この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（助成金＃606658）からRLMに授与の補助金によって賄われていた。

1。細胞培養（前はBBB総会に3〜7日） 1.1。初代ヒト脳微小血管内皮細胞（BECは） BECは、商業的に入手した。細胞を、正常なヒト脳皮質組織のディスパーゼ解離によって生成され、通路3（&lt;12回の集団倍加）で凍結提供された。 <ol><li> 基層 ：メーカーの指示に従って「接着因子」とコート組織培養容器。 </li><li> 細胞の維持 ：血清含有完全培地中で前記下部電極を維持します。実験のために、完全無血清培地での培養BECは。加湿5％CO 2で細胞を維持し、37℃で21％O 2インキュベーター 注 ：DMEM/F-12を15mMのHEPES、10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）を補充しながら、特殊な試薬に代わるものとして、0.1％（w / v）のゼラチン溶液をコーティング試薬として働くことができる、 2mMのL-グルタミン、50μgの/ mlのゲンタマイシン、20μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlの内皮細胞増殖サプリメントは、BECのメンテナンスのために使用することができる。 </li><li> 、1:6 1:3の割合で分割コンフルエントBECは、次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、次の実験のために継代培養 。 3日ごとに維持培地を変更します。 15の通路に前記下部電極を使用してください。 </li></ol> 1.2。 SVGのヒト胎児アストログリア細胞株 SVGヒト胎児アストログリア細胞22は、本来複製欠損シミアンウイルス40で形質転換したヒト胎児脳の初代培養に由来した。 <ol><li> メンテナンス ：20％（v / v）のFCS（それらの親の一次細胞22を維持するために使用されるのと同じ血清百分率）、2mMのL-グルタミン、50 U / mlのペニシリンを補充したアールの平衡塩溶液で最小必須培地中で培養SVG細胞および50μg/ mlのストレプトマイシン。加湿した5％CO 2、21％O 2中で細胞を維持する</37℃でのサブ&gt;インキュベーター</li><li>次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、1:5〜1:10の比率で分割コンフルエントSVGs： 実験のために継代培養 。トリプシンの除去により、培地中の血清の高含量に必要とされない。 3日ごとに培地を変更します。 20継代まで使用SVGs。 </li></ol> 2。ヒトにおける体外 BBBモデルの組み立てと共培養（0日目） コメント ： 体外接触BBBモデルにおける人間は変更を加えて、公開されたプロトコル13,23に従って製造されている。 2.1。インサートのコーティング<ol><li>付属24ウェルプレートのウェルに組織培養インサート（ポリエステル多孔質膜と、直径6.5ミリメートル、3ミクロンの細孔サイズ）を配置します。コー​​トインサートの管腔側表面<s> </s>一晩のラットコラーゲンで加湿した37℃のインキュベーター内のI（20μgの個/ cm 2、132μgの50μlの/ mlのコラーゲンのMilli-Q水中0.02％酢酸中のI（MQH 2 O））。残留酸を除去しMQH 2 Oで（反管と管腔側からの両方）を1回の挿入を洗ってください。 注意：脳の毛細血管の基底膜にはコラーゲンが含まれていない私が、主にラミニン、コラーゲンIV型アイソフォーム、ナイドジェン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン9。このため、一部の研究者は、そのようなより本物BBBモデリングのためのコラーゲンIV、フィブロネクチン13、またはマトリゲル（BDバイオサイエンス）16のようなコーティング剤を利用する。 </li></ol> 2.2。下側（反管）膜表面に播種SVGs <ol><li>インサートを反転し、静かに多孔質膜の縁の周りに弾性シリコンチューブ（「外部チューブ &quot;;〜10ミリメートル、長、8ミリメートル、内径、1.6ミリメートルの壁）の短い部分に合わせて、基本的によく反管腔側表面上に新しいを作成する（ 図2A）。 </li><li>挿入旧姓の下dsは、メディアの漏れを回避するために密封される。 プラスチック封止コーンと一端で封止さ、まず、（ 図2B;;約8 mmの長さ、3.2ミリメートル、内径1.6mmの壁「内部チューブ」と呼ばれる）シリコーンチューブからなるプラグ（ 図2Aおよび2B）を調製（〜3ミリメートル長い; 0.2ミリリットル、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）チューブの底部切断することによって調製し; 図2B）が 、 このコーンは、内部管腔を密封するだけでなく、インサートへの緊密な嵌合のためにその縁部を広げるだけでなく。それは、膜からのアップまで約1〜2ミリメートル（ 図2A）に達するまで、次の、滅菌ピンセットを使用して、管腔内、あらかじめ、その中にシリコン栓を挿入します。 </li><li>次に、200μlのSVG維持培地中に4×10 4 SVG細胞（播種それctionの上記1.2.2）直接でなく反管腔側膜表面上のシリコン（ 図2A）に変換する。 SVGsはインキュベーター内に少なくとも4時間、接着させる。 注：（他の上で倒立1プレートと、 図2C）2 6ウェルプレートの間で組み立てを挿入無菌輸送を維持するために、手順の間、フィルタリングされていない空気への曝露を最小限にするために。シリコーンチューブとプラグをエタノール中で洗浄し、後の使用のためにオートクレーブする。 注：のみ膜の細孔を持つインサート用プラグ（2.2.2項）を使用して、1ミクロンよりも大きいサイズ。 1ミクロン≤孔径を有する膜はほとんど漏れていないため、外部シリコンチューブ（セクション2.2.1）の試着のみを必要とする。また、コラーゲン以外のコーティング剤は、I（2.1項の注を参照）でも、3ミクロンの孔を通して漏出を防ぐことができます。経験的にこれを決定する。 </li><li>あなたの星状細胞の付着状態を監視するために、中に並列に播種アストロサイト細胞懸濁液の標準的な96ウェルの同一ボリューム。このウェルを6.5ミリメートルインサートと同じ表面積（0.33 cm 2）を有し、インサート膜よりも位相差顕微鏡による細胞の可視化を容易に可能にする。あなたがコントロール内のアストロサイトの十分な接着性を観察すると、96ウェル、アストロサイトが適切に挿入膜にも付着している。 </li><li>アストロサイトは十分にコントロールに付着した場合には、96ウェル、組織培養フードに挿入アセンブリを転送します（上記の注を参照）、静かに外付けシリコンチューブやプラグを外します。 800μL/ウェルのBEC維持培地（上記のセクション1.1.2）を含む供給ウェルに、通常の（ つまり直立）の向きに挿入を返します。 </li></ol> 2.3。アストロサイト上の管腔チャンバー内に前記下部電極の播種 200μl中シード2×10 4 BECはコラーゲンコート腔側表面上及びInSeにを返すインキュベーターにRTS。 2.4。共培養実験の前に培地交換せずにBEC培地中で3日間、SVG / BECシードの挿入を共培養。 3。人間BBBモデルを用いた実験（3日目） <ol><li>それぞれ、600μlの無血清BECは培地100μlで反管腔側とメディアを交換することによってin vitroでの BBB最初の洗浄細胞を刺激する。 </li><li>再び腔側媒体を吸引し、刺激剤との無血清培地100μlで交換してください。 注意：反管室の刺激が必要な場合（アストロサイトのコンパートメントからのin vitro BBBを活性化するために）、反管メディアを吸引し、刺激剤との無血清培地の600 ULと交換してください。 </li><li>管腔の刺激は、3×100μlのを必要とする、実行される場合、したがって（三連で、各実験群を試験する、我々は、再を希釈することをお勧め<html>ウェル間のピペット誤差を最小限に群あたり無血清培地を350μl）中のそれらの最終濃度に薬剤。 </li><li>前述したように、および/ ​​またはTEER 13,16,25の測定（後者のために我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合アルブミンを使用）標準傍細胞および/ ​​または標識トレーサー16,24の経細胞透過性アッセイを行う。 </li></ol>透過性（最大の％）=（ベースライン透磁率の変動を考慮するために、実験の間、（最大の透過性の基準となる）細胞を含まないコーティングされた挿入物および式を用いて、ビヒクル処置群に対する相対透磁率の変化を分析実験的なインサートの透過値 - ブランクインサートの車群の平均透過性値）/（透磁率 - ビークル群の平均透過性値）×100。 4。多孔質膜上での細胞の可視化NT &quot;&gt; コメント ：挿入膜上の未染色細胞は、膜が非常に不透明であり、光の透過を妨害するので、位相差や微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡によって観察することは困難である我々は上の細胞の種々の染色手順を開発し、この問題に対処するため。大幅膜上のセルの外観を向上させる。まだウェルズ、インサートに付属している。膜のみ取り付ける目的で、染色手順の終了時に削除する必要がある一般的には、挿入膜を染色挿入、。 4.1。ヘマトキシリン​​染色<ol><li> 20分間、リン酸緩衝化生理食塩水（130mMのNaCl、10mMののNa 2 HPO 4、10mMのNaH 2 PO 4、pH7.2のPBS）中の（w / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）の氷冷4％インサートを固定する。 PBSで一度洗浄します。 </li><li> 2分間0.1％マイヤーのヘマトキシリン​​液に挿入水没。 </li><li>優しくインを沈めることによって（水道水でインサートを洗う）水道水を含有する、穏やかに過剰の水をピペッティングビーカーにERT。希望の青色が発生するまで約20秒間スコットの水道水の溶液（2g / Lの炭酸水素ナトリウム、20グラム/ LのMgSO 4）に挿入を転送します。水道水（セクション4.1.3）で再度挿入を洗ってください。任意エオシン染色は、水道水洗浄、続いて10秒間、1％エオシン溶液にインサートを浸漬することによりここに導入することができる。 </li><li>挿入膜を空気乾燥させます。膜を除去し、明視野イメージングのためのガラススライドにマウントし（膜カッティングエッジの周り）メスを用いて 注意：ジ-n-butylphthalateinxylene（DPX）封入剤を利用する場合は、膜を除去してマウントする前にキシレンが続き、100％エタノールで挿入を洗う。 </li></ol> 4.2。走査型電子顕微鏡（SEM） <ol><li> 20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。 PBS中で3回洗浄する。 </li><li> W / V（1％の30分のための膜をポスト修正MQH 2 Oに）四酸化オスミウム</li><li>洗浄は、水（セクション4.1.3）に挿入し、エスカレートエタノール勾配（50％、70％、5分ごとに、90％、区間ごとに10分間、100％エタノールで、次いで3×）で脱水する。 </li><li>エタノール（1:2、その後5分間2:1）：ヘキサメチルジシラザン（HMDS）の混合物で脱水挿入を扱う。 </li><li>乾燥条件下では5分、空気乾燥して保存するため、100％のHMDSで挿入を扱う。 </li><li> （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去します。走査型電子顕微鏡により膜を調べる。 </li></ol> 4.3。免疫蛍光<ol><li>トリス緩衝生理食塩水（;フィルタリング50mMトリス-HCl pH7.6の、154のNaCl、0.22ミクロンTBS）で一度洗って、20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。 </li><li>以前に26を説明したように、挿入膜上で細胞の免疫染色を行ってください。 </li><li> （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去してAGにマウント蛍光封入剤で少女のスライド。蛍光顕微鏡により膜を調べてください。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

