この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（助成金＃606658）からRLMに授与の補助金によって賄われていた。

1。細胞培養（前はBBB総会に3〜7日） 1.1。初代ヒト脳微小血管内皮細胞（BECは） BECは、商業的に入手した。細胞を、正常なヒト脳皮質組織のディスパーゼ解離によって生成され、通路3（&lt;12回の集団倍加）で凍結提供された。 <ol><li> 基層 ：メーカーの指示に従って「接着因子」とコート組織培養容器。 </li><li> 細胞の維持 ：血清含有完全培地中で前記下部電極を維持します。実験のために、完全無血清培地での培養BECは。加湿5％CO 2で細胞を維持し、37℃で21％O 2インキュベーター 注 ：DMEM/F-12を15mMのHEPES、10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）を補充しながら、特殊な試薬に代わるものとして、0.1％（w / v）のゼラチン溶液をコーティング試薬として働くことができる、 2mMのL-グルタミン、50μgの/ mlのゲンタマイシン、20μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlの内皮細胞増殖サプリメントは、BECのメンテナンスのために使用することができる。 </li><li> 、1:6 1:3の割合で分割コンフルエントBECは、次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、次の実験のために継代培養 。 3日ごとに維持培地を変更します。 15の通路に前記下部電極を使用してください。 </li></ol> 1.2。 SVGのヒト胎児アストログリア細胞株 SVGヒト胎児アストログリア細胞22は、本来複製欠損シミアンウイルス40で形質転換したヒト胎児脳の初代培養に由来した。 <ol><li> メンテナンス ：20％（v / v）のFCS（それらの親の一次細胞22を維持するために使用されるのと同じ血清百分率）、2mMのL-グルタミン、50 U / mlのペニシリンを補充したアールの平衡塩溶液で最小必須培地中で培養SVG細胞および50μg/ mlのストレプトマイシン。加湿した5％CO 2、21％O 2中で細胞を維持する</37℃でのサブ&gt;インキュベーター</li><li>次の使用を目的とし、時間（3-7日）に応じて、1:5〜1:10の比率で分割コンフルエントSVGs： 実験のために継代培養 。トリプシンの除去により、培地中の血清の高含量に必要とされない。 3日ごとに培地を変更します。 20継代まで使用SVGs。 </li></ol> 2。ヒトにおける体外 BBBモデルの組み立てと共培養（0日目） コメント ： 体外接触BBBモデルにおける人間は変更を加えて、公開されたプロトコル13,23に従って製造されている。 2.1。インサートのコーティング<ol><li>付属24ウェルプレートのウェルに組織培養インサート（ポリエステル多孔質膜と、直径6.5ミリメートル、3ミクロンの細孔サイズ）を配置します。コー​​トインサートの管腔側表面<s> </s>一晩のラットコラーゲンで加湿した37℃のインキュベーター内のI（20μgの個/ cm 2、132μgの50μlの/ mlのコラーゲンのMilli-Q水中0.02％酢酸中のI（MQH 2 O））。残留酸を除去しMQH 2 Oで（反管と管腔側からの両方）を1回の挿入を洗ってください。 注意：脳の毛細血管の基底膜にはコラーゲンが含まれていない私が、主にラミニン、コラーゲンIV型アイソフォーム、ナイドジェン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン9。このため、一部の研究者は、そのようなより本物BBBモデリングのためのコラーゲンIV、フィブロネクチン13、またはマトリゲル（BDバイオサイエンス）16のようなコーティング剤を利用する。 </li></ol> 2.2。下側（反管）膜表面に播種SVGs <ol><li>インサートを反転し、静かに多孔質膜の縁の周りに弾性シリコンチューブ（「外部チューブ &quot;;〜10ミリメートル、長、8ミリメートル、内径、1.6ミリメートルの壁）の短い部分に合わせて、基本的によく反管腔側表面上に新しいを作成する（ 図2A）。 </li><li>挿入旧姓の下dsは、メディアの漏れを回避するために密封される。 プラスチック封止コーンと一端で封止さ、まず、（ 図2B;;約8 mmの長さ、3.2ミリメートル、内径1.6mmの壁「内部チューブ」と呼ばれる）シリコーンチューブからなるプラグ（ 図2Aおよび2B）を調製（〜3ミリメートル長い; 0.2ミリリットル、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）チューブの底部切断することによって調製し; 図2B）が 、 このコーンは、内部管腔を密封するだけでなく、インサートへの緊密な嵌合のためにその縁部を広げるだけでなく。それは、膜からのアップまで約1〜2ミリメートル（ 図2A）に達するまで、次の、滅菌ピンセットを使用して、管腔内、あらかじめ、その中にシリコン栓を挿入します。 </li><li>次に、200μlのSVG維持培地中に4×10 4 SVG細胞（播種それctionの上記1.2.2）直接でなく反管腔側膜表面上のシリコン（ 図2A）に変換する。 SVGsはインキュベーター内に少なくとも4時間、接着させる。 注：（他の上で倒立1プレートと、 図2C）2 6ウェルプレートの間で組み立てを挿入無菌輸送を維持するために、手順の間、フィルタリングされていない空気への曝露を最小限にするために。シリコーンチューブとプラグをエタノール中で洗浄し、後の使用のためにオートクレーブする。 注：のみ膜の細孔を持つインサート用プラグ（2.2.2項）を使用して、1ミクロンよりも大きいサイズ。 1ミクロン≤孔径を有する膜はほとんど漏れていないため、外部シリコンチューブ（セクション2.2.1）の試着のみを必要とする。また、コラーゲン以外のコーティング剤は、I（2.1項の注を参照）でも、3ミクロンの孔を通して漏出を防ぐことができます。経験的にこれを決定する。 </li><li>あなたの星状細胞の付着状態を監視するために、中に並列に播種アストロサイト細胞懸濁液の標準的な96ウェルの同一ボリューム。