仕事はR01のDC 011582（AK）とRO1 DC011555（DJT）によってサポートされていました。

<ol><li>ガラス電極を引くガラス電極を引く<ol><li> シングルバレル電極を引き出します。フィラメントとキャピラリーシングルバレルガラスを使用して測定されるように約1〜2メートル、10〜12 mmのシャフトの長さ、約12 Mohmを（範囲5月20日Mオーム）の対応する電極抵抗の直径に先端を引っ張る0.9％NaCl溶液インチ下部電極抵抗はもっと背景活動になると個々のニューロンから単一の活動を単離するため、より困難になります。この電極を引っ張るため、加熱フィラメントまたは加熱コイルのいずれかで水平または垂直プラーのいずれかを使用します。 </li><li> multibarrel電極を引き出します。multibarrelガラスのはるかに大きな直径と全体multibarrel周りに均等な熱分布の必要性のために、より大きな直径の加熱コイルではなく、加熱フィラメントとの強力な引き手が必要とされている。 multibarrelピペットはnで加熱フィラメントの中心に挿入しなければならないoは、加熱コイルにご連絡ください。ほかに5バレルピペットは、ここで説明することに注意し、3バレルまたは7バレルピペットは、市販の選択肢です。約10マイクロメートル径の合計、以下のピペットの先端にガラスを引き出します。先端が次のステップで正しい直径に壊れていますので、正確なサイズのチップは長く、比較的薄くすべきである電極先端の全体の形状、より引き上げ工程中にそれほど重要ではありません。所望の電極先端形状については、 図1Cに画像を参照してください。非常に長くて細い電極形状（ 図1A）が曲がってしまい、したがって、それは難しい正しいに電極チップを壊すことになりますが、短いと太くて短い電極形状（ 図1B）は 、脳内に進め、組織の損傷のかなりの量が発生します直径（ステップ2を参照）。 </li></ol></li><li>電極チップを修正電極チップを変更します。 2つの電極が一緒に接着する前に、、彼らが変更されなければならない。単一電極のシャフトは、それが完成したピギーバック電極の複合シャフトはできるだけ薄くあることを確認するためにmultibarrelに取り付けることができる前に曲げることが必要です。さらに、multibarrel電極の先端はイオントフォレーシス用低抵抗を確保するために破談にする必要があります。 <ol><li> 約20度で、シングルバレル電極のシャフトを曲げてください。可能な限り最小のブンゼンバーナーの炎を使用してください。標準ラボ供給会社からの典型的な &quot;小さな&quot;ブンゼンバーナーは、このアプリケーションのためにはるかに大きすぎる炎のサイズを作成します。この問題を回避するには、最小の商業ブンゼンバーナーを使用して、バーナーの上部に注射針を（〜18ゲージ）を確保し、歯科用セメントを使用して接続をシールします。動作させた場合、火炎は、直径が5mm以下程度であり、背の高い約8mm、参照してくださいすることは困難である必要があります。部屋の中の空気の動きはその炎を消すので、それは内にバーナーを操作することをお勧めします密閉された部屋や、風の盾を使用する。約20度でそれを曲げるために炎を介して単一のバレルの電極を移動します。バーナーの炎が離れて電極先端から約10ミリメートルでの遷移領域でガラスを溶融することを目指している。先端が下向き、我々は電極が約45度で開催されることを示唆している電極の先端を溶融回避し、比較的早く炎を介して電極を移動します。 </li><li> multibarrel電極の先端を折ります。電極先端を破壊しながら視覚的なコントロール性を確保するために、最小の10倍の対物レンズと10倍の接眼レンズと顕微鏡を使用しています。眼球に挿入さ測定スケールもチップサイズを測定するために必要とされる。プレキシガラスの端が顕微鏡の視野の半分に約3分の1に見られるような顕微鏡にプレキシガラスの部分を取り付けます。我々のケースでは、プレキシガラス片は25×70 mm、厚さとカ​​スタムに確保できるねじを介して接続されている約5mmである顕微鏡ステージでスレッドを作った。それは、プレキシガラスは独立スライドの移動を可能にする設計を持つことが重要です。スライドガラス上の粘土の床でmultibarrel電極を置き、顕微鏡ステージのスライドホルダーに電極を含むスライドを挿入します。顕微鏡ステージのXYマニピュレータを使用して、静かにプレキシガラスピースに対する電極チップを移動させ、顕微鏡の接眼レンズを通して先端の破壊を観察します。きれいに約25から35マイクロメートルの累積径にmultibarrelの先端を破るしようとします。でこぼこの休憩では大きすぎる、またはヒントを絶った先端径のピペットを破棄します。我々は、望ましくない先端形状に起因する当社multibarrel電極の約30％を捨ててください。 </li></ol></li><li>ピギーバック電極を組み立てるピギーバック電極を組み立てます。 <ol><li> 位置電極は。顕微鏡ステージからステップ2.2で使用プレキシガラスピースを削除します。完了確保スライドガラス上に粘土にmultibarrel電極、若干上向きの先端。上向き、ステップ3.2、2つの電極の接着のために重要であろう。上向きのヒントは接着剤が接着電極チップを避けて、先端から離れて実行させる。カスタムメイドのマイクロマニピュレータ（ 図2）の電極ホルダに曲がったシングルバレル電極を挿入します。 multibarrel電極の上にシングルバレル電極を下げ、まず視覚的なガイダンスを使用して、次に顕微鏡指導。単一電極は約5〜10マイクロメートルでmultibarrelチップの先端を突き出し、その先端で、5バレルの配置によって形成された溝に直接引き下げるべきである。