脳の病理への医学研究は、多くの翻訳困難を抱えている。急性虚血性脳卒中の領域では、例えば、動物モデルにおいて非常に有望であった多くの薬剤は、臨床38,39に失敗しました。これらの不本意な結果の理由は多様であり、人間のストロークシナリオおよび動物実験21から得られた結果の過大評価に前臨床試験システムの不倫が含まれています。臨床段階に前臨床調査結果の予測値を改善するための一つの戦略は、 ヒト細胞ベースのin vitroモデルの追加開発で、これらは新薬とメカニズムをスクリーニングするための強力かつ費用対効果の高いツールを提供し、臨床的に意義のある道に焦点を当て、より良い可能性があり21。このような状況の中で、我々はここでは詳細に記載されたヒト不死化アストロの新規な組み合わせを利用し、人間の接触BBBモデルの確立のために我々の研究室で行われ、プロセスcytes（SVGs）や脳卒中に関連した現象の検査のためのヒト初代BECは。 （フローなし）静的条件の下では、（ 図1）最高のin vivoでの解剖学的構造に似ているのBBBモデルに連絡し、そのバリア性13,17,18に優れていることが示されている。重要なのは、BECはアストロサイト間の真の接触はアストロサイトのエンドフィートと緊密な（透過性が低い）BEC単層14,15,27のその後の誘導の通過を可能にする、より大きな細孔径（≥1程度）、を有する膜で発生します。しかしながら、高い細孔サイズを有する反転インサート上の星状細胞の播種 - 接触BBBモデルの調製におけるコア技術的要素は、 - 限定された媒体の体積に加えて、反転さ6.5ミリメートルに添加することができるので、二重の技術的な課題を提示インサート（〜50μlの）膜はまた、それらの大孔径と媒体の漏れを起こしやすい。これらの制限は、ASTを行うことができますrocytic播種ぎこちないと矛盾する。 3ミクロンの孔が反転インサート上でアストロサイトを播種するための当社の革新的な技術は、この手順のためのシンプルで効果的なソリューションを提供しています。反管腔側表面の上だけでなく、取り外し可能な、不浸透性のシリコンを作成することによって、我々は非常に成功して多孔質膜に付着するアストロサイトの能力を向上させた。これは反管腔側表面のアストロサイトの均一な成長を可能にし、（例えば、BBB 28に5異なったプラスミノーゲン活性化因子の効果の我々の最近行われたスクリーニング）多くの実験パラメータを同時にスクリーニングするための多数の挿入の再現性のある製造を可能にする。したがって、そのシンプルさにもかかわらず、我々は劇的にこの接触BBBモデルを使用して私たちの研究のスループットと品質を向上させる手法を発見した。私たちの星状細胞の播種方法の一つの限界は、薄い港インサート（10μの余分な手作業の要件であるM厚）の膜。過剰または乱暴な取り扱いは、マイクロ涙と膜に損傷を引き起こす可能性があります。組立/分解が最小限の力で実行されなければならないように、従って、軟質で柔軟なシリコーンチューブの使用が必須である。 その全体的な概念については、私たち人間のBBBモデルは当初、初代ヒト細胞を利用して、先に記述されたプロトコル14,23に基づいて設立されました。 BBBモデリングのための彼らの優位性にもかかわらず、一次ヒト脳細胞の雇用の一つの欠点は、日常的に、一次BECはアストロサイトおよび/または商業的にそれらを得るに関わるコストの定期的な生産のために生きたヒト脳組織にアクセスすることができないことである。多くのBBBモデルが正常（ラットC6グリオーマ細胞29など）不死化星状細胞と初代星状細胞を置換するので、新規な、ヒトBBBモデリングのための豊富でかつ費用対効果の高いオプションとしてSVG星状細胞22を採用することは妥当であった。へSVGsの能力正に原理的にBBB研究のためのそれらの適合性を検証しBECバリア機能に影響を与える。対照的に、我々は、 生体内で 1,2,9 での BBBでの重要な役割のための私達のBBBモデルのプライマリ前記下部電極を維持することにしました。重要なのは、原発BECは物の長期培養は脱分化し、そのBBB固有の表現型の劣化につながることができます。これは確かに、アルブミンのためのかなり高い内皮透過性の値によって我々のシステムでは明らかである。この理由から、我々は考慮に上昇し、その基礎透過性を考慮して、主に相対的に28（ 図4）に我々のモデルを使用している。非常にタイトなヒトBEC単層が所望される場合、バリア機能はさらに、グルココルチコイド、ヒドロコルチゾン17またはホスホジエステラーゼ阻害剤13を有する環状AMPなどの化学物質を添加することによって改善することができる。例えばhCMEC/D3細胞株40不死化ヒト前記下部電極は、また、より良いtiのを維持する能力のために使用することができる時間をかけてGHTジャンクショ​​ン。しかし、BEC細胞株は、多くの場合、低通路プライマリ前記下部電極41,42と比較して低減バリア品質を表示し、注意深くための他の潜在的な変化（細胞表面受容体の発現の変化、すなわち ）を考慮する必要がある。 総称して、アストロサイト細胞型（SVGs すなわち雇用）とアストロサイトの播種プロトコルへの実質的な改善の我々の修正は、再現可能な組み立てが容易と真正ヒト接触BBBモデルの生成をもたらした。念頭に置いて、その限界を保有する、このシステムは、我々がここで28を例示したように、急性虚血性脳卒中のだけでなく、in vitroでの研究のための有用なツールとして機能するだけでなく、BBBの調節を含むいくつかの他の脳病理のことができます。

