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1。 0から2日間皮膚切開用オールド新生マウスを準備<ol><li>少なくとも20分間、CO 2チャンバーを用いた仔マウスを安楽死させる。解剖するまで最大1時間まで氷上に子犬のままにしておきます。古いマウスから調製した細胞は低い移植片収量がいる前駆容量を減らしているようにP0〜P2マウスを強くお勧めします。 70％エタノールの一皿（ステップ1.3）および洗浄溶液の3皿（ステップ3のために）皮膚切開を実行する準備を準備します。ディスパーゼソリューションを解凍し、4のままにしておく℃に子宮頸部は安楽死を確実にするために、CO 2露出オーバー後に子犬を脱臼。 </li><li>氷と無菌流フードへの転送上の培養皿に安楽死させた子犬を置きます。 </li><li>簡単に無菌培養皿に70％エタノールおよび場所に浸漬することによって、子犬を洗う。 </li></ol> 2。マウス皮膚を切開<ol><li>滅菌ハサミで胴体の付け根に各肢と尾を切り落とした。 </li><li> cuのペアの間にしっかりと身体を把握するrved鉗子基礎となる筋膜を貫通することなく頭からメスを用いて尾の背側の皮膚に沿って切り込みを入れる。 </li><li>慎重に持ち上げてマウスの正中線から皮膚の皮をむく。 </li><li>湾曲した鉗子の長辺でしっかりと露出してマウスを握り、マウスの後端に皮膚の下に湾曲した鉗子の別のペアを挿入し、ゆっくりとマウスの腹側半分に向かって腰の肌を引き出します。 </li><li>慎重に1滑らかな動きで完全にオフマウス皮膚剥離や死骸を捨てる。 </li></ol> 3。ディスパーゼソリューションで皮膚とインキュベートを洗う<ol><li>真皮側と洗浄液の最初の皿の中で皮膚を下に置きます。皮膚を広げてピンセットで撹拌します。次の皮膚を切開しながら洗浄溶液の第一皿に皮を残す。 </li><li>洗浄液の最初の皿の中で横に切開した皮膚を配置した後、洗浄液の第二の皿の前に肌を転送します。目でスキンを保つ電子第二洗浄液すべてのスキンが収集されるまで。最後の洗浄にスキンのすべてを譲渡、簡単に撹拌します。 </li><li>無菌10cmの培養皿に10mlの氷冷ディスパーゼを追加します。ディスパーゼソリューションに肌を転送し、皮膚真皮側を下にして平らにする。 </li><li> 4時8月16日時間のスキンをフロート℃（代替オプション：1時間、37℃）。 </li></ol> 4。別真皮と表皮<ol><li>新しい無菌培養​​皿に皮を転送し、皮膚真皮側を下にして平らにする。慎重にメスで1コーナーから真皮を押したままにします。 </li><li>ピンセットで表皮を握り、ゆっくりとはがし真皮から。表皮は1ピースとしてはがすべき。表皮は白と薄いであろうと真皮は、茶色がかった厚い、そしてゼラチン状である必要があります。 </li><li>独立した無菌培養皿に二つの組織を分離します。 <ol class="lalpha"><li>皮膚特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植を行うには、真皮を取るとトンと非常に小さい部分にミンチWOのメス。表皮を破棄します。感染症（ステップ7）の日に、レンチウイルスに感染した皮膚細胞と組み合わせて、新鮮な未処理の表皮細胞を調製するために、マウスの皮の別のセットを解剖する。 </li><li>表皮特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植を行うには、6に各表皮をスライス - 8小さなピースを。真皮を破棄します。感染症（ステップ7）の日に、レンチウイルスに感染した上皮細胞と結合するために、新鮮な未処理の真皮細胞を準備するために、マウスのスキンの別のセットを解剖する。 </li></ol></li></ol> 5。細分化した組織から初代マウス真皮細胞を（MDC）が解離する<ol><li> 1時間37℃で作りたてコラゲナーゼ溶液で皮膚片をインキュベートすることによって、MDCを解離する。