Name: generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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この作品は、米国癌協会の研究学者グラント（RSG-12-148-01-DDC）とCIRM基本生物学賞（RB4-05779）supportedbyました。

ヒトの皮膚のプロトコールは、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校の研究倫理委員会のガイドラインに従って行いました。ヒトの皮膚は、廃棄された外科的サンプルから得られたか（スキンバンクは材料/機器表に記載されている）は、皮膚の銀行から購入することができます。皮膚が由来されている場所やドナーの年齢は限り真皮における基底膜領域タンパク質（コラーゲン/ラミニン）が分解されないように、実験には重要ではありません。 失活ヒト真皮の調製<ol><li>ヒトの皮膚を受信すると、（〜3-5分）を解凍し、組織培養フード内で組織を置きます。皮膚のサイズに応じて、滅菌使い捨て50mlコニカルチューブまたは125ミリリットル瓶で解凍組織を配置します。皮膚バンクからの皮膚の一般的なサイズは、0.75平方フィートです。 </li><li> 1×PBSで4倍のペニシリンおよびストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で、75％の完全な容器を満たします。激しく振ります5分とは、液体の処分。このステップを3回繰り返します。 </li><li>最後の洗浄後、新しいチューブ/ボトルに組織を転送し、コンテナの75％を埋めるために、新鮮な4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSを追加します。表皮と真皮の分離を可能にするために2週間、37℃の組織培養インキュベーター中でこの混合物をインキュベートします。 </li><li>無菌条件下で、真皮から表皮を剥がすために鉗子を使用しています。表皮は、ドナー（ 図1A）のレースに応じてカラーリングを持つことになりますしながら、真皮は完全に白です。ヒト組織に対処するための金融機関のプロトコルに従って表皮を廃棄します。 </li><li>チューブや瓶の中に真皮を置き、（4回5分間の洗浄）激しく振盪しながら1×PBSで希釈した4倍ペニシリン/ストレプトマイシンでそれを洗います。最後の洗浄後、使用する準備ができるまで4℃で4倍ペン/ 1×PBSで希釈した連鎖球菌およびストアに新しいチューブ/ボトルに真皮を転送します。真皮は今年まで4℃で保存することができます。 </li></オール&gt; 2.遺伝的に変更初代ヒトケラチノサイト注：初代ヒトケラチノサイトに感染するウイルスを生成するために、完全DMEM培地[DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン/ストレプトマイシン]中で増殖させた使用アンホトロピックフェニックス細胞。このようなGAG-pol及びエンベロープのようなタンパク質をコードするウイルスパッケージング遺伝子を安定的に、レトロウイルスベクターでトランスフェクトされた場合、ウイルス産生を可能にするフェニックス細胞ゲノムに組み込まれています。フェニックス細胞は、高いウイルス力価の産生を可能にする、高効率でトランスフェクトすることができます。この包装ラインから産生されたウイルスは、ヒトを含む哺乳類細胞の多種多様に感染することができます。 <ol><li> 1日目：トランスフェクションの前日、完全DMEM培地でも80万個の細胞の密度で6ウェルプレートでシードフェニックス細胞。 </li><li> 2日目：トランスフェクションの日には、ウェル当たりレトロウイルスベクターの3μgのを使用しています。アリコート1.5mlチューブへのレトロウイルスベクターの3μgの。 100μのミックスを使用します;リットルのDMEMを加えたベクトルのすべての3μgのためのトランスフェクション試薬の6μlの。 1.5mlチューブ中の100μlのDMEMでトランスフェクション試薬の6μLを混ぜます。 （使用されているレトロウイルスベクターは、装置/材料の表に記載されています）。 <ol><li> 5分間インキュベートし、レトロウイルスベクターの3μgのを含む事前に小分けチューブに106μlの混合物を追加します。混合し、室温で30分間インキュベートします。フェニックス細胞の各ウェルに、この混合物全体を滴下して加えます。 </li></ol></li><li> 3日目：トランスフェクションの翌日、フェニックス細胞から培地を除去し、新鮮な完全DMEM培地2mlのを追加。同じ日に、ウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに初代ヒトケラチノサイトをシード。抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）でケラチノサイト無血清培地（KCSFM）でケラチノサイトを維持します。 注：一次ヒトケラチノサイトを購入しました。