BBBは、末梢血液循環および脳止血の維持に決定的に責任が中枢神経系との間の特殊なインタフェースである。それは、機能的に脳内にしっかりと動的ゲートウェイを形成するために（下記参照）、いくつかの細胞性および無細胞成分によって影響される別個の脳微小血管内皮細胞（前記下部電極）を含む。生理的条件下でBBBは、脳内に、血液細胞、血漿成分と有害物質、すべての潜在的に神経毒性の通過を制限する。並行して、BBBを選択的に脳および脳正確に環境を維持するために、1,2の循環の間にキーイオンおよび栄養素（グルコースおよびアミノ酸）および代謝老廃物を交換する。近年、BBBの障害が神経変性または炎症関連疾患（ 例えば、アルツハイマー病およびmultiplのような慢性の脳の病理の多様で起こることが明らかになってきているEは3だけでなく、虚血性脳卒中4のような急性状態で）それぞれ硬化症。 脳内皮細胞（BECは）の固有のBBB特性は、主にそれらの脳環境5によって誘導され、特にアストロサイト6,7によってれる。これと同時に「神経血管装置」（NVU）と呼ばれるような周皮8、ニューロンとミクログリア1,3だけでなく、基底膜9、サポートBECはなどの他の細胞型、という機能ユニットを一緒になって成長して理解することがありますカップル彼らの供給毛細血管10への神経代謝要求。 病理学的状況でのBBBの関与は、BBB関連の研究11,12を支援するためにin vitro BBBモデルで開発する多くの試みの下にある。これらのモデルは、NVU原理に従って生体 BBB特性にできるだけ近くを模倣することを目指しています。 インビトロ </EM&gt; BBBモデルは、一般的に（、（主に牛13から、人間の14、ラット15、マウス16、およびブタ17,18起点）タイトジャンクションを形成する前記下部電極の単層上に多孔質膜上で培養し、一緒支えるアストロサイトに依存して広範囲にデリら 2005 11）によって検討。 星状細胞は、培養培地がまだ可溶性因子を介して前記下部電極16と通信することによって、（膜の上面上で培養）前記下部電極から分離されたウェルの組織培養の底面上に非接触状態で増殖させることができる。より良い生体内で BBBの解剖学的構造に似ている、より高度なモデルでは、アストロサイトが直接前記下部電極13,15,17（ 図1）に近接した膜の反対側に接触条件で培養で維持されています。この構成は、確立され、前記下部電極とアストロサイトとの間の物理的な接触を可能にするときアストロサイトプロジェクト多孔質膜を通って、そのプロセス。アストロサイトのエンドフィートは小さい細孔サイズ（ すなわち 0.4ミクロン）14,15を通過することができないため、重要なのは、発生する真の接触のための細孔は、直径1μmのを≥必要があります。注目すべきことに、コンタクトBBBシステムは、それらの経内皮電気抵抗（TEER）および種々のトレーサー13,17,18の内皮透過性値に関して、それらの非接触型対応物よりも優れていることがいくつかの研究で実証されている。メディアフローの追加の次元が最近、脳血管系12,19の近いシミュレーションに内皮にせん断力を加えるためのin vitro BBBモデルの数に追加されました。 コンタクトBBBモデルを生成する際に克服する一つの技術的な障害は、多孔質膜の反管腔側表面上の重力に抗して星状細胞の播種である。アストロサイトは、単に内の一番上のメディアの落下に播種した前回のプロトコル13,20、verted挿入、許される唯一の短い播種回適切な細胞の付着のためには不十分であることが私たちの手で発見された（ すなわち 、10分13または2時間20）。この基本的な方法を用いて、より長いアストロ装着期間は、特に、（温度、pH、湿度の変動を引き起こす）​​インキュベーターの頻繁な開口部によってインサートの常時監視を必要とし、また、孔を通る媒体の漏れに起因する不均一な細胞播種する傾向がある細孔場合が1μmよりも大きいが使用される。 ここでは、コンタクトBBBモデルの製造のための一般的なプロトコルを記載している。我々の手順は、上述の制限に対処反転インサート上の細胞播種のための代替の方法を含む。この方法は、長時間にわたって、平衡化したインキュベーター中、反管腔側膜表面上への星状細胞の乱されない付着を可能にする。その結果、星状細胞の均一な播種は、バリア品質を向上が達成されると挿入の間、基礎透過性の変動を最小限に抑えることができます。 ヒト細胞の使用は、人間が関連する研究21のために重要であるとして、我々は、さらに、この記事で初代ヒトBECは、新規な組み合わせの具体的な利用を実証し、ハイスループットスクリーニング能力との接触人間BBBモデルの確立のための人間のアストロサイトを不死化。多孔性膜上に細胞を観察すると、多孔質膜上に合流し、細胞形態の決定を補助することができる困難で、また我々の詳細を染色技術とすることができるからである。 BBB上 - 急性虚血性脳卒中のための唯一の治療選択肢となって血栓破裂酵素 - 最後に、私たちは私たち人間のBBBモデルは、組織型プラスミノーゲン活性化因子の影響（T-PA）を調べるために利用することができる方法の例である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