子犬マウスあたりコラゲナーゼ溶液10mlを使用してください。 </li><li>優しく真皮を10分毎に含む溶液を混ぜる。顕微鏡下での解離の程度をチェックし、消化された細胞懸濁液は、主に単一細胞である必要があります。溶液は透明から曇りのように変更する必要があります真皮細胞は真皮から解離する。 </li><li>コラゲナーゼの活性を低下させるために10％の最終体積に真皮を含むコラゲナーゼ溶液にFBSを追加します。 </li><li>大型未消化塊と全体卵胞を除去するために新しい50 mlチューブに70μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。さらにコラゲナーゼを希釈するフロースルーの30ミリリットル当たりDMEM/10％FBSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>遠心チューブは、さらに全体の卵胞を削除する5分間卓上遠心機で30 xgで消化された真皮を含む。 </li><li>慎重に、新しい50 mlチューブに上清を移す。 5分間卓上遠心機で200×gで遠心分離することにより細胞をペレット化。 </li><li> DMEM/10％FBS（子犬あたり1ml）とカウント細胞と細胞を懸濁。プレート感染のAmniomax C-100メディア（ステップ7）を持つ細胞、または（ステップ9）移植用レンチウイルスに感染したKCと結合する。典型的な収量は子犬あたり20×10 6個の細胞である。 </li></ol> 6。プライマリケラチノサイトの関連付けを解除細分化した組織からの（KC） <ol><li> 15分間37℃で新たに解凍0.05％トリプシン-EDTAで表皮片をインキュベートすることによりKCを解離する。子犬マウス当たりトリプシン-EDTAの7ミリリットルを使用しています。 </li><li>表皮ごとに5分を含む静かに回してソリューションを提供します。 </li><li>トリプシンの活性を低下させるトリプシン-EDTAを含む表皮に中和溶液の等量を追加します。 </li><li> 5分間卓上遠心機で200×gで遠心分離することにより細胞をペレット化。残りの未消化の組織が上に浮くはずです。 </li><li>慎重に消化されていない組織で上清の大部分を取り除く。妨害することなく、細胞ペレットを10mlのピペットを用いて残りの上清を取り除きます。 PBSで細胞ペレットを再懸濁します。ケースKCSで完全にペレット化していない、上清の大半を捨て、細胞の大部分をペレットになるまで遠心操作を繰り返します。 </li><li>残りの組織または凝集塊を除去するために新しい管に70μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をこす。 </li><li>遠心分離により細胞をペレット化5分間卓上遠心機で200×gで。 </li><li> CNT-07メディアまたはPBS（子犬あたり1ml）とカウント細胞内で細胞を懸濁。感染細胞をプレーティングする（ステップ7）のためにCNT-07を使用し、（ステップ9）移植のためのレンチウイルス感染MDCSと結合するためにPBSを使用しています。典型的な収量は子犬当たり3から10×10 6個の細胞である。 </li></ol> 7。 shRNAまたはcDNAを含むレンチウイルスで初代培養細胞に感染感染の当日（ステップ9）移植当日のウイルスに感染した細胞と結合する、新鮮な未処理のプライマリKCSまたはMDCを準備するために、マウスのスキンの別のセットを解剖する。 <ol><li><ol class="lalpha"><li> MDCのため、プレート4×10で37 AmnioMAX-C100メディアインキュベートした10 cmのプレート当たり6 MDCS°C〜50％の細胞密度で翌日感染の+ 5％のCO 2。通常のMDCの3-4プレートは1片を生成するために使用されており、10月12日のプレートの合計は、1つの実験では3の移植片を生成するために必要とされています。