シングルバレルを下げる際に、密接に二つの電極の間に形成される角度を観察します。最善の結果のためのヒントがバラバラ互いに指すのではなく、その先端と完全に平行あるいはマルチの上に単一の電極を低くしようとする任意の角度を避ける非常にわずかな &quot;くさび&quot;配置を形成する第1 multibarrelに触れる。シングルバレル先端は非常に柔軟であるので、それは先端がマルチバレル電極の上面に達した後、単一の電極を内蔵バネ作用量が少ないクリーンな複合チップを形成、さらに少し低下したときに曲がりますそれは一緒にヒントを保持するのに役立ちます。ただし、単一のバレルとmultibarrel電極との間の角度が急峻すぎる場合（くさびのあまり）、バネ作用が高くなりすぎると電極配置を下向きに曲がります。 </li><li> 結び付ける電極シャフト。のり一緒に2つの電極のシャフトを使用してシアノアクリレート（瞬間接着剤）。グルー·ドロップフラットつまようじとタッチ電極アセンブリの小さな側へ接着剤の小滴を配置します。ヒントの最も遠位の位置から開始し、徐々に電極先端に向かって極軸に沿って接着剤のドロップとつまようじを移動します。あまりにも多くの接着剤を使用して、または糊トンを適用電極チップにオブジェクト指向に近い、少なくとも部分的に機能しない電極をレンダリング、接着電極の開口部をもたらすでしょう。 </li><li> 歯科用セメントとの合弁安定させる。小さな使い捨てのプラスチック製の皿の中に歯科用セメントと歯科用アクリル少量のミックスやフラットつまようじを使用して、ボートの重量を量る。セメントは成形可能になるまで待ってから、ジョイント（ 図3のピンクの材料）を安定化するために2つの電極間の接合部に少量を適用します。約15分間乾燥させます。 </li><li> 電極を取り外し、保管してください。慎重完了ピギーバックマニピュレーターホルダーから第1電極を除去した後、スライドガラス、及び防塵容器内のストアから切り離す。 </li></ol></li><li>電極塗りつぶし溶液を調製電極フィル溶液を調製する。イオントフォレーシスは、荷電分子を必要とするので、ほとんどのエージェントは、通常、酸性またはアルカリ性の環境（のどちらかで溶解しなければならないそれぞれtaは、約3から4のpH、または約8-10のpH）。多くの場合、イオントフォレーシスで使用されている化学物質の数は、 表1に記載されています。表に記載されていないエージェントの場合、それは分子が帯電した保つために、酸性またはアルカリ性の環境で分子を使った方が簡単な場合、それに応じて溶解するであろうかどうか、pKa値から決定する。最良の結果を得るには、毎日新鮮なすべてのソリューションを混ぜる。 </li><li>記入し、電極を準備記入し、電極を準備します。シリンジフィルターとシリンジに取り付けられた34ゲージの針 - ちょうど電極を使用する前に、炭素繊維28を用いて、それぞれの薬剤と各バレルを埋戻し。バランスバレルとして選択薬と5-バレル構成の4アウターバレル、および3M NaClを中心バレルを記入してください。同様に、3M NaClでシングルバレル記録電極を埋める。そのような速いグリーンまたはフェノールレッドとして、NaCl溶液に色素を追加すると、それが簡単に電極チップを見ることになります脳表面に電極の配置中。録画設定の電極ホルダーに電極を挿入し、適切なガラスバレルにすべてのワイヤを挿入します。断熱材の約1cmの先端に除去された絶縁された銀線を使用しています。 multibarrel電極（4薬物バレルと1バランシングバレル）に加え、記録シングルバレル電極に挿入する必要があるアンプ線用5線があるはずです。 </li><li>イオントフォレーシス用ポンプモジュールの電源をオンにイオントフォレーシス用ポンプモジュールの電源をオンにして、すべての樽をテストします。各ポンプモジュールの電極テスト機能は、電極バレルが機能しているかどうかを判断するのに役立ちます。使用しないときは、分子電荷と反対極性の保持電圧を印加する必要があるときにバレルからの薬物の漏出を防止する。 </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus.">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li><li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li><li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus.">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li><li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus.">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li><li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat.">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li><li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons.">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li><li>Nataraj, K., Wenstrup, J. 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特別な利害関係は宣言されません。

