Apoyado por el NIH subvenciones RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​la Fundación Hartwell, y la Fundación Caritativa Doris Duke. Dr. Paczesny es un investigador del fondo Eric Hartwell y el Programa de Investigación Amy Strelzer Manasevit.

1. Experimento Día 0: Preparación de muestras y Recubrimiento ELISA Prueba de Placa con anticuerpos de captura para la IL-2Rα, REG3α y HGF <ol><li> Las muestras de plasma alícuotas a ser analizados se sacó, se descongeló y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min para separar los coágulos en la parte inferior y en la parte superior de los lípidos del plasma. 150 l de plasma sin diluir se sembraron a partir de cada muestra en un 96-así placa con fondo en V (placa de fuente) por pipeteado manual de acuerdo con mapas predefinidos. Las alícuotas se envuelve en Parafilm y se mantuvo en una cámara húmeda a 4 ° C durante todo el proceso; hr no más de 72. </li><li> IL-2Rα y anticuerpos de captura de HGF se reconstituye y se diluye según las especificaciones del fabricante y l 50 se sembraron en cada pocillo de 96 respectivos pocillos de alta unión media y placas que se sellan y se incuban durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, muchas placas se pueden secar a 37 ° C y se almacenó a 4 ° C para su uso posterior, dependenING sobre la estabilidad de la proteína. </li><li> Anticuerpo de captura REG3α se diluyó de acuerdo con el protocolo del fabricante usando tampón fabricante del revestimiento y 25 l se colocaron en placas en cada pocillo de un 384-así Nunc Maxi-sor placa que luego se sella y se incubaron durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 2. Experimento Día 1: IL-2Rα ELISA (Figura 1) <ol><li> La placa de ensayo de IL-2Rα se lavaron, se bloquearon con BLOTTO en TBS, y el estándar reconstituido y una curva estándar de 8-punto se prepara según el protocolo del fabricante. </li><li> Después de lavar la placa después de la etapa de bloqueo, 50 l de plasma sin diluir se sembraron por duplicado de la placa de fuente a la placa de ensayo ELISA, y 50 l de cada estándar se sembraron por duplicado. La placa se sella y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un mezclador de placas ajustado a 300 rpm. </li><li> El plasma se recupera de la placa de ensayo de IL-2Rα ELISA y se coloca de nuevo en la ONUdiluido placa plasma fuente. El ELISA se completa por el protocolo del fabricante (con volúmenes ajustados por medio-y placas) y la densidad óptica de cada pocillo se lee mediante un lector de placas de conjunto a 450-570 nm, y los datos guardados y analizados. </li></ol> 3. Experimento Día 1: REG3α ELISA (Figura 1) <ol><li> 10 l de plasma no diluido se transfirió a una placa de fuente separada con fondo en V. 90 l de fabricante proporcionado por el tampón de dilución se añadió a cada pocillo para crear una placa de dilución 1:10 fuente. </li><li> El ELISA REG3α se realizó según el protocolo del fabricante (con volúmenes ajustado para 384-y placas) y la densidad óptica de cada pocillo se lee mediante un lector de placas ajustado a 450-620 nm, y los datos se guardan y analizan. </li></ol> 4. Experimento Día 1: Prueba de TNFR1 elafin y revestimiento de placas con anticuerpo de captura <ol><li> Elafin y los anticuerpos de captura TNFR1 será reconstituido y diluidobuido por las especificaciones del fabricante y l 50 se sembraron en cada pocillo de 96 respectivos pocillos de alta unión media y placas que se sellan y se incuban durante la noche a temperatura ambiente durante elafin, y a 4 º C para TNFR1. </li></ol> 5. Experimento Día 1-2: HGF ELISA (Figura 1) <ol><li> Después de completar el ELISA de IL-2Rα y asegurando el ensayo no es necesario que se repita, 60 l de plasma sin diluir se transfiere a una placa nueva fuente y, a continuación 60 l de BSA al 1% en 1 x PBS, se añade a cada pocillo para hacer una 01:02 plasma diluido placa fuente. </li><li> La placa de ensayo HGF se lavaron, se bloquearon con BLOTTO en TBS, y el estándar reconstituido y una curva estándar de 8-punto se prepara según el protocolo del fabricante. </li><li> Después de lavar la placa después de la etapa de bloqueo, 50 l de 1:2 de plasma diluido se sembraron por duplicado en la placa de ensayo ELISA, y 50 l de cada estándar se sembraron por duplicado. La placa se sella y seincubaron durante la noche a temperatura ambiente en un mezclador de placas ajustado a 300 rpm. </li><li> El plasma diluido 1:02 se recupera de la placa de prueba HGF ELISA y se coloca de nuevo en la placa de 1:02 diluido fuente de plasma. El ELISA se