我々は、ヘッドプレートのデザインのためにエミリーA.ケリーに感謝。 我々は、HAGにNIHの賞のサポートに感謝しています：PO1 MH64570、RO1 MH56838、RO1 MH078989、R21 MH03851とこの仕事は不可能だったでしょうこれなしジェフリーWaasdorp小児神経学基金の寛大なサポート。 AKMは、NIH（EY019277）、ホワイトホール財団、アルフレッドP.スローン財団とバローズウェルカム基金から医歯薬学総合研究でのキャリア賞によって運営されている。 METは、フォンデラ凝ったエンサンテケベック（FRSQ）ポスドクトレーニングの賞によって運営されている。 DFMは、NIH T32 GM07356およびT32 AI049815によって資金を供給、医療科学者養成プログラムの研修生です。

1。イメージングのために動物を準備<ol><li>我々の実験では、我々はミクログリアを含む単核細胞系譜、でGFPを発現すること成人CX 3 CR 1 GFP / +マウスを使用してください。マウスの4つの異なる株が特定のプロジェクトのニーズを満たすために使用することができます。 </li><li> 0.05 mg / kgのフェンタニル、5.0 mg / kgのミダゾラム、および0.5 mg / kgのメデトミジンからなる三薬剤のカクテルの腹腔内注射したマウスを麻酔。動物が、もはやそのような、痛み刺激に対する応答が返されなかった後TSCWは5手術の準備が始まるテールピンチとして。手術とイメージングを通して、我々は、ポスト麻酔の低体温症を防ぐために、加熱パッドで動物を保​​つ。必要に応じて、麻酔薬のカクテルの三分の一元用量のブースター投与量は、元の麻酔の平面を復元するために与えることができます。 </li><li>動物の瞬目反射を抑制する麻酔中の眼の潤いを保つために、保護眼軟膏、と動物の目を覆う。かみそり、鋏、はさみ、または化学的方法を用いた動物の頭皮から髪を削除します。 10パーセントポビドンヨード溶液および70％エタノールを使用して頭皮を消毒。すべての手術器具は、ガラスビーズ滅菌器、または70％エタノールで消毒と滅菌、オートクレーブする必要があります。 </li><li>頭蓋骨の尾4〜5ミリメ​​ートルを開始し、目の前に前方に進んで、小さなはさみを使って頭皮の正中切開を加えます。それは、この切開は十分な長さの皮膚は、2光子イメージング（図1）中にマウスの頭部を安定させるために使用されるヘッドの板の接着に干渉しないということが重要です。解剖範囲で薄くする領域を識別します。頭蓋骨は、これらの分野でも安定ではないと基盤となる大血管と髄膜のイメージングを妨害するため、直接、頭蓋縫合の上に配置関心のある分野を避けてください。 </li><li>頭蓋骨の上に膜を乾燥し、微細なピ​​ンセットやカミソリの刃を使用してすぐにそれをこすり取る際には、滅菌綿棒で塩化第二鉄の10％溶液に続いて100％エタノールを適用します。不安定なヘッドプレートアタッチメントで膜の結果を削除するには失敗。 </li><li>ヘッドプレートの下に表示するウィンドウのエッジの周りPermabond 910接着剤の薄層を配置。光の圧力（図1）を持つ動物の頭蓋骨上に関心領域を介して接着剤でコーティングされたヘッドプレートを置きます。ヘッドプレートのみ頭蓋骨の骨に接着されていることが重要です。ヘッドプレートと頭蓋骨の間に挟まれているすべての皮膚や粘膜の結合の安定性が減少します。即座に注射器ボンド接着剤を使用して、表示​​ウィンドウの周囲にアクリル酸の少量を適用します。最後に、漏れを防ぐために、表示ウィンドウの端にロックタイト454の少量を適用する。 </li><li>動物のホルダー（図1）にヘッドプレートをネジ込み、軽くピンセットでプロービングによる郭清範囲の下でヘッドプレートの安定性を確認してください。ヘッドプレートの相対頭蓋骨のない動きはないはずです。漏れがないことを確認するために、表示ウィンドウに生理食塩水の低下を置きます。 </li></ol> 2。間伐スカル皮質ウィンドウの準備<ol><li>頭蓋骨を薄くするための準備として、滅菌綿棒、圧縮空気の組み合わせを使用して、頭蓋骨を乾燥させる。我々は4000rpmで設定Microtorque IIのドリルの滅菌IRF 007ドリルビットを持ち、最初は薄い頭蓋骨。非常に穏やかに、頭蓋骨の2〜2.5ミリメートルの直径の円形領域を薄く始める。頭蓋骨のほぼ平行な光だけ大胆な動きを使用して、直接的な下方圧力を使用していない。圧縮空気を使用して骨のほこりを除去するごとに20〜30秒を掘削停止します。