実験操作中に、ニューロンの応答の記録を可能にすると同時に、我々は、in vivoでの単一ニューロンのマイクロ回路の操作を可能にする手法を説明します。神経回路がシナプスのアゴニストおよびアンタゴニストのiontophoreticalアプリケーションを介して操作されます。圧力駆上トフォレーシスの主な利点は、イオントフォレーシスは、神経組織への電極からの流体の物理的な動きを必要としないということです、したがって、印加された圧力や流体体積を通して組織の損傷を引き起こす心配がありません。この手法の主な制限は、組織内の絶対的な薬物濃度、および組織の影響を受けたボリュームに関する情報の欠如である。イオントフォレーシスと排出薬理作用のある物質の量ははるかに小さいですし、圧力排出よりもはるかに正確に制御できるので、しかし、、薬物アプリケーションからの回復がはるかに速く、典型的にはdははるかに完全な。 Microiontophoresisが正常神経系、感覚と他人の数が使用されており、ほとんど、あるいはまったく本質的な処理をする脳領域で最も正常に適用されています。その理由は、排出薬剤のいくつかが適用部位から隣接ニューロンに拡散し、また、隣接ニューロンの応答特性を操作することができるということです。 シングルおよびマルチバレル電極の別の製造は任意と無関係のプロパティを持つ電極の組み合わせを可能にします。一緒に電極バレルを引っ張ってくるとイオントフォレーシスの目的のために記録し、いくつかのいくつかを使用すると、電極の先端が、いずれかの薬物のアプリケーションに対して単一細胞記録には大きすぎる、または小さすぎるであろうと、このような非常に類似の特性を有する電極チップを生産するでしょう。また、単一のバレル先端を持つことは約20マイクロメートルでmultibarrel電極先端を越えては大きく、録音でノイズを低減dは、ニューロンの発火3の保持または放出電流から可能交絡電流の影響を排除します。 ピギーバックmultibarrel電極は第4月6日 30年以上前に記載されており、神経回路7から18 19から29を解剖することは非常に成功裏に使用されていることにより、 それ自体の方法は小説やユニークではありません。しかし、電極の調製および使用の特定の詳細は、長年にわたって変更されており、ここで説明する一連の指示は、特に簡単で成功することが証明されていて、他の場所で文献に詳細に公開されていません。シングルバレルの突出であり、特に、シングルバレル電極先端の曲がりは、ピギーバックの最後のヒントは比較的スリムされる電極（ 図3）、その結果、脳への最小限のダメージとの深い核からの録音を可能にすることができますマルチバレル電極上に電極は、事実上すべてのカレンを削除しばしば技術3の欠点として挙げられトン効果。新しい詳細は、電極チップ接着プロセスの間に上向きとピギーバック電極を製造する際にmultibarrel電極の溝内の単一のバレルは高い成功率を保証します休憩を持つものとしてここに提示した。技術は比較的簡単で、通常は数日以内に初心者でマスターすることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 項目名 </td><td> メーカー </td><td> コメント </td><td> 猫。 ＃ </td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td></td><td> からの利用 ：VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> 二成分歯科用セメント： &quot;低温硬化&quot;歯科材料</td><td>共同経口-ITE歯科製作所株式会社</td><td> からの利用 ：午前システムズ株式会社</td><td> 525000 </td></tr><tr><td> 二成分歯科用セメント：義歯材料の架橋液状化合物</td><td>共同経口-ITE歯科製作所株式会社</td><td> からの利用 ：午前システムズ株式会社</td><td> 525000 </td></tr><tr><td>液体のり</td><td>ヘンケル</td><td>スーパー接着剤ロックタイト： から入手可能 </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td>マイクロイオントフォレーシスアンそれ：Neurophore BH-2 </td><td>ハーバード装置</td><td>ハーバード装置： から利用可能 </td><td> 65から0200＆65から0203 </td></tr><tr><td>絶縁された銀線</td><td> AM-システム</td><td> AM-システム： から利用可能 </td><td> 785500 </td></tr><tr><td>水平プラー</td><td>ツァイツDMZ-ユニバーサルプラー</td><td>自動化科学： から入手できる </td><td> NA </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータピース：電極ホルダー</td><td> WPI </td><td> からの利用 ：WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータピース：リニアステージ</td><td>ニューポートの423シリーズ</td><td>ニューポート： から利用可能 </td><td> 423 </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータピース：回転ステージ</td><td>ニューポートのRSP-2 </td><td> からの利用 ：ニューポート</td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータピース：Z変換</td><td>ニューポートの433シリーズ</td><td>ニューポート： から利用可能 </td><td> 433 </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータピース：Zとxy軸を組み立てるためのアングルブラケット90° </td><td>ニューポート360から90 </td><td>ニューポート： から利用可能 </td><td> 360から90 </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータピース：X変換/リニアステージ</td><td>ニューポートの423シリーズ</td><td>ニューポート： から利用可能 </td><td> 423 </td></tr><tr><td> マイクロマニピュレータの作品：Y変換/リニアステージ</td><td>ニューポート423 </td><td>シリーズニューポート： から利用可能 </td><td> 423 </td></tr><tr><td> 顕微鏡 </td><td>ライツLaborlux 11 </td><td></td><td></td></tr><tR&gt; <td> 顕微鏡：対物</td><td> 10倍ライツウェッツラー、NAは0.25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> 顕微鏡：eypieces </td><td>ライツウェッツラー、Periplan 10x/18 </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> 顕微鏡：ステージ</td><td>ライツウェッツラー</td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td>キャピラリーMultibarrel </td><td> N / A </td><td> からの利用 ：午前システム株式会社</td><td> 612000 </td></tr><tr><td> Sinlgeバレルキャピラリー（GC 150F-10） </td><td>ハーバード装置</td><td>ハーバード装置： から利用可能 </td><td> 30から0057 </td></tr><tr><td>垂直プラー</td><td>ナリシゲモデルPE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>マイクロマニピュレーター（光Bのマークされたカスタムメイドの要素図1のLUE） </td><td></td></tr><tr><td>鋼板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>傾斜基盤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電極ホルダー用アタッチメント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> 表2の手順で使用されるすべての機器および消耗品のメーカーと項目番号。 </td><td></td></tr></tbody></table>

manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses

単一ニューロンからin vivoでの録音では 、調査員が感覚刺激に応答して、例えば、ニューロンの発火特性を調べることができます。ニューロンは、通常、相互に統合複数の興奮性と抑制性の求心性および/または遠心性入力を受信し、ニューロンの究極の測定された応答特性は、これらの入力の神経統合によって駆動される。神経系の情報処理を勉強するためには、ニューロンや神経系への様々な入力を理解することが必要であり、これらの入力の特定のプロパティ。与えられたニューロンが受信している特定の入力の機能的役割を評価するための強力かつ技術的に比較的単純な方法は、動的かつ可逆的にこれらの入力を抑制または排除することであり、この操作によって生じるニューロンの出力の変化を測定する。これは、薬理学的にピギーバックmultibarrelあるelectrとニューロンの身近な環境を変化させることによって達成することができるオード。これらの電極は、シングルバレル記録電極と4種類のシナプスのアゴニストまたはアンタゴニストまで運ぶことができるmultibarrel薬の電極で構成されています。薬理作用のある物質は、時間制御された送達とシナプス入力の可逆的再構成を可能にする、実験の間に望ましい時間にイオン泳動適用することができます。このように、微小環境の薬理学的操作は、神経回路の機能に関する具体的な仮説をテストするための強力な、比類のないメソッドを表します。 ここでは、ピギーバック電極が製造されている方法を説明し、そしてどのようにそれらはin vivo実験の際に使用されます。ピギーバックシステムは、治験責任医師がmultibarrel薬の電極を任意のプロパティ（抵抗、チップの大きさ、形状等）のシングルバレル記録電極を組み合わせることができます。これは、すべての樽は、多かれ少なかれ似たような形や性質を持っている標準的なマルチ電極上の主要な利点です。 Multibarrel電子lectrodesは最初、40年以上前の1月3日に導入された、とピギーバックタイプは1980年に導入された4,5まで設計改良2,3の数を受けています。ここでは、最小限の損傷を引き起こす比較的薄い電極軸に起因するインビボ動物製剤で無傷の脳深部への浸透を可能にピギーバック電極の実験室での生産において重要な改善点のセットを提示。さらに、これらの電極は、低ノイズの録音を特徴とし、所望の薬理作用物質の非常に効果的なイオントフォレーシス用低抵抗薬物バレルを持っています。

