説明する作業は、国立がん研究所から受賞番号U54CA143876介して微小環境＆転移にコーネルセンターによってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。この作品は、さらに国立科学財団大学院研究フェローシップ（ADH）によって一部で賄われていた。

次のプロトコルは、単一のマイクロデバイスの製造のためのものです。 1。ハロイサイトナノチューブ溶液の調製<ol><li>超音波処理（10〜13 W（RMS））250μLハロイサイトナノチューブの溶液（水で6.6重量％）30秒。一度冷たい水と繰り返し超音波のクールなソリューションを提供します。再び冷却する。 </li><li>シリンジに超音波処理したソリューションを引く、きれいな微量遠心チューブに0.45μmのシリンジフィルター、およびフィルタソリューションを添付してください。均質性を維持するために、時折渦ソリューションを提供します。 </li></ol> 2。ハロイサイトナノチューブとマイクロチューブ内表面のコーティング<ol><li> 50センチメートルマイクロRenathane microtubingの長いセクション（300μmの内径、35.3μLの内部ボリューム）を取得します。対角でチューブの一方の端を切り取り、小さなIDEXアダプタ部分に挿入します。チューブのもう一方の端に3月10日CC 29G注射器の針を挿入します。 </li><li>マイクロチューブをきれいにするには、チューブの開放端（エンド配置アダプタ付き）70％エタノールにしてチューブを埋めるために注射器に約50μLのエタノールを描画します。 </li><li>注射器に蒸留水の寛大なボリュームを描画することにより、マイクロチューブのエタノールをすすぐ。 </li><li>マイクロチューブからシリンジを外します、注射器を空にし、マイクロチューブに再接続します。 </li><li>水の中のリジン0.02パーセントw / vのポリ-Lの溶液を調製します。マイクロチューブに50μLを描画し、室温（RT）で5分間座ってすることができます。 </li><li>マイクロチューブに100μLのろ過ナノチューブ溶液を描画し、室温で3分間インキュベートすることができます。 </li><li>ナノチューブ溶液をリンスするためにチューブを介して100μLの水を描画します。 RTで一晩、水で満たされた、座って被覆したマイクロチューブを許可します。 </li></ol> 3。細胞分離用マイクロチューブの調製<ol><li> 1Xダルベッコのリン酸塩の10μg/ mLのタンパク質Gの溶液を調製します（ - 7.2 PBS、pH7.0）で緩衝生理食塩水。マイクロチューブを介して50μLのPBSを描画してからの50μLを描くプロテイン-G溶液と室温で1.5時間インキュベートすることができます。 </li><li> 5μg/ mLのE-セレクチン-IgGとPBSで50μg/ mLの抗体（ほとんどの癌サンプル、抗PSMA前立腺癌サンプルの抗-EpcAM）を含む溶液を調製します。マイクロチューブにE-セレクチンと抗体溶液50μLを描き、室温で2時間インキュベートすることができます。 </li><li>非特異的な細胞接着は、5％乳タンパク質でブロックされています。 5％（w / v）を、PBS中の乳蛋白質の溶液を調製します。マイクロチューブに50μLの乳蛋白質溶液を描画し、室温で1時間インキュベートすることができます。 </li><li>チューブに50μLのPBSを描画し、血液やバフィコートサンプルを処理するための準備が整うまで室温で残す。 </li><li>前の絶縁のためのマイクロチューブを使用して、〜10分、セレクチン分子をアクティブにするのCa 2 +（ &quot;PBS +&quot;）で飽和された50μLのPBSを描画します。 </li></ol> 4。細胞分離用サンプルの調製<ol><li>患者からヘパリンに10 mLの血液を描画または取得チューブ。 </li><li> 50 mLの遠心チューブに10 mLの場所をFicoll-Paqueリンパ球分離液。フィコールの上にそっと層10 mlの全血がように血とフィコールを混在させないように。 </li><li> °C最小限の減速で4℃15分間2000X gで遠心分離します。 </li><li>新しいチューブにバフィーコート層と場所を削除します。 </li><li> PBSで洗浄バフィーコート（10分間230x gで遠心し、上清を捨てる）。 </li><li>静かに1 mLの赤血球溶解バッファーで細胞を再懸濁し、赤血球を溶解する室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 10 mLのPBS、穏やかに混合し、10分間230x gで遠心分離を追加します。上清を捨て、ゆっくりと3から4 mLのPBS +でペレットを再懸濁します。 </li></ol> 5。細胞単離<ol><li> IDEXのアダプタを使用して5 mLシリンジに官能チューブの一方の端を取り付けます。 </li><li>シリンジポンプにシリンジを挿入します。 </li><li>水没セルサスペンシオに、官能チューブの開放端N。 </li><li> 1から4 ml /時間でチューブを介して細胞懸濁液を処理します。 </li><li> PBSを含むチューブにチューブの開放端を転送+とチューブから非結合と疎結合した細胞を除去するために0.016 mL / minでシリンジに300μLのPBS +を描画します。 </li><li>きれいなチューブにチューブの開放端に配置します。マイクロチューブからシリンジを取り外し、Accutaseとプレフィルドシリンジを接続します。そっと埋めるためにマイクロチューブに十分なAccutase（〜50μL）を灌流し、10分間室温でインキュベートすることができます。 </li><li>プレートよく扱わ組織培養に廃液収集し、マイクロチューブに増殖培地を1 mL（79％RPMI、20％FBS、1％ペニシリンストレプトマイシン）とプレフィルドシリンジと灌流を添付してください。 </li><li> 37℃で培養細胞℃、加湿条件の下で5％CO 2。 </li></ol> 6。代表的な結果この手法の目的は、癌患者の血液から生存癌細胞を単離することである。デバイスの成功に必要な検証、いくつかの方法では、文化の中でがん細胞を識別するために存在しています。我々は、無傷の細胞核（図2および3）を識別するためにDAPIに加えて、そのようなEpCAM（上皮細胞接着分子）またはPSMA（前立腺特異的膜抗原）などの上皮部分に対する抗体で培養中の細胞を染色することを選択しました。癌細胞の数は、このテクニックを使用してキャプチャ必ずしも出発試料にCTCの数の関数であり、患者のばらつきが高くなることがあります。 IV期のがんと診断された患者から採取したサンプルを処理する際に、我々は日常的に純度の血液のチューブあたり100〜500癌細胞、&gt; 50％をキャプチャします。直ちに分離後に、汚染白血球の大きい番号が存在する可能性があります。しかし、これらの番号は、最大5日間の培養培地中でのインキュベーション後に枯渇されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <stロン&gt;図1。抗体媒介静的接着に続いセレクチンを介した転がりを示すCTCの分離のための官能チューブの模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> 図2乳癌患者および肺癌患者から採取した血液サンプルからのCTCの分離の代表的なデータです。 EpCAM染色に基づいて積極的にCTCとして識別され、生存細胞の数は、固体のバーや左側の縦軸と捕捉された細胞の総数と比較して、CTCとして同定された細胞の割合に関係で表されているオープンのバーで表され、右側の縦軸上で測定。結果は、文化の中で五日後にされています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> isolati〜5日以降の文化の中で、CTCの独立したドナー（AとB）から図3代表的な顕微鏡写真癌患者の血液サンプルから上に。細胞は、蛍光核（青）を可視化するためにAlexaFluor 488 EpCAM（緑）と4 &#39;,6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）で染色した。