掘削中のこれらの改行は、基礎となる脳組織への熱による損傷がないように頭蓋骨を冷却することができます。 <ol class="lalpha"><li>掘削が進むにつれて、湿り気海綿骨の層（すなわち&quot;板間層&quot;）への移行に注意してください。この層に達すると、ドリルで余分な注意を払う。 </li></ol></li><li>時折薄くなった領域の上に生理食塩水を置き、解剖範囲で表示することによって、頭蓋骨の薄さを確認してください。生理食塩水は、さらに放熱が可能になります。頭蓋骨が薄くされると、小さな血管が見えるようになります。 </li><li>マイクロブレードは、頭蓋骨の安定性に関する多くの触覚フィードバックを提供するように、生理食塩水で間伐の最終を達成するために無菌歯科マイクロブレードを使用してください。これだけではドリルよりもはるかに薄く準備することができます。我々の経験から、最適な頭蓋骨の厚さは10〜30μmである。 <ol class="lalpha"><li>薄い頭蓋骨のウィンドウを作るのが最初の数試行中に落射蛍光複数回の下で頭蓋骨の薄さを確認することが重要です。目に見えるミクログリアと血管系のシャープさと深さは、ウィンドウがイメージングのための準備ができたときに、的確な指示を与える。 </li></ol></li><li>ウィンドウには、接着剤＃0カバーガラスwiのカスタムメイドの長方形の部分、準備が整ったら<html>ウィンドウ上の各側に2mm未満の次元目。 1.0 mmの直径のガラスピペットを用いて、間伐頭蓋骨のエリア上にシアノアクリレート接着剤の小滴を配置し、カバースリップの小片ダウン慎重に低く、その後接着剤の過剰量を絞り出すために頭蓋骨に軽く押してください。光学的に不透明になるために下に閉じ込められた空気は、地域の原因となりますので、それは、ガラスと接着剤の間に気泡の形成を回避することが重要です。それは、乾燥時に透明なままでも、骨と薄いと半透明のウィンドウの下に頭蓋骨を保つ膜の再生を防ぐためシアノアクリレート接着剤が使用されます。カバーガラスの上に接着剤がある場合は、カバーガラスが設定されていて、接着剤が乾燥した後、慎重にそれを削除するためにマイクロブレードを使用してください。 </li><li>鎮痛剤（例えば、ブプレノルフィン2 mg / kgの皮下に）すぐに手術後に投与し、移動、食事や飲みに不本意を含む痛み、体重減少、流涎、立毛、呼吸音の兆候で再投与され、など</li></ol> 3。二光子イメージング<ol><li>二光子イメージングのための準備として、生理食塩水でTSCWをカバーし、落射蛍光（図2）の下に関心の領域を見つけます。地域のその後のイメージングを有効にするには、写真用カメラを使用して撮影してください。 </li><li>二光子イメージングのために、我々は、Tiとカスタムメイドの二光子顕微鏡6を使用してください：サファイアレーザーは920 nmに調整されています。蛍光は全フィールド検出モードと180分の580発光フィルターに光電子増倍管を用いて検出される。 20X水浸レンズ（0.95 NA）は、イメージングセッション全体で使用されます。目的のレーザーパワーの最大出力は50から65 mWの間に設定されています。 </li><li>皮質層IまたはII（軟膜表面下最大150ミクロン）への関心の領域を選択します。再イメージングを容易にするために、1X、2Xでビューの同じフィールドの写真を撮って、3倍デジタルズーム。血管が簡単に、後続のイメージングセッション中にビューの同じフィールドを見つけるために目印として使用できます。時間をかけてミクログリアの形態と行動の良好なサンプリングを可能にする30分、最大で80〜90と3倍、複数のz -スタックのズームの下に各スタック内のZ -手順と0.69μmのステップは5分ごとに取得することができます（図3）。 Z -スタックの買収との間で、一TSCW以上生理食塩水のレベルだけでなく、麻酔の動物の深さを確認する必要があります。 </li></ol> 4。 HIV - 1神経毒、タットの注入<ol><li>最初に、35ゲージの針およびTat沈着を防ぐために10μL微量注射器の内側のライニングをsilanize。それは、針と注射器の両方を使い切るまで、シラン溶液（Sigmacoteを）撤回する。ソリューションは、室温で5分間静置することができます。シリンジからのソリューションを空に、プランジャーを削除し、注射器と針が完全に乾かします。最後に、脱イオン水で十分に注射器と針を洗浄する。 </li><li>二光子画像は、得られる小さなドリルビットを使用し、鋭い先端と鉗子のペアがの間伐層を除去できるようになるまで慎重に頭蓋骨を薄くしているTSCWに吻側または横方向の3ミリメートルのいずれかの直径の小さな開頭0.5mmの実行簡単に離れて骨。我々は、3軸マニピュレータに搭載されたUltramicropump IIIのシリンジポンプによって制御される35ゲージの針を備えた10μL微量注射器を使用し、開頭に針先を合わせてから、それは以下の700から900μmの深さに慎重に進んでいる3μLタット1から72（または他の炎症誘発剤）または生理食塩水（またはコントロールのビークル）軟膜表面を80 NL / minで配信されます。 </li></ol> 5。動物ハウジング<ol><li>動物は一日に複数回撮像する場合は、眼軟膏とイメージングのセッションの間に不快感や頭蓋骨への損傷を防ぐためにワセリンの混合物と頭蓋骨のオープンエリアをカバー。小型のヘッドプレート（図1Bを参照）からのサポート、ブリッジを切断し、簡単にアクセスできる食料と水を暖めたケージに動物を配置。すべての動物はすべての回で手術後に単独で収納することがあります。動物用のイメージングセッションが特定の日に完了すると、慎重にヘッドプレート全体を削除し、＃6または小さい縫合糸で頭蓋骨を介して背部皮膚を縫合。再び、家の実験日の間に容易にアクセス可能な食料と水と動物が単独で。ストレス、痛み、または感染の形跡がないか毎日動物を確認してください。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="図1" /> 図1手術と2光子イメージング（A）とヘッドプレートの設計（B）のための動物の安定化。 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。GFP標識されたミクログリアは、落射蛍光で視覚化。 jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 GFPで標識されたミクログリアはTSCWの移植後の二光子励起イメージング、軟膜表面下約50μm。単二光子15〜30分TSCWの移植（0日）後に採取したセクションだけでなく、7 を可視化し、 17日後に、ミクログリアは炎症侮辱のない状態で不活化したままでWindowsが明確にとどまることを示している。 Z -突起6を取られ、24時間活性化ミクログリアのHIVの神経毒TAT展示印象的な形態学的変化のポスト噴射。スケールバー：10μmである。

<ol>
	<li>Mostany, R., &amp;amp, P. o. r. t. e. r. a. -. C. a. i. l. l. i. a. u., C, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., &amp;amp, Y. u. s. t. e., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li><li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system.">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li><li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp;amp, B. a. l. c. e. r. z. y. k., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia.">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li><li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp;amp, Q. u. i. n. l. a. n., M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders.">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li><li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp;amp, U. p. e. n. d. e. r., B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder.">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li><li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp;amp, M. c. A. r. t. h. u. r., C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain:+correlations+with+dementia.">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