このウェルを6.5ミリメートルインサートと同じ表面積（0.33 cm 2）を有し、インサート膜よりも位相差顕微鏡による細胞の可視化を容易に可能にする。あなたがコントロール内のアストロサイトの十分な接着性を観察すると、96ウェル、アストロサイトが適切に挿入膜にも付着している。 </li><li>アストロサイトは十分にコントロールに付着した場合には、96ウェル、組織培養フードに挿入アセンブリを転送します（上記の注を参照）、静かに外付けシリコンチューブやプラグを外します。 800μL/ウェルのBEC維持培地（上記のセクション1.1.2）を含む供給ウェルに、通常の（ つまり直立）の向きに挿入を返します。 </li></ol> 2.3。アストロサイト上の管腔チャンバー内に前記下部電極の播種 200μl中シード2×10 4 BECはコラーゲンコート腔側表面上及びInSeにを返すインキュベーターにRTS。 2.4。共培養実験の前に培地交換せずにBEC培地中で3日間、SVG / BECシードの挿入を共培養。 3。人間BBBモデルを用いた実験（3日目） <ol><li>それぞれ、600μlの無血清BECは培地100μlで反管腔側とメディアを交換することによってin vitroでの BBB最初の洗浄細胞を刺激する。 </li><li>再び腔側媒体を吸引し、刺激剤との無血清培地100μlで交換してください。 注意：反管室の刺激が必要な場合（アストロサイトのコンパートメントからのin vitro BBBを活性化するために）、反管メディアを吸引し、刺激剤との無血清培地の600 ULと交換してください。 </li><li>管腔の刺激は、3×100μlのを必要とする、実行される場合、したがって（三連で、各実験群を試験する、我々は、再を希釈することをお勧め<html>ウェル間のピペット誤差を最小限に群あたり無血清培地を350μl）中のそれらの最終濃度に薬剤。 </li><li>前述したように、および/ ​​またはTEER 13,16,25の測定（後者のために我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合アルブミンを使用）標準傍細胞および/ ​​または標識トレーサー16,24の経細胞透過性アッセイを行う。 </li></ol>透過性（最大の％）=（ベースライン透磁率の変動を考慮するために、実験の間、（最大の透過性の基準となる）細胞を含まないコーティングされた挿入物および式を用いて、ビヒクル処置群に対する相対透磁率の変化を分析実験的なインサートの透過値 - ブランクインサートの車群の平均透過性値）/（透磁率 - ビークル群の平均透過性値）×100。 4。多孔質膜上での細胞の可視化NT &quot;&gt; コメント ：挿入膜上の未染色細胞は、膜が非常に不透明であり、光の透過を妨害するので、位相差や微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡によって観察することは困難である我々は上の細胞の種々の染色手順を開発し、この問題に対処するため。大幅膜上のセルの外観を向上させる。まだウェルズ、インサートに付属している。膜のみ取り付ける目的で、染色手順の終了時に削除する必要がある一般的には、挿入膜を染色挿入、。 4.1。ヘマトキシリン​​染色<ol><li> 20分間、リン酸緩衝化生理食塩水（130mMのNaCl、10mMののNa 2 HPO 4、10mMのNaH 2 PO 4、pH7.2のPBS）中の（w / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）の氷冷4％インサートを固定する。 PBSで一度洗浄します。 </li><li> 2分間0.1％マイヤーのヘマトキシリン​​液に挿入水没。 </li><li>優しくインを沈めることによって（水道水でインサートを洗う）水道水を含有する、穏やかに過剰の水をピペッティングビーカーにERT。希望の青色が発生するまで約20秒間スコットの水道水の溶液（2g / Lの炭酸水素ナトリウム、20グラム/ LのMgSO 4）に挿入を転送します。水道水（セクション4.1.3）で再度挿入を洗ってください。任意エオシン染色は、水道水洗浄、続いて10秒間、1％エオシン溶液にインサートを浸漬することによりここに導入することができる。 </li><li>挿入膜を空気乾燥させます。膜を除去し、明視野イメージングのためのガラススライドにマウントし（膜カッティングエッジの周り）メスを用いて 注意：ジ-n-butylphthalateinxylene（DPX）封入剤を利用する場合は、膜を除去してマウントする前にキシレンが続き、100％エタノールで挿入を洗う。 </li></ol> 4.2。走査型電子顕微鏡（SEM） <ol><li> 20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。 PBS中で3回洗浄する。 </li><li> W / V（1％の30分のための膜をポスト修正MQH 2 Oに）四酸化オスミウム</li><li>洗浄は、水（セクション4.1.3）に挿入し、エスカレートエタノール勾配（50％、70％、5分ごとに、90％、区間ごとに10分間、100％エタノールで、次いで3×）で脱水する。 </li><li>エタノール（1:2、その後5分間2:1）：ヘキサメチルジシラザン（HMDS）の混合物で脱水挿入を扱う。 </li><li>乾燥条件下では5分、空気乾燥して保存するため、100％のHMDSで挿入を扱う。 </li><li> （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去します。走査型電子顕微鏡により膜を調べる。 </li></ol> 4.3。免疫蛍光<ol><li>トリス緩衝生理食塩水（;フィルタリング50mMトリス-HCl pH7.6の、154のNaCl、0.22ミクロンTBS）で一度洗って、20分間、PBS中のPFA（w / v）の氷冷した4％のインサートを固定します。 </li><li>以前に26を説明したように、挿入膜上で細胞の免疫染色を行ってください。 </li><li> （膜エッジの周りカット）メスを用いて膜を除去してAGにマウント蛍光封入剤で少女のスライド。蛍光顕微鏡により膜を調べてください。 </li></ol>