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRKはCellTraffix株式会社（ロチェスター、ニューヨーク州）の科学顧問である。

それはしばしば、新しいがん治療薬の発見の初期段階は、原発性癌細胞への不審な似ても似つかない癌細胞株は、まだ実験室での使用の容易さのために使用のままに利用する場合があります。主要なヒト癌細胞が早期に小説の研究で利用された場合は、新しいがん治療法の開発への研究が促進されるでしょう。 CTCは、癌細胞、血液中の彼らの存在のために、標準的な採血のしやすさの中で最も簡単にアクセスできるタイプです。さらに、循環腫瘍細胞が転移5,6の過程で必要なステップを表すので、新しい薬を標的とする疾患やユーティリティとの関連性は明らかである。 in vitroでの血液からCTCの分離は、その低濃度によって複雑にされています。百万ごとに白血球や赤血球億7あたり1つのオーダーで。唯一のFDA承認されたテクニックセルを含む、血液中のCTCを検出するための現在の方法の大部分は<html>検索（Veridex）、損傷または列挙を超えての使用を排除し、検出プロセスで細胞を破壊する。上記の方法は、細胞の生存を危うくするので、がんについての将来の臨床研究のためにドアを開きません。無傷の細胞の回復がこの技術の目標であるとして、それは細胞が特に血液分離のステップの間に、注意して扱われることが不可欠です。 そのような癌の種類などの重要な特性に応じて改善された収率を達成するために変更することができ、このシステムの調整可能なパラメータの数があります。上記の手順では、我々は前立腺癌のサンプルを処理する場合を除き、すべてのがんのタイプのCTC固有の抗体としてEpCAMを使用するように選ばれた、前記抗PSMAが使用されています。癌特異的抗体の更なる置換は確かに個々の患者のためにパフォーマンスを向上させるために使用することができます。また、セレクチンおよび抗体の濃度は、キャプチャ8を高めるために変更することができます。 &quot;&gt;デバイスの本質的な特徴は、表面にE-セレクチン分子の取り込みです。E-セレクチンは、通常、内皮細胞、炎症部位への高速移動白血球を募集するための関数の管腔表面に発現しています。流れる白血球を一時的にバインドするセレクチン分子、インテグリンによる内皮細胞への細胞のいずれか遅い方と強い結合を容易にし、低速回転動作が生じる。説得力のある実験的証拠は、CTCが同様のメカニズム9,10によって浸出することができた場合になりますが存在します。セレクチンを含めることもデバイスが大きい流量で運転することができ、それ以外の抗体11に結合することから細胞を妨げる率は。従って、私たちのデバイスは、生理的にbiomimetically細胞傷害を負わせずにCTCを流れるキャプチャするために静脈を模倣しています。 エンハンスド·デバイスのパフォーマンスは、管腔表面にハロイサイトナノチューブコーティングの添加に起因することができますデバイスの。以前の研究では改良された機能を可能にするナノチューブコーティングの3つの主要コンポーネントがあることが示されている。最初に、ナノチューブのコーティングは、表面4の上に大きなタンパク質の沈着を考慮して、増加した表面積を提供します。第二に、ナノチューブのコーティングに原子間力顕微鏡を実行する際に我々は個々のナノチューブは、フローに表面から突出していることが決定した。これは、細胞が管4を介してキャプチャされ、以前の彼らの軌跡の表面に補充できるように、セレクチン分子が表面に上記のように多くの一つとして、ミクロンを提示することができます。最後に、ハロイサイトナノチューブのコーティングは、白血球の接着とCTC、したがってより大きな後続CTC純度3と共にキャプチャされた白血球の数を減らすことを可能にし、表面上の拡散を防止することができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 300 UM IDチューブ</td><td>トリーサイエンティフィック</td><td> MRE025 </td></tr><tr><td>シリンジに接続するための大きなチューブ</td><td> IDEXヘルス＆サイエンス</td><td> 1507L </td></tr><tr><td>ポンプの5mLのシリンジ</td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td>大型チューブに小さなコネクタ</td><td> IDEXヘルス＆サイエンス</td><td> P-770 </td></tr><tr><td>注射器のコネクタ大型チューブ</td><td> IDEXヘルス＆サイエンス</td><td> F-120とP-659 </td></tr><tr><td>マイクロシリンジ（3/10ccインスリン注射器U-100 29G 1/2 &quot;） </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MPバイオメディカルLLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol X線不透過性のプラス</td><td> GEヒールthcareバイオサイエンスAB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC溶解バッファ（buffer EL、1000mlに） </td><td>キアゲン</td><td> 1014614 </td></tr><tr><td>プロテインG、5 mgの</td><td>カルビオケム（calbiochem.com） </td><td> 539303 </td></tr><tr><td>人間EpCAM/TROP-1抗体</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA抗体（GCP-04） </td><td>アブカム</td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96ウェルプレート（マイクロテスト96） </td><td> BDファルコン</td><td> 35から3072 </td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロ​​ッカー脱脂粉乳、300グラム</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズ</td><td> 216005508 </td></tr><tr><td>ハロイサイトナノチューブ</td><td> NaturalNanoの</td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td>炭酸カルシウム、5グラム</td><td>アルドリッチ化学</td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fcキメラ、100μgの</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 </td><td>ギブコ</td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td>水のポリ-Lリジン0.1％w / vの</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td>ソニックDismembrator </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td>モデル100 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタの生化学</td><td> S11056H </td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>シグマライフSiiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