細胞は、（材料/機器表に記載されている）、さまざまなベンダーから購入することができます。 </li><li> 4日目：ハー今ウイルス粒子を含む、トランスフェクトされたフェニックス細胞から培地を権利が確定します。注射器を用いて0.45μmのフィルターを通してメディアを渡します（任意の汚染フェニックス細胞を除去するため）、ケラチノサイトに2ミリリットルを配置（前日/ウェル75,000細胞で播種：ステップ2.3を参照してください）​​。感染過程を媒介するために役立つ培地にヘキサジメトリンブロミド（5μg/ ml）を加えます。ウイルス力価は、約1×10 7 TU / mlです。 <ol><li> RTで1時間、200×gで遠心分離で6ウェルプレートをスピン。スピンした後、ウイル​​スを含む培地を除去し、KCSFMを追加する前に、1×PBSで細胞を1回洗浄します。 </li></ol></li><li> 5日目：ステップ2.4​​のように再びケラチノサイトの同じバッチに感染します。 注：レトロウイルスベクターの選択マーカーがある場合、薬物を使用して、ケラチノサイトを選択して、下流の分析や、器官培養などのアプリケーションで使用するために展開します。 </li></ol> 3.器官皮膚の文化を設定します<ol><li>ビルド一般的な実験で見つかった物質またはカセットから器官カセットは、カスタム金属加工工場（ - F図2A）を介して行うことができます。 3.5センチメートル組織培養プレートからこれらのカセットを作るために3.5センチの皿（ 図2A-B）の蓋の中心から1.0センチメートルX 1.0センチメートルの正方形を削除するには、焼灼を使用しています。無菌条件下でこれを行います。 <ol><li>明確なマニキュア（ 図2C）を使用して、カセット（3.5センチの皿の蓋）の底部に正方形のペグを取り付けます。マニキュアのための5分を乾燥し、それが正方形のペグ（ 図2D）に載っているように、カセットを裏返しすることができます。 6cm皿にカセットを置きます。 注：スクエアペグは、芸術品や工芸品店の様々なから購入することができます。 </li></ol></li><li> 10％FBS、2.67 / mlのアデニン、40 N、ストレプトマイシン100μg/ mlの、66％DMEM、22％ハムF12、100単位/ mlのペニシリンからなるケラチノサイト増殖培地（KGM）を準備しますグラム/ mlのヒドロコルチゾン、10 ngの/ mlのコレラ毒素、4.94 / mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、1.36 ngの/ mlのトリヨード - L - チロニン、10 ngの/ mlのEGF、および10μg/ mlのシプロフロキサシン塩酸塩。使用する準備ができるまで4℃で0.22μmフィルターとストアを介してメディアをフィルタリングします。 </li><li> 4倍ペニシリン/ストレプトマイシン+ PBS溶液から真皮を取り、KGMで2回洗浄した後、使用前に2日間37℃でKGMでインキュベートします。 </li><li> 1.5センチメートルX 1.5センチメートルサイズの部分にメスを用いて真皮をカットして、器官カセットの上に置きます。上を向いて真皮の上部と真皮を置きます。真皮の上部には、ケラチノサイト（ 図1B）と接触する側になります。 </li><li> （ 図3A）を上に向け、真皮の上部側と器官カセットの角穴にプレカット真皮を置きます。 </li><li>鉗子を使用しての上に真皮を含む全体の器官カセットをフリップ（図3B）。氷上で細胞外マトリックス溶液を解凍します。カセットあたりの細胞外マトリックス溶液100μlを引き出すために、針と注射器を使用してください。真皮（光沢のある側）の底部に5滴を追加し、真皮（ 図3B）全体に均一な分布を確実にするために、わずかに振ります。 </li><li>商業細胞外マトリックス溶液で5分間は完全に（ 図3C）を固化することを許可します。固化した後、バックの上にカセットを反転するために鉗子を使用しています。 6cmディッシュにKGMの4ミリリットルを追加します。 </li><li>真皮（ 図3D）を含む器官カセット上に0.5から1000000遺伝子改変されたケラチノサイトを置きます。 <ol><li>トリプシン処理を、5分間、10cmのプレートに0.05％の4 mlのトリプシンを配置することにより、ケラチノサイトおよび完全DMEM培地4mlでクエンチしました。 </li><li>血球計数器を使用して、ケラチノサイトをカウントし、その後5分間200×gでスピンダウン。 90μで（利用可能なセルの数に応じて）0.5から1000000細胞を再懸濁しKGMのLと真皮にすべてのセルを配置します。 注：再生表皮の厚さに差が見られる任意の細胞数の開始の違いによるものではないことを保証するために、同じ実験内の真皮に同数の細胞を配置することが重要です。真皮に0.5未満万個の細胞を配置すると、貧しい階層と差別につながることができます。 </li></ol></li><li>一日おきに器官培養にKGMメディアを変更します。収穫組織真皮のケラチノサイトの配置後1-14日。表皮の完全な層化と分化は、通常は5日後に発生します。 </li></ol>

