה כדי לאמת סמנים ביולוגיים מועמדים באופנה בזמן ויעיל מדגימות מטופל פלזמה המונעות אירוע, נפח סופי ואין לו תחליף, כגון בתחילה חריף שתל נגד מחל מארח (GVHD), סיבוך מסכן חיים של השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית (HSCT). כאן אנו מתארים תהליך של ביצוע ELISAs הזמין מסחרי במשך שישה חלבונים GVHD תקף: IL-2Rα 5, TNFR1 6, 7 HGF, IL-8 8, elafin 2, וREG3α 3 (הידוע גם בPAP1), באופן רציף כדי למזער מחזורי הקפאת הפשרה, מופשר זמן פלזמה ושימוש בפלזמה. לביצוע הליך זה אנו מבצעים את ELISAs בסדר רציף, כפי שנקבעו על ידי גורם דילול מדגם כפי שנקבע במעבדה שלנו באמצעות ערכות ופרוטוקולי יצרן ELISA עם התאמות קלות כדי להקל על ביצועי ELISA רציפים אופטימליים. ריכוזי פלזמת הסמן הביולוגיים הנובעים אז ניתן להדר ונותחו לממצאים משמעותיים בתוך קבוצת מטופל. בעוד סמנים אלה הם כיום למטרות מחקר בלבד, שילובם בטיפול קליני כרגע נחקר בניסויים קליניים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לביצוע ELISAs לחלבונים / ציטוקינים עניין מרובים באותה הדוגמא (ו) ספקה את הדגימות לא צריכה להיות מעורב עם חומרים כימיים אחרים. אם ערכות ELISA לא באות עם צלחות מראש מצופות, צלחות 96-כן כן חצי או צלחות 384 גם יכול לשמש נוסף למזער שימוש בדגימות / חומרים כימיים.

<html> עבודת הסמנים הביולוגיות וציר הזמן מפורטת בטבלת 1 וטבלה 2, בהתאמה. לאחר השלים, ריכוזים של 6 חלבונים שונים יש כעת לכמת באותו מדגם הפלזמה באמצעות סך של 150 μL של פלזמה. ציפוי הדגימות בכפילות למבחן מאפשר להבטחת איכות הפנימית, עם פחות מ 10% של קורות החיים למצב אופטימליים. אם ביצוע ELISA הרציף על צלחות מרובות, צפיפות אופטית עקבית של הרמה הגבוהה והם העדיפו לאפשר לאמינות משופרת בין צלחת של מדידות, עקומת מכנסי הש&quot;כ סטנדרטיים ניתן להשוות בין הצלחות להסתכל להעריך לחוסר עקביות בביצועי ELISA (איור 2). זמני פיתוח באמצעות מצע colorimetric tetramethylbenzidine וריכוז מכנסי הש&quot;כ גבוהים נצפו עבור כל סמן ביולוגי במעבדה שלנו מופיעים בלוח 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; איור 1 &quot;/&gt; איור 1. זרימת עבודה לIL-2Rα, REG3α וHGF ELISAs. לאחר שדגימות הפלזמה היו מצופית על צלחות בדיקת ELISA IL-2Rα הוא קולח לעשות צלחות מקור לדילול ELISAs אחר. לHGF ELISA, הפלזמה היא קולח להכין צלחת הדילול 01:06 לIL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. צפיפות אופטית לעקומה הסטנדרטית של 7 צלחות שונות ELISA מדידת ריכוזים מתאימים ל1084 החולים שנבדקו לדו&quot;ח הראשוני REG3α GI GVHD סמן 3 REG3α. מכנסי הש&quot;כ עקביים בין הצלחות להבטיח מדידות ריכוז חלבון עקביות בין צלחות. ריכוזים של חלבוניםבפלזמת דגימות מחושבות על ידי השוואה לדוגמה צפיפויות אופטיות לצפיפות האופטית עקומת הסטנדרט. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יום הניסוי 0 </td><td> 1. הכן את הדגימות </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF וREG3α הלכידה Ab </td></tr><tr><td> יום ניסוי 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (באמצעות ציפוי מדגם) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin וTNFR הלכידה Ab </td></tr><tr><td> יום הניסוי 2 </td><td> 1. השלמת HGF ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Refreeze שאינו בשימושפלזמה </td></tr></tbody></table> טבלת 1. סקירת זרימת סמנים ביולוגי GVHD <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> יום 0 </td><td colspan="3"> הכנת דוגמאות ודגירת גוף לכידת הלילה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> זמן (שעות) </td><td> 0.0 </td><td> חסימה </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> דגימות המצופות </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> טיב דגימות פלזמה; האיתור Ab </td><td> דוגמאות כן (1:10 דילול); חסימה </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> דגימות מצופות (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> האיתור Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> קריאת פלייט </td><td> TMB </td><td> דגימות כן (1:2 דילול); חסימה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> קריאת פלייט </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> דגימות מצופות (1:2) </td><td> צלם Ab (דגירת הלילה) </td><td> צלם Ab (דגירת הלילה) </td><td></td></tr><tr><td> יום 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זמן (שעות) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> טיב פלזמה, האיתור Ab </td><td> דגימות כן (1:20); חסימה </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> ציפוי לדוגמה (1:2) </td><td> חסימה; דילול נוסף של 1:20 דגימות לדילול 1:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> ציפוי לדוגמה (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td><td> האיתור Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> הכן דגימות (01:06 דילול) </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> האיתור Ab </td><td> ציפוי לדוגמה (1:06) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td&gt; <td> HRP </td><td> האיתור Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> קריאת פלייט </td></tr><tr><td colspan="2"> לאחר השלים </td><td colspan="6"> החלף פלזמת מקור לaliquots ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר </td></tr></tbody></table> טבלת 2. ציר זמן לביצוע ELISAs. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> גורם דילול פלזמה </td><td> ריכוז גבוה סטנדרטי </td><td> זמן פיתוח תשתית (דקות) </td><td> הגבוה OD </td><td> עקומה </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> קווים </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4-פרמטר </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> קווים </td></tr></tbody></table> לוח 3. פרטי ELISA ל6 סמני GVHD.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

אימות תפוקה גבוהה של סמנים ביולוגיים מועמדים מרובים יכולה להתבצע על ידי ELISA הרציף במטרה למזער מחזורי הקפאה / פשרה ושימוש בדגימות פלזמה יקרות. הנה, אנחנו מדגימים איך לבצע רצף ELISAs במשך שישה סמני פלזמת תוקף שונים<sup&gt; 1-3</sup&gt; למחלת שתל נגד מארח (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; באותו מדגם הפלזמה.

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

high-throughput-sequential-elisa-for-validation-biomarkers-acute

Research

JoVE Journal

Medicine

15.7K Views.  University of Michigan. אימות תפוקה גבוהה של סמנים ביולוגיים מועמדים מרובים יכולה להתבצע על ידי ELISA הרציף במטרה למזער מחזורי הקפאה / פשרה ושימוש בדגימות פלזמה יקרות. הנה, אנחנו מדגימים איך לבצע רצף ELISAs במשך שישה סמני פלזמת תוקף שונים 1-3 למחלת שתל נגד מארח (GVHD) 4 באותו מד?...

Video: High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...