この実験では、グリシン受容体拮抗薬ストリキニーネ塩酸塩は、イオン泳動適用した。通常はグリシン阻害をブロックすると、神経細胞での焼成が増加します。 図4は、応答動物の耳に届け増加強度の正弦波音の刺激に記録された聴覚ニューロンからサ ​​ンプルデータを示しています。この種の実験は、ニューロンの放電率対強度関数と呼ばれます。大きな音は、より高いスパイク率（黒線）となりました。この実験中に使用された初期のイオントフォレーシス電流は15 nAのだった。現在のスイッチがオンにされたとレート強度関数の変化は彼らの新しいレベル（濃い青の曲線）で安定していた、現在の吐出が徐々に45、30に増加し、60 NA（オレンジ、緑、水色の曲線の後それぞれ）。それぞれのケースでは、音の強度の同じ範囲にわたってニューロンの応答はdischaの変更後に記録した電流が安定化した新たな排出に応じてRGE率強度の関数。現在、これらのレベルは、もはや違ったニューロンの応答を変更しないため、この例で使用することは現在の最も適切な排出は45 nAから60 nAのだった。この結果は、45 nAの電流で、そのニューロンのすべてのグリシン受容体が既にストリキニーネ塩酸によってブロックされていたことを示唆している。現在、さらにストリキニーネを解放排出のさらなる増加は、ニューロンの放電レートレベルの機能のさらなる変化をもたらさなかった。プロトコルが完了した後、排出電流がオフになっていた。ベースラインに戻って神経反応の回復は約25分（赤線）後に達成された。これには数秒、数分、数十の間、排出薬剤の種類や量に応じて、時間がかかる場合があります。 <table border="1"><tbody><tr><td> 薬 </td><td> 濃度 </td><td> 溶液のpH </td><td> 溶剤 </td><td> 会社 </td><td> 猫。 ＃ </td><td> 典型的な保持電流 </td><td> 典型的なイジェクトカレンツ </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500mMの</td><td> 3.5から4.0 </td><td>のdH 2 O </td><td>シグマ</td><td> -2129 </td><td> -15 nAの</td><td> 100 nAから5 nAの</td></tr><tr><td> グリシン </td><td> 100mMの</td><td> 3.5から4.0 </td><td>のdH 2 O </td><td>シグマ</td><td> G-7126 </td><td> -15 nAの</td><td> 100 nAから5 nAの</td></tr><tr><td> ビククリンのMethiodide </td><td> 10mMの</td><td> 3.0 </td><td>のdH 2 Oで0.165 MのNaCl </td><td>シグマ</td><td> B-6889 </td><td> -15 nAの</td><td> 60 nAから5 nAの</td></tr><tr><td> ストリキニーネ塩酸塩 </td><td> 10mMの</td><td> 3.0 </td><td>のdH 2 Oで0.165 MのNaCl </td><td>シグマ</td><td> S-8753 </td><td> -15 nAの</td><td> 80 nAから5 nAの</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸 </td><td> 500mMの</td><td> 8.0 </td><td>のdH 2 O </td><td>シグマ</td><td> G-1251 </td><td> 30 nAの</td><td> -10 nAから-150 nAの</td></tr><tr><td> L-アスパラギン酸 </td><td> 500mMの</td><td> 8.0 </td><td>のdH 2 O </td><td>シグマ</td><td> - 8949 </td><td> 30 nAの</td><td> -10 nAから-150 nAの</td></tr><tr><td> カイニン酸 </td><td> 1mMの</td><td> 9.0 </td><td>のdH 2 O </td><td>シグマ</td><td> K-0250 </td><td> 30 nAの</td><td> -100 nAから-10NA </td></tr></tbody></table>溶解し、濃度に対してpHは表1。一般的に使用される薬剤。表は、イオントフォレーシスで使用される最も一般的に使用されるシナプスのアゴニストおよびアンタゴニストを示しています。トンを分極する必要性のためにアカウントを記載されているpH環境<html>ヘセエージェント、および異なる薬剤間の有効性の変動のための提案された濃度を占めています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> 図1。異なるチップの長さを持つ3つのmultibarrelピペット：この5バレル電極の先端部が長すぎて、薄い引き出されている。先端が曲がって、非常にソフトであることに注意してください。先端のこのタイプは、所望の直径を破ることは非常に困難です。 B：この電極の先端が短すぎると太くて短いです。深く脳の領域に進出した場合、この電極は、電極はチップ後わずか数ミリメートル比較的厚くなっているという事実に起因する不要な脳の損傷の原因となります。 C：正しく引っ張ら先端を持つ電極の一例。長くて細いながら、先端が依然として堅調であり、所望の先端径を容易に破壊することができます。 グレ2は &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。電極マニピュレータアセンブリのデッサン。マニピュレータアセンブリは、ピギーバック電極を組み立てるために顕微鏡と一緒に使用されます。灰色でマークのついた項目は、市販製品であり、 表2に示します。青で表示されているアイテムは、我々の施設のマシンショップでカスタムを機械加工した。彼らは、ニューポートのステージ423ドリル用の穴付き1/4インチのスチール板サイズ43x26 cmのニューポートで提供される穴のパターンに応じて）1、そこにいて、任意の角度で組み立ての傾動を可能にする2）傾斜ステージ、3）トップ並進ステージに電極ホルダーをマウントコネクタ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> 図3。サンプルピギーバック電極の写真 。シングルバレル記録エルと一緒に組み立て、完成した5バレルの電極ectrode。脳深部の録音を可能に約7mmの長軸に注意してください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> 図4。放出電流の滴。グラフは、動物の耳が様々な強度のトーンで刺激しながら、単一の聴覚ニューロンから記録速度強度の関数を示します。大きな音は、より高い発射速度を引き出す傾向にあった。医薬品申請前に、ニューロンのレート強度関数は、最も低いスパイク率（黒線）を示した。徐々に高く放出電流が徐々に高く発射率で、その結果、神経細胞で次第にグリシン受容体を遮断した。このニューロンの現在の最適な吐出が45から60 nAのだった。これらの放出電流を使用すると、すべてのニューロンのグリシン受容体の完全な閉塞が達成された。実験プロトコルの終了後、イオントフォレーシスは終了し、ニューロンをさせて頂きました回復します。回収率強度の関数は初期プレ薬回復機能にマッチしたときに完全な回復が達成された。 KLUG ら 、1995年から、アメリカ生理学会の許可を得て、再現しました。