completa por el protocolo del fabricante (con volúmenes ajustados por medio-y placas) y la densidad óptica de cada pocillo se lee mediante un lector de placas de conjunto a 450-570 nm, y los datos guardados y analizados. </li></ol> 6. Experimento Día 2: elafin ELISA <ol><li> 10 l de plasma sin diluir se transfiere a una placa nueva fuente y luego 190 l de BSA al 1% en 1 x PBS se añadieron a cada pocillo para hacer 200 l de plasma 1:20 dluted. </li><li> El ELISA elafin como se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (con volúmenes ajustado por medio pocillos), y la densidad óptica de cada pocillo se lee mediante un lector de placas ajustado a 450-570 nm, y los datos guardados y analizados. </li></ol> 7. Experimento Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 l de 1% de BSA en PBS se añadió a la placa de fuente de 1:20 (que ahora contiene 100 l de plasma 1:20) para obtener 125 l de plasma diluido 1:25. </li><li> El ELISA TNFR1 se completa por el protocolo del fabricante (con volúmenes ajustados por medio-y placas) y la densidad óptica de cada pocillo se lee mediante un lector de placas ajustado a 450-570 nm, y los datos guardados y analizados. </li></ol> 8. Experimento Día 2: IL-8 ELISA <ol><li> 60 l de 1:2 de plasma diluido se transfirió a una placa nueva fuente y luego 180 l de IL-8 diluyente se añade a cada pocillo para hacer una placa de 1:06 diluido fuente de plasma. </li><li> La IL-8 ELISA se completa por el protocolo del fabricante (con volúmenes ajustados por medio-y placas) y la densidad óptica de cada pocillo se lee mediante un lector de placas ajustado a 450-570 nm, y los datos guardados y analizados. </li></ol> Una vez que todos los ELISA se ha completado, unused stock de plasma se sustituye en las alícuotas descongeladas y congelado para uso futuro.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<html> El método secuencial ELISA que aquí se presenta permite la medición de las proteínas plasmáticas en múltiples pequeños volúmenes de plasma que pueden ser difíciles de obtener y / o irremplazables tales como muestras de sujetos humanos con enfermedades raras o muestras de plasma obtenidas de ratones 9,10. Los ELISAs secuenciales se realizan típicamente en el orden del factor de aumento de dilución de plasma, con ELISAs requieren plasma diluido 1:10 ≥ típicamente no pueda ser recuperado, aunque esto puede hacerse si se desea. La capacidad de realizar secuencial ELISA está limitada por kits de ELISA / protocolos en los que se mezcla el plasma con otros reactivos o para el que diferentes tampones de dilución se requieren para el plasma, lo que se opone a la ablility volver a utilizar una muestra debido a preocupaciones de que una incompatibles tampón / reactivo interfiere con la realización de una prueba particular. Con una planificación cuidadosa, 10 o más pruebas ELISA puede realizarse de la misma muestra de plasma. Ent &quot;&gt; laboratorios individuales pueden necesitar ajustar diluciones de plasma con el fin de tener resultados interpretables en base a las concentraciones plasmáticas esperadas de la proteína de interés en las muestras de los sujetos de prueba. Las diferencias en equipos de laboratorio puede resultar en la necesidad de optimizar la incubación y el desarrollo colorimétrico veces, el número de lavados y / o lavar tiempos de inmersión con el fin de optimizar cualquier dado ELISA. Para aumentar la capacidad de alto rendimiento y precisión y para realizar análisis de una manera rentable, el uso de una plataforma de manipulación robótica líquido capaz de análisis en placas de 384 pocillos y un lavador de placas automatizado con unidad de apilamiento se recomiendan. Este equipo puede aumentar la exactitud y precisión del análisis realizado por múltiples usuarios, y ayudar a garantizar la coherencia de análisis para reducir inter-e intra-ensayo de variación. Se utilizó ELISA secuencial sobre plataformas múltiplex disponibles, por dos razones: 1) La mayoría de laspares de anticuerpos para proteínas nuevas no puede fácilmente ser conjugados en perlas o de otros materiales, así como tiempo y es costoso, 2) individuales de los ensayos ELISA son más precisos que los microarrays multiplex o perlas, secundaria a una ausencia de reactividad cruzada 11. Si un método fiable se establece para realizar multiplexados, basado en perlas microarrays, puede ser capaz de reemplazar el proceso secuencial de ELISA, pero puede estar limitado por la capacidad para conjugar los anticuerpos a perlas y / o por el número de proteínas deseadas a ser analizado.