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Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. 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Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

脳の病理への医学研究は、多くの翻訳困難を抱えている。急性虚血性脳卒中の領域では、例えば、動物モデルにおいて非常に有望であった多くの薬剤は、臨床38,39に失敗しました。これらの不本意な結果の理由は多様であり、人間のストロークシナリオおよび動物実験21から得られた結果の過大評価に前臨床試験システムの不倫が含まれています。臨床段階に前臨床調査結果?...

BBBは、末梢血液循環および脳止血の維持に決定的に責任が中枢神経系との間の特殊なインタフェースである。それは、機能的に脳内にしっかりと動的ゲートウェイを形成するために（下記参照）、いくつかの細胞性および無細胞成分によって影響される別個の脳微小血管内皮細胞（前記下部電極）を含む。生理的条件下でBBBは、脳内に、血液細胞、血漿成分と有害物質、すべての潜在的に神経毒性の通過を制限する。並行して、BBBを選択的に脳および脳正確に環境を維持するために、1,2の循環の間にキーイオンおよび栄養素（グルコースおよびアミノ酸）および代謝老廃物を交換する。近年、BBBの障害が神経変性または炎症関連疾患（ 例えば、アルツハイマー病およびmultiplのような慢性の脳の病理の多様で起こることが明らかになってきているEは3だけでなく、虚血性脳卒中4のような急性状態で）それぞれ硬化症。 脳内皮細胞（BECは）の固有のBBB特性は、主にそれらの脳環境5によって誘導され、特にアストロサイト6,7によってれる。これと同時に「神経血管装置」（NVU）と呼ばれるような周皮8、ニューロンとミクログリア1,3だけでなく、基底膜9、サポートBECはなどの他の細胞型、という機能ユニットを一緒になって成長して理解することがありますカップル彼らの供給毛細血管10への神経代謝要求。 病理学的状況でのBBBの関与は、BBB関連の研究11,12を支援するためにin vitro BBBモデルで開発する多くの試みの下にある。これらのモデルは、NVU原理に従って生体 BBB特性にできるだけ近くを模倣することを目指しています。 インビトロ </EM&gt; BBBモデルは、一般的に（、（主に牛13から、人間の14、ラット15、マウス16、およびブタ17,18起点）タイトジャンクションを形成する前記下部電極の単層上に多孔質膜上で培養し、一緒支えるアストロサイトに依存して広範囲にデリら 2005 11）によって検討。 星状細胞は、培養培地がまだ可溶性因子を介して前記下部電極16と通信することによって、（膜の上面上で培養）前記下部電極から分離されたウェルの組織培養の底面上に非接触状態で増殖させることができる。より良い生体内で BBBの解剖学的構造に似ている、より高度なモデルでは、アストロサイトが直接前記下部電極13,15,17（ 図1）に近接した膜の反対側に接触条件で培養で維持されています。この構成は、確立され、前記下部電極とアストロサイトとの間の物理的な接触を可能にするときアストロサイトプロジェクト多孔質膜を通って、そのプロセス。アストロサイトのエンドフィートは小さい細孔サイズ（ すなわち 0.4ミクロン）14,15を通過することができないため、重要なのは、発生する真の接触のための細孔は、直径1μmのを≥必要があります。注目すべきことに、コンタクトBBBシステムは、それらの経内皮電気抵抗（TEER）および種々のトレーサー13,17,18の内皮透過性値に関して、それらの非接触型対応物よりも優れていることがいくつかの研究で実証されている。メディアフローの追加の次元が最近、脳血管系12,19の近いシミュレーションに内皮にせん断力を加えるためのin vitro BBBモデルの数に追加されました。 コンタクトBBBモデルを生成する際に克服する一つの技術的な障害は、多孔質膜の反管腔側表面上の重力に抗して星状細胞の播種である。アストロサイトは、単に内の一番上のメディアの落下に播種した前回のプロトコル13,20、verted挿入、許される唯一の短い播種回適切な細胞の付着のためには不十分であることが私たちの手で発見された（ すなわち 、10分13または2時間20）。