血液脳関門（BBB）は、しっかりと脳環境を制御する不透過性はなく適応脳毛細血管を含む。 BBBの障害は、臨床的に関連の研究を助けるために、インビトロ BBBモデルにおいてヒトの開発の必要性が生じ、多くの脳の病態の病因に暗示されている。これまでに説明した数々のBBBモデル、（フローなし）静的な中では、星状細胞および脳内皮細胞（BECは）は、多孔質膜の両側に共培養されたBBBモデルを連絡し、シミュレートするために、簡略化され、まだ本格的なシステムとして登場ハイスループットスクリーニング能力を有するBBB。それにもかかわらず、このようなモデルの生成は、いくつかの技術的な課題を提示。ここでは、一次ヒトBECはと不死化ヒトアストロサイトの新規な組み合わせを利用したコンタクト人間BBBモデルの製造のためのプロトコルを記述します。具体的には、詳細な反転インサート上の細胞播種のための革新的な方法だけでな​​く、inserを指定T染色技術と、我々は、BBB関連の研究のための我々のモデルをどのように使用するかを例示している。

人間を確立するために、BBBモデルに連絡し、我々は、内皮細胞14,15,27,28と接触するアストロサイトのエンドフィートの通過を可能にするために示され、3ミクロンの細孔径を有する多孔質膜上SVGsと前記下部電極を育成しなければならなかった。完全な接触モデルの概略図を図1（図示の左側）に示されている。コンタクトシステムによって提示された主要な技術的な課題は、膜の反管腔側表面に重力に逆らって、星状細胞をシードする必要があることである。我々は、管腔内に挿入された追加のシリコーンプラグ（ 図2）媒体の漏洩を防止しつつ、主に管腔側膜表面の上に取り外し可能なシリコーンウェルを作成することによって、このタスクに成功した。この方法は、順番に強く、最小の細胞損失を有する多孔質表面に付着されるようになったSVGsの最適な、途切れない播種期間（最低4時間）、許可された。実際、3日SVGsとBECはアプリの両方を播種後ヘマトキシリン染色された挿入物の画像から判断されるよう（; 図3A、左パネルのセクション4.1を参照）、コンフルエント耳付き、均一に膜をカバーした。さらに、両方の細胞型は、（SVGs 22とWiebel·パラディ体および前記下部電極における細胞質小胞におけるvon Willebrand因子の発現におけるグリア線維性酸性タンパク質の拡散染色パターン、 図3A、右パネル）多孔質膜上での細胞特異的マーカーを維持、免疫蛍光（セクション4.3）で観察した。さらに、SEM像から（セクション4.2）、それはSVGsとBECは、膜の細孔（ 図3A、中央のパネル、矢印の頭）、人為的に生体外 BBBの物理的なバリア機能に貢献する現象の上に直接成長させることができたことが明らかになった連絡先は、3,28を models1。機能的には、28インプロ蛍光アルブミンの16,24 SVGsの存在内皮透過値（PE）中一人でBECはへ〜4倍 ​​と比較してVED（P &lt;0.01であり、n = 4）、0.574±0.199×10 -3 0.126±0.028×10 -3センチメートル/分のないかと、星状細胞（SVGs）へ、それぞれから。これらのアルブミンPeの結果は、ラットC6グリオーマ細胞29とマウスのBECはを使用して別の研究に匹敵する。当社の播種プロトコルは、成功したばかりの単離された初代マウスBECは1μmの細孔を上に成長させたマウスの主アストロサイトにも適用した。このマウス接触モデルでは、小さな親水性トレーサーフルオレセインナトリウムのための合理的な物理的な障壁を得た（Peが = 0.83±0.22×10 -3センチメートル/分であり、n = 3）。したがって、我々の播種方法は、他の種からBBBモデルの調製のために拡張することができる。 接触BBBモデルの最も基本的な特徴は、物理的に内皮細胞と接触する膜孔を通じてエンド足を投影するアストロサイトの機能です。 iDENは、走査電子顕微鏡を利用したいくつかの研究tifyはアストロサイトとECとの接触が14,15,27もっともらしいことを原理の証明として、管腔側表面に（アストロサイトは播種する）反管腔側膜表面からのパスのプロセスをアストロサイト。これらの研究に続いて、我々は反管腔側表面にSVGsを播種後、SEMによって腔膜をイメージした。 図3Bに示すように、星状細胞（SVG）エンド足が管腔コンパートメントに3μmの孔を通過し観察することができ、その連絡先を確認することは、潜在的SVGsと前記下部電極との間に存在することができ、この次元の細孔に播種した。まとめると、我々の播種方法は、単純、効率的であり、本格的な接触BBBモデルを得た。 