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ヒト皮膚器官培養における遺伝子操作は、一般的に、2D培養細胞だけでなく、マウスモデルを研究するために多くの利点を提供します。 2D培養物は、無傷の組織および器官に見出される三次元の細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス相互作用を欠いています。最近の研究では、一次ヒト皮膚腫瘍16にはるかに遺伝子発現の類似性を示す3次元培養細胞を用いた2次元および3次元培?...

ヒト表皮基底膜zone.Theの表皮として知られている細胞外マトリックスは、水分の損失を防ぐために、不浸透性の障壁としてだけでなく、保護するための最初の防衛線として機能するだけでなく、を介して基礎となる真皮に接続重層上皮であります外国と有害物質1から体。表皮の最も深い層である基底層は、表皮2の残りの部分を形成する分化した子孫を生じさせる上皮幹細胞および前駆細胞が含まれています。上皮前駆細胞が分化するように、それらは有棘層3として知られている分化した細胞の第1の層を形成するために上方に移動します。棘層では、細胞は、その後、表皮の分化した層のための物理的ストレスに耐える強度を提供する、ケラチン1および10の発現をオンにします。有棘層細胞は、さらに分化するように、それらはのために、表皮中で上方に移動ケラトヒアリンおよびラメラ顆粒の形成と同様に、原形質膜の下に組み立てられている構造タンパク質によって特徴付けられる顆粒層をメートル。細胞は、分化過程に進むように、ラメラ顆粒が細胞から押し出されているが、原形質膜の下のタンパク質は、クロス脂質豊富な障壁を形成するように互いに連結された角質層4と呼ばれます 。 上皮細胞の増殖および分化への影響の変化を伴う疾患人口の5〜20％。したがって、このプロセスのメカニズムを理解することは非常に重要です。これらの疾患の多くの症状は、細胞-細胞または細胞-マトリックス接触時に偶発的であることから、ヒトの表皮は、3D環境で再構成された器官培養物は、6月10日に作成されています。これらの方法は、典型的には、失活ヒトなどの細胞外マトリックス上に播種し、一次または形質転換ケラチノサイトの使用を含みます真皮、マトリゲル、またはコラーゲン。 上皮細胞の増殖および分化において重要な遺伝子調節機構を理解するために、ケラチノサイトを遺伝的に、2D培養での遺伝子ノックダウンまたは過剰発現するようにレトロウイルスベクターを介して操作され、その後、3次元で再構成することができます。これらの方法は、新生物11-21に表皮幹細胞および前駆細胞の自己再生および分化ならびに進行に関与する遺伝子を特徴づけるために広く使用されています。ここでは、レトロウイルスの使用を介して表皮器官培養物中の遺伝子発現を変化させる方法についての詳細なプロトコルが提供されます。

<table><tbody><tr><td>Human skin</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&quot;&gt;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amphotropic phoenix cell lines</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cautery</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 antibody</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>square pegs</td><td>Arts and crafts stores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>Cell Applications</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviral vector</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviral vector</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

器官培養物は、それらのin vivoでの組織の対応の機能および生理学を模倣する細胞-細胞接触および細胞-マトリックス相互作用のための3D環境の再構成を可能にする重要な。これは、忠実に表皮分化と成層プログラムを再現する器官型皮膚培養が挙げられます。初代ヒト表皮角化細胞は、遺伝子が容易に過剰発現またはノックダウンすることができますレトロウイルスを介して遺伝的に操作可能です。これらの遺伝的に改変されたケラチノサイトは、次に遺伝的経路に衝突上皮細胞増殖、分化、および疾患の進行を研究するための強力なモデルを提供し、皮膚器官培養におけるヒト表皮を再生するために使用することができます。ここで紹介するプロトコルは、失活ヒト真皮を準備するだけでなく、と遺伝的に器官皮膚培養を生成するために、初代ヒトケラチノサイトを操作する方法を説明します。再生した人間の皮膚はdownstrに使用することができますこのような遺伝子発現プロファイリング、免疫染色、及びハイスループットシークエンシングに続いてクロマチン免疫沈降などのEAMアプリケーション。したがって、これらの遺伝的に改変された器官、皮膚培養物の生成は、皮膚恒常性を維持するために重要である遺伝子の決意を可能にします。

器官人間の皮膚を生成する最初のステップは、真皮から表皮を除去することです。 37°Cの4倍でペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSの皮膚の2週間のインキュベーションは、表皮（ 図1A）から真皮の分離を可能にする必要があります。表皮と真皮を分離することは困難である場合には、別の週に4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBS中で37℃で組織を配置し、ピンセットを用いて再...

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K ビュー.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

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A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

がん研究

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

発生生物学

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

生物工学

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

鳥類胚性皮膚外植片培養プロトコルの包括的なレビュー

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

著者スポットライト:現在の実験的鳥類皮膚外植片方法論への洞察

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

要約

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黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

世代、大人の肌からプライマリヒト角化培養

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

2Dと3Dの肌の改善

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

要約

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黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

2Dと3Dの肌の改善

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

世代、大人の肌からプライマリヒト角化培養