この基本的な方法を用いて、より長いアストロ装着期間は、特に、（温度、pH、湿度の変動を引き起こす）​​インキュベーターの頻繁な開口部によってインサートの常時監視を必要とし、また、孔を通る媒体の漏れに起因する不均一な細胞播種する傾向がある細孔場合が1μmよりも大きいが使用される。 ここでは、コンタクトBBBモデルの製造のための一般的なプロトコルを記載している。我々の手順は、上述の制限に対処反転インサート上の細胞播種のための代替の方法を含む。この方法は、長時間にわたって、平衡化したインキュベーター中、反管腔側膜表面上への星状細胞の乱されない付着を可能にする。その結果、星状細胞の均一な播種は、バリア品質を向上が達成されると挿入の間、基礎透過性の変動を最小限に抑えることができます。 ヒト細胞の使用は、人間が関連する研究21のために重要であるとして、我々は、さらに、この記事で初代ヒトBECは、新規な組み合わせの具体的な利用を実証し、ハイスループットスクリーニング能力との接触人間BBBモデルの確立のための人間のアストロサイトを不死化。多孔性膜上に細胞を観察すると、多孔質膜上に合流し、細胞形態の決定を補助することができる困難で、また我々の詳細を染色技術とすることができるからである。 BBB上 - 急性虚血性脳卒中のための唯一の治療選択肢となって血栓破裂酵素 - 最後に、私たちは私たち人間のBBBモデルは、組織型プラスミノーゲン活性化因子の影響（T-PA）を調べるために利用することができる方法の例である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

血液脳関門（BBB）は、しっかりと脳環境を制御する不透過性はなく適応脳毛細血管を含む。 BBBの障害は、臨床的に関連の研究を助けるために、インビトロ BBBモデルにおいてヒトの開発の必要性が生じ、多くの脳の病態の病因に暗示されている。これまでに説明した数々のBBBモデル、（フローなし）静的な中では、星状細胞および脳内皮細胞（BECは）は、多孔質膜の両側に共培養されたBBBモデルを連絡し、シミュレートするために、簡略化され、まだ本格的なシステムとして登場ハイスループットスクリーニング能力を有するBBB。それにもかかわらず、このようなモデルの生成は、いくつかの技術的な課題を提示。ここでは、一次ヒトBECはと不死化ヒトアストロサイトの新規な組み合わせを利用したコンタクト人間BBBモデルの製造のためのプロトコルを記述します。具体的には、詳細な反転インサート上の細胞播種のための革新的な方法だけでな​​く、inserを指定T染色技術と、我々は、BBB関連の研究のための我々のモデルをどのように使用するかを例示している。

人間を確立するために、BBBモデルに連絡し、我々は、内皮細胞14,15,27,28と接触するアストロサイトのエンドフィートの通過を可能にするために示され、3ミクロンの細孔径を有する多孔質膜上SVGsと前記下部電極を育成しなければならなかった。完全な接触モデルの概略図を図1（図示の左側）に示されている。コンタクトシステムによって提示された主要な技術的な課題は?...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K ビュー.  Monash University. 血液脳関門（BBB）のヒトモデルの確立は、BBBの障害に関連する脳条件の研究に利益をもたらすことができる。ここでは、多孔質膜の両側に、ヒト星状細胞および脳内皮細胞の共培養を可能に接触BBBモデルを調製するための改善された技術が記載されている。 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

生物工学

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

組織損傷を軽減するための新しい低侵襲スローインジェクション法

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

著者スポットライト:最小限の侵襲で新しい細胞注入法  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

浸潤の少ない新規細胞注入法

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...