我々は、BBBに、T-PA、線維素溶解剤の効果を調査するために私たち人間の接触BBBモデルを利用している。記事の数は、t-PAは、急性虚血性脳卒中の治療のために30〜33の静脈内投与時のBBBの開放を誘導することが可能であり得ることを示唆している。のt-PAとBBBの間のこの相互作用は、T-PAに誘導される血栓溶解4,34,35に関連する出血性合併症に寄与し、したがって、現在の研究努力の対象である場合があります。 インビトロでの我々の研究は、t-PAが実際に薬理学的に関連する範囲36,37内の両方であった濃度（ 図4A）及び時間依存的（ 図4B）、無傷のBBB透過性を増加することを確認した。また、SVGのアストロサイトの劇的な形態変化は、多孔質膜がt-PAに対するアストロサイトの応答は、T-PAに誘導されるBBB開口部の下にあることを示唆している、のt-PA（ 図4C）への曝露をポストに観察することができた。強力かつ広域スペクトルプロテアーゼプラスミンに - その天然の基質 - その後の調査は、t-PAはプラスミノーゲンの活性化を介してアストロサイトを刺激することを確認した。さらに、T-PAおよびプラスミンは、Rhoキナーゼ（ROCK）アストロサイトにおけるシグナリング、および封鎖を活性化することが見出された<html> ROCK経路のT-PAに誘導されるBBBの開口部28を防いだ。これは、BBBモデルの利用が新たな生物学的プロセスおよび治療機会の特定につながる可能性が方法の良い例です。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig1.jpg" width="500px" /> 図1。 in vitroの BBBモデルの挿入ベースの構成。 体外 BBBモデルでの （フローなし）のスタティックの概略図。基本的なモデルでは脳内皮細胞（EC、オレンジ）（黄）多孔質膜に単独で培養する。より高度なアプローチでのECにアストロサイト（緑）と共培養されています。星状細胞は、非接触状態で、ウェルの底部（右側）に、又は多孔質膜の反管腔側表面上の接触条件（左）のいずれかで成長させることができる。NK」&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig2.jpg" width="500px" /> 図2。コンタクトBBBモデルを調製するための管腔外膜表面上の星状細胞播種のための改良された方法。（A）インサートを反転させて、シリコンチューブ（「外部チューブ」）の短い部分は、その周囲の周りに組み立てられ、シリコーンプラグに嵌め込ま管腔側キャビティ。このアセンブリは、反管腔側表面の上にうまく作成され、細孔を通って漏れるのメディアを防ぐことができます。細胞がウェルに播種し（右側）（B）シリコーンプラグは封止コーンと一端で密封されたシリコーンチューブ（「内部チューブ」）の別の部分から調製される長時間静置付着させることができるその空洞内に挿入されている。（C）は一度、播 ​​種組み立てインサートは、汚染の危険性を最小限にするために（1プレートは、他の上で倒立）2 6ウェルプレートの間で輸送される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50934/50934fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig3.jpg" width="500px" /> 図3。 。脳内皮細胞（BECは）と3μmの多孔質膜A）ヘマ ​​トキシリン（左パネル）、走査型電子顕微鏡（SEM でのアストロサイトの視覚化 、反管腔側表面の中央のパネル）とSVGsの免疫蛍光画像（右パネル）（40,000 6.5ミリメートルあたりの挿入、トップパネル）と前記下部電極（共培養することなく、3日間（）のために3ミクロンの多孔質膜上に成長した2万6.5あたりのミリコラーゲンIコートした上で挿入、管腔側表面、下のパネル）。両方の細胞型は、この時間をfra内でコンフルエンスに達する私とは、膜上の（BECは、右のパネルのためのWiebel-パラ​​ディ体中のSVGおよびフォンヴィレブランド因子（VWF）のためのグリア線維性酸性タンパク質（GFAP））、それらの細胞特異的マーカーを維持する。矢印は、細胞核を表し、一方、さらに、直接上に成長し、孔を覆うように、両方の細胞型の能力を示すSEMパネルに頭を矢印。 SEM像のスケールバーは25μmで（上）または20ミクロン（下）を表す。免疫蛍光画像のスケールバーは40μmで表す。（B）管腔（BEC）反管腔側膜表面上SVGs（単独）の表面の3D播種後に3ミクロンの孔を通過したSVGのエンドフィートのSEM像を。