あるいは、MDCがfを添付し、広めることができまたは37℃で2時間の最小℃+ 5％CO 2及び感染症の細胞播種の同じ日に行う。 MDCは線維芽細胞様の形態を持つことになります。 </li><li> KCのために、プレート12×10で37 CNT-07メディアインキュベートした10 cmのプレート当たり6 KC℃の翌日感染の+ 5％のCO 2。あるいは、KCは添付して2時間の最小値に対して広がる37℃+ 5％CO 2と同じ日に感染を実行できます。 KCの通常3から4プレートは、1片の生成に使用されます。 10月12日のプレートの合計は、1つの実験のための3つの移植片を生成するために必要とされています。 KCSは、石畳の形態を持つことになります。 </li></ol></li><li> 37℃で8μg/ mlのポリブレンソリューション℃+ 5％CO 2で5〜10分間細胞をPreincubate。 </li><li>交換媒体とレンチを追加するには、[+ 8μg/ mlのポリブレンソリューション。レンチウイルス力価は、構築に使用され、感染する前に決定されるべきであるに応じて異なります。 </li><li> 32℃で1時間卓上遠心機で200×gでプレートを遠心°;レンチウイルスで細胞を感染させるために、C。 </li><li>レンチウイルス含有培地を取り除き、新鮮な培地を追加します。 KCは、新鮮な培地を添加する前に戻ってPBSで一回細胞を洗浄する。通常、感染した細胞は37℃で±5％のCO 2を一晩回復。あるいは、移植片のために細胞をトリプシン処理前℃+ 5％のCO 2で37回復の少なくとも2時間を可能にします。代表的な結果セクションで説明したように、感染効率を確認するために、培養感染細胞の小さな部分に進みます。 </li></ol> 8。グラフト感染した細胞を準備する<ol><li>手順4〜6を使用して皮膚からの新鮮な一次MDCSまたはKCSを分離します。氷冷滅菌PBS中に再懸濁します。細胞をカウントする。 </li><li><ol class="lalpha"><li>皮膚特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植のために、8分間37℃で0.05％トリプシン-EDTAを用いてプレートから感染したMDCを解離する。 </li><li>表皮特異的な遺伝子ノックダウン/過剰発現は移植のために、プレートUSIから感染KCを解離で、37 ngの0.125パーセントトリプシン-EDTA℃で15分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> DMEM + 10％FBS（MDC）がまたは中和溶液（KC）を使用して、トリプシン活性を中和する。 50mlチューブにトリプシン処理した細胞を移す。 </li><li> 5分間卓上遠心機で200×gで遠心分離することにより細胞をペレット化。 </li><li>氷冷滅菌PBS中に再懸濁します。細胞をカウントする。 </li><li>作りたての未処理相手細胞型とウイルスに感染した細胞を兼ね備えています。 1グラフトは、4℃で氷冷滅菌PBSおよびペレット卓上遠心機で細胞スラリーで7から10×10 6 KCSと7月10日×10 6 MDCを組み合わせる50〜100μlの氷冷滅菌PBSに細胞を再懸濁する。 nu / nuマウス室は準備が整うまで、氷上で細胞を維持。 </li></ol> 9。 nu / nuマウスの背面に創傷床とFix商工会議所を作成移植前日に、70％エタノールに浸漬することによって、オートクレーブ滅菌したシリコン室と手術器具を滅菌する。 70％ETHAを交換チャンバーを使用する前に滅菌PBSでNOL。 <ol><li>腹腔内注射（100μl/10g体重）または他の好適な方法を介して、ケタミン（8 mg / ml）を/キシラジン（1.6 mg / ml）を用いて麻酔nu / nuマウス（7-12週齢の雌）。眼潤滑剤を適用します。マウスの下に加熱パッドを配置します。 </li><li>ヨウ素でヌードマウスの背部皮膚の消毒、アルコール綿棒で清掃してください。 </li><li> 1-3局所切開部位に0.25％Bupivicaineをドロップに追加します。ピンセットで首の付け根にヌードマウスの背部皮膚をつまむ。 </li><li>滅菌ハサミで挟ま皮膚の小さな円形の穴（直径約1cm）を切り取ります。 </li><li>創傷床の上に無菌室を置き、周囲の皮膚とチャンバーの縁をカバーしています。 </li><li> 図2Aに示すように、チャンバの縁に沿って縫合（チャンバーあたり6ステッチ）に近い場所にセキュア室。 </li><li>室の準備ができている、優しくスワール細胞スラリーと1mlのシリンジに取り付け23ゲージの針に策定する。細胞スラリーは優しく、下部に凝縮されている場合針に描画する前に1ミリリットルピペットチップで再懸濁する。 </li><li>穿刺針を有するチャンバとゆっくり傷口に細胞を垂れる。 </li><li>クリーン、オートクレーブしたケージにマウスを置きます。ハウスケージあたり2マウスおよび水を飲むには、抗生物質やタイレノール（3 mg / ml）を加える。我々の経験では、ケージあたり2匹の雌マウスは、チャンバ、グラフト、または動物に有害な外傷をもたらしていない。 </li><li> 2分の1ケージの下温暖化パッドを置き、麻酔が切れるまでマウスを観察します。 </li></ol> 10。 7-9日後チャンバーを取外す<ol><li>ステップ9.1のようにチャンバーnu / nuマウスを麻酔。眼潤滑剤を適用します。 </li><li>ヨウ素とチャンバー周りの皮膚を消毒し、アルコール綿棒で清掃してください。 </li><li>慎重にステッチをカットし、チャンバから取り除く。 </li><li>優しくマウスからチャンバーを取外す。室に新しい皮膚移植スティック場合は、鉗子を用いてチャンバからチャンバの一部と優しく別個移植を持ち上げます。チャンバーの取り外し作業中には、移植を押したままにします。グラフトはトイレべき図2Bのようにkの鈍いと不透明。 </li><li>カチッと開いた傷口や縫合糸（2ステッチ）に対する抗生物質の薄膜と非接着パッドを適用します。 </li><li>パッドを固定し、傷口を保護するために、マウスの周りに包帯を巻きつけます。所定の場所に包帯を縫合。 </li><li>シリコン室は、薄い中性洗剤で洗浄することにより洗浄し、徹底的に脱イオン水で洗浄する。一晩70％エタノールでチャンバー、空気乾燥しており、店舗を浸す。 </li></ol> 11。毛の成長のためのマウスを調べ<ol><li>チャンバー除去の3日後に包帯やパッドを取り外します。移植片は乾燥して褐色に不透明でなければならない。 </li><li>髪の成長のために定期的にマウスを確認してください。髪は移植後16日目に表示するように開始する必要があります。 </li></ol>手順の概要 1日目は（2〜3時間）、生まれたばかりの子犬を生け贄に皮膚を除去し、4℃で一晩ディスパーゼに残す。 2日目（2〜3時間）：皮膚から初代培養細胞を分離し、推奨細胞密度でプレート。 3日目（3〜4時間）：レンチウイルスで細胞を感染させる。生まれたばかりの子犬の別のセットから皮膚を除去し、4℃で一晩ディスパーゼに残す。 4日目（6-8時間）：皮膚からの初代細胞を分離し、数えて、氷の上に残す。トリプシン処理し、遠心分離によりレンチウイルスに感染した細胞を回収し、カウントし、移植あたりのPBSを50から100μLに7から10×10 6真皮細胞及びケラチノサイトを兼ね備えています。マウスの創傷床を作成し、チャンバーを取り付け、床に傷を細胞混合物を適用します。 代替手順のアウトライン代替手順のアウトラインは、4日から3までの手順を短縮することができます。 <ol><li> 1時間（予定時刻5から7時間）37℃でディスパーゼでマウスの皮を処理することにより、1日目​​と2日目を兼ね備えています。 </li><li> 2時間めっきセル（推定時間5月7日時間）後にレンチウイルスで細胞を感染させることにより、2日目と3日目を兼ね備えています。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