Aguda de injerto contra huésped (EICH), una de las principales causas de mortalidad sin recaídas (NRM) después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH), se mide por la disfunción en tres sistemas orgánicos: la piel, el hígado y tracto gastrointestinal (GI) tracto 4. La EICH aguda se produce normalmente entre dos y ocho semanas después del trasplante, pero puede ocurrir más tarde, y con frecuencia es clínicamente indistinguible de otras complicaciones post-TPH como la toxicidad acondicionado régimen, infección o efectos secundarios de la medicación. Mediante el uso de las estrategias proteómicas y validación de alto rendimiento utilizando secuencial ELISA, se han identificado 6 proteínas cuyas concentraciones son elevadas en la aparición de las manifestaciones clínicas de la GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF y IL 8-, cuando se combinan en un panel de 4-biomarcador puede diagnosticar la GVHD en el inicio de los síntomas clínicos y puede predecir la supervivencia después de un TCMH independientemente de la gravedad de GVHD 1. Elafin, un biomarcador de GVHD de la skin, puede discriminar entre erupción y erupción GVHD por otras causas, tales como erupciones medicamentosas y puede predecir la supervivencia del trasplante 2. Recientemente hemos identificado REG3α como un biomarcador de la EICH del tracto gastrointestinal inferior, el órgano diana que más se asocia con el MRN. La concentración plasmática de REG3α puede identificar con fiabilidad la EICH como la causa de la diarrea post-TPH y se correlacionan con la severidad histológica de la GVHD en diagnóstico biopsias intestinales. Concentraciones REG3α en GI inicio GVHD también puede predecir la respuesta al tratamiento y manejo de recursos naturales GVHD 3. La incorporación de estos biomarcadores validados GVHD en la atención clínica está siendo investigado actualmente en ensayos clínicos. Estos experimentos se realizaron en alícuotas de plasma pequeñas tomadas de pacientes que recibieron TPH entre 2000 y 2010 en el momento de inicio de GVHD que son insustituibles y de cantidad limitada. Debido a la naturaleza valiosa de estas muestras, se ha desarrollado un metHod de medición de múltiples concentraciones de proteínas plasmáticas de una manera eficiente y reproducible para eliminar el exceso de congelación y descongelación, el tiempo de descongelación y el uso de plasma. Esta técnica se puede aplicar para llevar a cabo pruebas ELISA para múltiples proteínas / citoquinas de interés en la misma muestra (s) siempre que las muestras no necesitan ser mezclados con otros reactivos. Si kits de ELISA no vienen con pre-recubiertos con placas, placas de 96 pocillos medio pocillos o placas de 384-y se puede utilizar para minimizar aún más el uso de muestras / reactivos. Este manuscrito se centra en los aspectos tecnológicos de la medición de biomarcadores GVHD.