これらの画像は、私たち人間のBBBモデルにおけるSVGsと前記下部電極との間に真の接触の開発の可能性を検証します。スケールバーは、左側のパネルと右パネルには12μmで6程度を表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50934/50934fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <pクラス= &quot;jove_contentは&quot;&gt; *セル位置の更なる明確化のため1、左パネルの図をご参照ください。 <img alt="図4" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/50934/50934fig4.jpg" width="400px" /> 図4。 BBB透過性の組織型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）媒介性増加は、星状細胞の形態学的変化によって駆動される。（A）の増加のt-PAの濃度は、インビトロ BBB におけるヒトの管腔チャンバーに加え、透磁率が24時間後に評価した。後で反管室への蛍光アルブミンの通過による。のt-PAは、濃度依存的にBBB透過性を増加させた。 N =すべてのグループの4-6が、T-PA 10nMの、n = 2である。 *** P &lt;0.001、他の全ての群と比較して、ニューマン-クールズ事後に分散分析（B）のt-PA（1μM）は、 人間の管チャンバーに添加した1経由で透過性の評価の前に8時間および24時間BBBを体外。示されているように、T-PA媒介BBBの開口部は、すでにかなりの8時間後の刺激（24時間で最大の70.26パーセント）であったが、さらなる増加が24時間で観察された。 N = 6、*** P &lt;0.001、** P &lt;1の方法ニューマン-クールズ事後でANOVAによりゼロに0.01compared。 （A）及び（B）の両方において、バー/データ点は平均±SEMを表す。ポリエステルインサート膜上ヘマトキシリン染色SVGsの（C）代表的な明視野像（上のパネル）またはSVGsの走査電子顕微鏡写真（下部パネル） （3ミクロンの孔サイズ）車両またはt-PA（1μM）で24時間後の処置。発音のt-PAに誘導される形態学的変化やSVG単層の完全性の破壊は、t-PAに対するアストロサイトの応答がBBBの透過性にt-PAの効果の根底にあることを示唆し、観察することができる。画像は、2つの独立した実験の代表である。 SEM像のスケールバーはREPRE61ミクロン（左）または120ミクロン（右）を送りました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50934/50934fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K ビュー.  Monash University. 血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

生物工学

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

アプリジア 単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

要約

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この動画の章

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

使用プラセンタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

アプリジア単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

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ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

アプリジア 単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

使用プラセンタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定

アプリジア単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備