髪の再構成アッセイは、de novoの毛包形成のメカニズムを調べるためのユニークな臓器再生のモデルを提供します。ここでは、毛包形成における遺伝子の機能を決定するために有用で修正されたチャンバー髪アッセイを説明します。我々のアッセイは、我々はどちらかの真皮または表皮の細胞型において遺伝子の過剰発現またはノックダウンを達成するためのレンチウイルス発現技術を導入するために変更された報告室ヘア再構成アッセイ5、6,11、に基づいています。我々のアッセイは、組織特異的遺伝子ノックアウトを生成するために迅速な代替手段を提供します。このアッセイは、私たちは移植コレクションにレンチウイルスで初代細胞を感染から、わずか3週間で毛包形成における遺伝子機能を発揮することができます。我々のアッセイが1つの細胞型12にレンチウイルスによって組み合わせのshRNA / cDNAの配信を使用して遺伝的相互作用に対処するために拡張することができるだけでなく、真皮と表皮細胞の代表値との間のシグナリングの検査を可能にするES。 微妙な欠陥が観察しにくいですしながら私たちの髪アッセイは最高の、毛包の再生に強いゲインまたは機能喪失表現型を検出するのに適しています。我々は正常に私たちの毛髪再生アッセイ1,12を使用していくつかの遺伝子の真皮の特定の遺伝子の機能を明らかにした。 GFPマーカーに基づいたshRNAの10を発現するレンチウイルスベクターからの共発現は、ドナーの皮膚細胞を発現shRNAが再生された毛の移植に固執していることを実証した。 GFP陽性細胞は、再生毛包の毛乳頭（DP）（ 図3）で存在していた。細胞はGFPのさまざまなレベルを表現したのであるDP細胞はおそらく遺伝子ノックダウンの異なるレベルから成っていた、このように観察された毛包の表現型はnullに遺伝わい小体型の範囲であった。 このアッセイのための1つの改善はgraftin前に高shRNAを発現する細胞のための迅速かつ効率的な選択を確立することであろうグラム強いGFP発現細胞を精製するためにFACSを使用するなど。代替案は、このアッセイ9に変異または条件付きノックアウト細胞を置き換えることです。一次皮膚細胞は継代培養された後DPの効力が徐々に失われるので、一方に、DP細胞機能を維持することができる培養システムは非常に便利です。潜在的な培養システムは、人工ニッチまたは集約文化2,7,8,13由来生体材料の使用が含まれる。もう一つの改善点は、これは皮膚固有の損失またはで新鮮ケラチノサイト生成する仔マウスの第2のセット（ステップ7）の使用量を削減するように高い細胞回収率を持つ信頼性の高い表皮細胞凍結法の利得のを生成することになります機能研究。 髪の成長がやや少ない同期化され、卵胞の向きがよりランダムですが、このチャンバー髪アッセイは、毛包の密度と通常のマウスの皮膚と同様の品質を生成します。毛髪再生遺伝アッセイ含めたいくつかの制限電子レンチウイルスと細胞数の大量の要件、そして、それはそのようなパッチやフラップアッセイ3,4,14など髪の再構成アッセイの他の形態に比べて外科的方法の面で非常に集中的な労働である。しかし、髪の成長を検出するために毛包とタイムラインの品質は他のアッセイ4よりも優れています。私たちのターゲットと毛髪再生アッセイは、既存の遺伝的モデルへの迅速かつ便利なコンパニオンを提供しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td>セルNテック</td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td>インビトロジェン</td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100の補足</td><td>インビトロジェン</td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプ1 </td><td>シグマ</td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11から999 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 10から275 </td><td>湾曲した</td></tr><tr><td> Scalpal </td><td>メデックスサプライ</td><td> GRF-2975＃10 </td><td>サイズはありません。 10 </td></tr><tr><td> 70μmの細胞染色装置</td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15mlコニカル遠心管</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14から959-49D </td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23ゲージの針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14から821-13F </td><td></td></tr><tr><td>瞳の潤滑剤</td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-lodineスワブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td>シリコンチェンバース</td><td>レナー社</td><td> F2U、30268 </td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td>柔軟性のある包帯</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td>非接着性包帯</td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 材料 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 洗浄液 PBS 500μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン 12.5μg/ mlのファンギゾン 100μg/ mlのゲンタマイシン ディスパーゼソリューション HBSS 2.5 mg / mlの最終ディスパーゼ 100μg/ mlのゲンタマイシン 中和メディア HBSS 15％（v / v）のFBS コラゲナーゼ溶液 0.25％（w / v）のコラゲナーゼ、タイプ1 ontent &quot;&gt; 100μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン 2.5μg/ mlのファンギゾン 50μg/ mlのゲンタマイシン ポリブレンソリューション HBSS 8μg/ mLで（w / v）のポリブレン</td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