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> IL-2 humana alfa R Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> HGF humano Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> IL-8 humana OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match ASAMBLEA Humanos PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Human Duoset sTNFRI/TNFRSF1A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Human Duoset Trappin-2/Elafin </td><td> De I + D Syderiva </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-y placas de poliestireno de fondo cónico </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Utilizado para las placas de la fuente de plasma </td></tr><tr><td> Costar media y alta unión a placas de 96 pocillos </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Para IL-2Rα, HGF, TNFR1 y ELISA elafin </td></tr><tr><td> Nunc 384-y placas MaxiSorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Para REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino, Fracción V, Shock tratados térmicamente </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Bloqueador BLOTTO en TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Agente de bloqueo de la IL-2Rα HGF y ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> DulbeccoPhosphate-Buffered Saline </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> El tampón de lavado para IL-2Rα, HGF, elafin y ELISA TNFR1 </td></tr><tr><td> Susbtrate peróxido TMB </td><td> Kirkegaard y Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> El tampón de lavado para IL-2Rα, HGF, elafin y ELISA TNFR1 </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Diluido a 2 N) para la solución de parada </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Recomendaciones proteómica estrategias de descubrimiento tiene el potencial de identificar un gran número de nuevos biomarcadores que pueden mejorar las pruebas de diagnóstico y pronóstico en un entorno clínico y puede ayudar a dirigir intervenciones terapéuticas. Cuando grandes cantidades de las proteínas candidatas se identifican, puede ser difícil validar biomarcadores candidatos de una manera oportuna y eficiente a partir de muestras de plasma de pacientes que están controladas por evento, de volumen finito e irremplazable, como en el inicio de aguda de injerto contra huésped (EICH) es una complicación potencialmente mortal de alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH). Aquí se describe el proceso de realización de pruebas ELISA disponibles comercialmente para seis proteínas validados GVHD: IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, y REG3α 3 (también conocido como PAP1) de una manera secuencial para minimizar ciclos de congelación-descongelación, Se descongeló plasma, tiempo y uso de plasma. Para este procedimiento se lleve a cabo los ensayos ELISA en orden secuencial según lo determinado por el factor de dilución de la muestra según lo establecido en nuestro laboratorio utilizando kits de ELISA fabricante y protocolos con ajustes menores para facilitar un rendimiento óptimo secuencial ELISA. Las concentraciones plasmáticas resultantes de biomarcadores puede ser recopilada y analizada por los hallazgos significativos dentro de una cohorte de pacientes. Si bien estos biomarcadores son actualmente para fines de investigación, su incorporación a la atención clínica está siendo investigado actualmente en ensayos clínicos. Esta técnica se puede aplicar para llevar a cabo pruebas ELISA para múltiples proteínas / citoquinas de interés en la misma muestra (s) siempre que las muestras no necesitan ser mezclados con otros reactivos. Si kits de ELISA no vienen con pre-recubiertos con placas, placas de 96 pocillos medio pocillos o placas de 384-y se puede utilizar para minimizar aún más el uso de muestras / reactivos.