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Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

細胞外の間に神経アゴニストおよびアンタゴニストのイオントフォレー<em生体内で&gt;</em&gt;録音は、ニューロンの微小環境を操作するための強力な手段です。これらの操作は、最も容易にピギーバックmultibarrel電極を介して行うことができます。ここでは、それらを製造および聴覚の録音中にそれらを使用する方法について説明します。

用ピギーバックMultibarrel電極の製造と使用<emインビボ&gt;</em神経反応の&gt;薬理マニピュレーション

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

manufacturing-using-piggy-back-multibarrel-electrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

10.4K ビュー.  University of Colorado Medical Campus. 細胞外の間に神経アゴニストおよびアンタゴニストのイオントフォレー録音は、ニューロンの微小環境を操作するための強力な手段です。これらの操作は、最も容易にピギーバックmultibarrel電極を介して行うことができます。ここでは、それらを製造および聴覚の録音中にそれらを使用する方法について説明します。

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

神経科学

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

行動内分泌学と実験経済学を組み合わせること：テストステロンと社会的意思決定

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

単一ユニット活動とElectrocorticographic信号を記録するための慢性神経電極の外科的移植

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

神経応答を記録し、トレーサーを注入するための覚醒マウスの作製

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

神経電位電極の体系的電気化学的および電気生理学的評価方法

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.