毛包の形態形成、上皮由来ケラチノサイトと基礎の間充織間の相互作用を必要とする複雑なプロセスは、器官形成および組織特異的シグナル伝達を研究するための魅力的なモデル系である。毛包の発達は、遺伝的に扱いやすいですが、このプロセスのための本質的な要因を迅速かつ再現性の分析が課題として残されている。ここでは、ターゲットに過剰発現または組織特異的にレンチウイルスを用いた要因のshRNAによるノックダウンを生成する手順について説明します。毛髪再生モデル5、6、11の修正版を使用して、我々は、毛包の形態形成につながる上皮間葉シグナル伝達経路の研究を促進するために、堅牢なゲインまたはプライマリマウスケラチノサイトや真皮の細胞における機能喪失型の分析を実現することができます。我々は、レンチウイルスcontaiを届ける、毛乳頭細胞やその前駆体を含む新鮮な一次マウスケラチノサイトおよび真皮細胞を分離する方法について説明し細胞集団の一つにshRNAまたはcDNAのどちら寧、およびヌードマウスの背中に完全に形成された毛包を生成するためにセルを結合します。このアプローチでは、三週間以内に、毛包を生成するために必要な組織特異的な要因の分析を可能にし、既存の遺伝モデルに迅速かつ便利なコンパニオンを提供しています。