<html> El flujo de trabajo de biomarcadores y el calendario se detallan en la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente. Una vez completado, las concentraciones de 6 proteínas diferentes han sido cuantificados en la misma muestra de plasma utilizando un total de 150 l de plasma. Enchapado las muestras por duplicado por prueba permite garantizar la calidad interna, con menos de 10 CV% es óptima. Si se realiza la secuencial ELISA en placas múltiples, consistentes densidades ópticas de la alta calidad se prefieren y permitir una mejor inter-placa de fiabilidad de las mediciones; estándar ODs curva pueden ser comparados entre las placas de mirar para evaluar el rendimiento inconsistencia en ELISA (Figura 2). Los tiempos de desarrollo utilizando sustrato colorimétrico tetrametilbencidina y alta concentración de OD observados para cada biomarcador en nuestro laboratorio se enumeran en la Tabla 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Flujo de trabajo para la IL-2Rα, REG3α y ELISA HGF. Después de las muestras de plasma se han sembraron en las placas de la prueba de ELISA IL-2Rα de ser reclamado para hacer placas de dilución de origen para otras pruebas ELISA. Para el ELISA HGF, el plasma sea reclamado para preparar la placa de dilución 1:6 para IL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para agrandar la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Densidades ópticas para la curva estándar de 7 diferentes placas de ELISA que miden concentraciones REG3α correspondientes a los 1084 pacientes ensayados para el informe inicial REG3α biomarcador GI GVHD 3. Consistente SAO entre placas asegurar consistentes mediciones de la concentración de proteína entre las placas. Las concentraciones de proteínasen muestras de plasma se calculan comparando las densidades ópticas de la muestra a las densidades ópticas de la curva estándar. <table border="1"><tbody><tr><td> Experimento Día 0 </td><td> 1. Preparar las muestras </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF y REG3α captura Ab </td></tr><tr><td> Experimento Día 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (a través de placas de muestra) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin y TNFR captura Ab </td></tr><tr><td> Experimento Día 2 </td><td> 1. HGF ELISA terminación </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Volver a congelar sin usarplasma </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Biomarcador GVHD flujo de trabajo general <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Día 0 </td><td colspan="3"> Preparación de la muestra y la incubación durante la noche de captura cuerpo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Tiempo (h) </td><td> 0,0 </td><td> Bloqueo </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Las muestras PLATEADO </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclamar muestras de plasma, detección Ab </td><td> El bloqueo de las muestras; Preparar la dilución (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> Las muestras chapadas (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Estreptavidina-HRP </td><td> Detección Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Estreptavidina-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> De lectura de placas </td><td> TMB </td><td> El bloqueo de las muestras; Preparar la dilución (1:2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> De lectura de placas </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> Las muestras chapadas (1:2) </td><td> Captura Ab (incubación durante la noche) </td><td> Captura Ab (incubación durante la noche) </td><td></td></tr><tr><td> Día 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tiempo (h) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclamar plasma, detección Ab </td><td> El bloqueo de las muestras; Preparar (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Ejemplo de chapado (1:2) </td><td> Bloqueo; otra dilución 1:20 de las muestras de la dilución 1:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Ejemplo de chapado (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> De lectura de placas </td><td> Detección Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Preparar las muestras de dilución (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Detección Ab </td><td> Ejemplo de chapado (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> De lectura de placas </td&gt; <td> HRP </td><td> Detección Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> De lectura de placas </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Placa de lectura </td></tr><tr><td colspan="2"> Después de la terminación </td><td colspan="6"> Vuelva a colocar la fuente de plasma en alícuotas y se congelan para su uso posterior </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Cronograma para la realización de pruebas ELISA. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Factor de dilución </td><td> Concentración Estándar Alto </td><td> Substrato Tiempo de Desarrollo (min.) </td><td> Alta OD </td><td> Curva </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2.000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Lineal </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4.000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-parámetro </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-parámetro </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-parámetro </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1:20 </td><td> 2.000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-parámetro </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Lineal </td></tr></tbody></table> Tabla 3. ELISA Detalles para 6 Biomarcadores EICH.

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Validación de alto rendimiento de candidatos a biomarcadores múltiples pueden ser realizadas por ELISA secuencial con el fin de minimizar ciclos descongelación / congelación y el uso de muestras de plasma preciosos. Aquí nos muestran cómo realizar secuencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores plasmáticos validados<sup&gt; 1-3</sup&gt; De la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; En la misma muestra de plasma.

Alto rendimiento secuencial ELISA para la Validación de Biomarcadores de aguda injerto contra huésped

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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Research

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Medicine

15.7K vistas.  University of Michigan. Validación de alto rendimiento de candidatos a biomarcadores múltiples pueden ser realizadas por ELISA secuencial con el fin de minimizar ciclos descongelación / congelación y el uso de muestras de plasma preciosos. Aquí nos muestran cómo realizar secuencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores plasmáticos validados 1-3 De la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) 4 En la misma muestra de plasma.

Video: High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Investigación

Medicina

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Ratón enucleación del ojo por remoto de alto rendimiento fenotipificación

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...