循環腫瘍細胞（CTC）、循環器系全体に原発腫瘍から普及し、最終的に遠隔サイトでの二次腫瘍を形成することができる細胞である。 CTC数が血液や疾患の重症度1のCTC濃度との相関関係に基づいて疾患の進行を追跡するために使うことができます。治療ツールとして、CTCは、パーソナライズされた治療法を開発するために実験室で研究することができます。この目的のために、CTCの分離がなく細胞の損傷、特に他の細胞型、白血球による汚染を引き起こしてはならない、できるだけ2として避けなければならない。 CTCの列挙のための唯一のFDA承認されたデバイスを含めて、現在の技術の多くは、（詳細については、文献[2]を参照してください）​​分離プロセスの一環としてCTCを破壊する。実行可能なCTCをキャプチャするためのマイクロ流体デバイスは、上皮マーカ3に対する抗体に加えて、E-セレクチン糖タンパク質で官能面で構成され、説明されています。デバイスの性能を向上させるマンスナノ粒子コーティングは、ハロイサイトナノチューブから成る粘土4から収穫アルミノケイ酸塩ナノ粒子を適用した。 E-セレクチン分子は、別のマイクロ流体デバイス上の利点は、より長い処理時間は、表面と相互作用するのに十分な時間と標的細胞を提供するために必要である請求貸す、デバイスを介してポンピングされる動きの速いCTCをキャプチャするための手段を提供します。上皮のターゲットに対する抗体は、デバイスにCTC特異性を提供するとともに、分離を調整するために容易に調整可能なパラメータを提供しています。最後に、ハロイサイトナノチューブのコーティングはタンパク質吸着のために表面積の増加を提供し、大幅に強化されたアイソレーションは動きの速い細胞をキャプチャするために支援することで、他の技術に比べて可能にし、混入白血球の3,4を撃退。このデバイスは、既製の材料を使って簡単な手法によって生成され、正常に転移の血液からがん細胞を捕捉するために使用されていますがんの患者さん。キャプチャされた細胞は、分離後に文化の中で、最大15日間維持し、これらのサンプルは、通常、各患者からの&gt; 50％可能な主要な癌細胞で構成されています。さこのデバイスは、希薄化後の全血およびバフィーコートサンプルの両方から可能なCTCをキャプチャするために使用されています。最終的に、私たちはパーソナライズされた癌治療を開発するために臨床の現場で機能を持つ手法を提示します。

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples at JoVE.com

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K ビュー.  Cornell University. 循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。

ビデオ: Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

光音響流量測定法を用いて循環メラノーマ細胞の検出と分離

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

生物工学

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

外科的組織からの初代ヒト結腸腫瘍細胞の単離およびトラクションサイトメトリーのためのソフト弾性基板上にそれらを直接培養

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

人間歯槽骨膜から骨膜由来細胞の骨形成促進活性に及ぼすビタミン D の間葉系幹細胞の分離

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

ヒアルロン酸を用いた神経膠芽腫患者由来細胞の 3次元培養ヒドロゲル

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

超音波による患者特異的ポリビニルアルコールファントム作製法とX線コントラストによる脳腫瘍手術計画

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.