図1に我々は、3週齢回生毛移植では、平滑化（SMO）、重要Shhのシグナル伝達成分の経皮特有のレンチウイルスshRNAノックダウンの結果を示す。単独でレンチウイルスベクターを用いて、制御グラフトは堅牢な髪の成長（ 図1A）を示しています 。髪の成長の損失Smoの結果とは対照的に、皮特有のノックダウン（ 図1B）。ヘマトキシリン·エオシン染色は、対照群と実験条件における毛包の段階（ 図1C、D）を示しています。同様の治療から髪の成長の表現型は、レンチウイルスベクター単独感染陽性コントロールを含む、実験間で可変することができます。したがって陽性対照の移植は常に移植片の30％が瘢痕化や移植片の不完全な添付ファイルの結果として失敗することがありますように、基準として全ての実験に含まれるべきである。再1因子のcDNAを過剰発現しているような、2つの因子間の相互作用をテストする場合は、別の要因のSCUEのshRNAによるノックダウン、1つは常に単独グラフトマニフェストにノックダウン、各実験における機能喪失型の結果を含める必要があります。これは、特定の遺伝子が、毛包の再生経路を乱す方法と、2つの遺伝子がどのように相互作用するかを決定するために必要な範囲を提供します。 チャンバー（ 図2A）の除去は慎重に行わなければなりません。新たに形成されたグラフトは鈍い面（ 図2B）とわずかに不透明でなければならない。移植は、移植片が創傷床に接続されたままで確認することが重要ですので、そっと片側を持ち上げると、チャンバに固執することがあります。グラフトは3日後にはかなり安定していて、ドレッシングを取り外すときに少し難しさを提示しなければならない。堅牢な髪の成長は、3週間後（ 図2C）後に観察されるべきである。 MDCSまたはKCSのどちらかを省略すると、任意の毛（ 図2D）11なしで回復した創傷部位になります。のいずれかで、細胞死や細胞の喪失図1Bに示すように、細胞の種類も真皮Smoのノックダウンの減少毛髪再生とは対照的に、無毛をもたらす。 成功したアッセイを確保するためには、移植する前に、適切な過剰発現またはノックダウン効率が90％以上の細胞のウイルス感染を達成するために重要です。移植手順の時間的な制約のために、我々は移植実験を開始する前に、トラブルシュートはウイルス感染効率を推奨し、常に損失または利得の発現を確認するための手順を移植当日に細胞の小さな部分を保存します。レンチウイルス力価は、構築物に使用され、90〜100％の効率を達成するために、感染する前に決定されるべきであるに応じて異なります。我々は、レンチウイルスベクターからGFPを共発現させ、ウイルス感染効率を監視する。我々は日常的に定量PCRおよび/またはウェスタンブロットを行うノックダウンまたは過剰発現の程度を決定する。ラベルを付けるために蛍光タグでデュアル発現ベクターを利用したウイルス感染した細胞シグナルと成熟した移植片で私たちの構築物を発現する細胞の数のperduranceを報告するための方法を提供します。我々は、SMOのshRNAとの組み合わせでレンチウイルスベクターpSicoR-CMV-GFPを10からCMVプロモーターによって駆動されるGFPを使用しています。 図3では、我々はGFPを代表する毛包の毛乳頭にlentivirally発現されている3週齢皮膚固有の移植を示す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> 図1。毛包の成長の組織学的分析（A）空のレンチウイルスベクターおよび未処理ケラチノサイトに感染して皮膚細胞と制御毛髪再生グラフトの表示（B）平滑ノックダウンは、毛包の損失未処理ケラチノサイトの結果と組み合わせて真皮の細胞にレンチウイルスshRNAを用いた。 （C）はヘマトキシリン·エオシン染色は、成長期毛fを示していますコントロール移植片におけるolliclesは真皮に分け拡張し、（D）は平滑ノックダウン毛包がいじけたままで、大部分は不在。すべての画像は、3週間後に移植されています。スケールバーは100μmを表します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> 図2。初代細胞を移植。縫合チャンバハウジングプライマリー真皮細胞とケラチノサイトとの（）nu / nuマウスは、（B）室の除去は、文字に鈍いと不透明で、新たに形成されたスキンを公開しています。野生を使用して移植に（C）が十分に成長した毛移植後3週目で一次真皮細胞とケラチノサイトを入力します（D）はケラチノサイトせず、一次皮膚細胞を添加すると、3週間後に無毛につながる。同様の結果は、真皮細胞のない一次ケラチノサイトを加えて見られている。 図3。 3週齢の再生された移植片から毛乳頭の乳頭におけるGFP発現のメンテナンス。共焦点画像。 GFPは、レンチウイルスベクターから真皮の細胞集団に発現し、真皮乳頭（緑）で検出された。バーシカン（赤）が毛乳頭と核はヘキスト（青）を持つラベルであった境界が設定されます。 （注）GFPは真皮細胞ではなく、周囲のケラチノサイトに特異的に発現されています。スケールバーは20μmを表す。

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  Stanford University School of Medicine. ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。

ビデオ: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

成体マウスから海馬歯状回の解剖

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

生物学

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

頭蓋顔面の開発時には外胚葉上皮のシグナリング特性を評価する

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ<emジャポニカ> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

グレースケール解析を用いたマウスの抜け毛の定量分析のための新たな手法

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...