HIV - 1関連神経認知障害（HAND）の実際の基板はおそらくHIV - 1感染単核食細胞から放出される炎症促進性メディエーターによって引き起こされるシナプスアーキテクチャの破壊、であることがコンセンサスがある。ミクログリアの活性化、多核巨細胞、およびアストロサイトの肥大に起因する神経膠症は中枢神経系7のHIV - 1感染及び炎症の非特異的な特徴とみなされます。対照的に、殺す前に起こった神経疾患の重症度は、シナプスの複雑さの損失だけでなく、CNS 8,9,10,11のマクロファージ負担と相関している。しかし、ミクログリア、末梢浸潤マクロファージ、およびHAND患者におけるニューロン間の動的相互作用は、単に従来の免疫細胞化学的研究から得られた従来の静的な処理を用いてモデル化することはできません。我々の研究室から最近の研究では、末梢および中枢単核細胞とニューロン間のこれらの相互作用の少なくとも一部は脳実質（呂、マーカー、Tremblayさん、にHIV - 1タンパク質タット1から72までの定位注射によって部分的にモデル化できることが示唆されている気、およびGelbard、未発表データ）。したがってneuroAIDSため扱いやすい小型の動物モデルにおいて、単球由来のマクロファージ、脳の常駐ミクログリアとニューロン間の相互作用を調べるためにin vivoで二光子イメージングに適用することを決めた。オープン頭蓋骨や間伐、頭蓋骨の準備は時間の短い期間（時間）のための皮質構造の単一の検査をできる一方で、亜急性のイベントのタイムコースに興味がある研究者は、人為的原因の外科的処置にミクログリア/マクロファージを活性化することなく、これらの製剤を使用することはできません。頭蓋冠のウィンドウ。ここでは、接着TSCWで回生から頭蓋冠を防ぐだけでなく、≥3週間のための半透明性を維持する間伐頭蓋骨の領域の上にガラスのカバースリップの小片で、これらの制限を回避する簡単な方法を示しています。我々はさらにこの技術は、私たちは（CX 3 CR 1 / GFPのためのヘテロ接合体マウスの大脳皮質におけるHIVタット1から72までの定位注射に反応して脳微小血管系だけでなく、脳常駐ミクログリアを入力する末梢単球の挙動を監視することができることを示している単核球系統の細胞を同定する）。このテクニックは、簡単に異なる遺伝的背景を持つマウスで使用するために適応させることができ、例えば、我々は日常的にヘテロCX 3 CR 1 / GFPを使用してX汝- 1単球由来のマクロファージ、脳の常駐ミクログリアとニューロン間の相互作用を調査するためにYFP 12匹のマウスHANDに関連する神経炎症の in vivoモデルインチ私たちのTSCWの準備は、研究者が周囲と動物が繰り返し実験的治療の前後に撮像​​することのできる数週間の期間、以上発生する可能性のある中枢神経系との間の細胞間相互作用を研究することができます。このように、各動物には独自のコントロールとして機能することができます。このTSCWモデルの一つの注意点は調査中の標的細胞は、どちらか遺伝的に強化された蛍光タンパク質（eXFP）を発現したり、頭蓋冠の機械的な違反せずに蛍光色素で標識される設計でなければならないということであり、そのeXFPの式は、十分に堅牢でなければなりません細胞構造は数週間の期間にわたって繰り返さイメージングセッションの後に視覚化することができます。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

伝統的に神経科学では、in vivoでマウス中枢神経系の二光子イメージングには、どちらのオープン頭蓋骨の1,2または間引き頭蓋骨3製剤の使用に関与している。オープン頭蓋骨のテクニックは非常に汎用性ですが、それは侵襲的であるため、ミクログリアを研究するための最適ではありませんし、ミクログリアの活性化を引き起こす可能性があります。間伐-頭蓋骨のアプローチは、低侵襲であるにもかかわらず、繰り返し再間伐頭蓋骨の慢性的イメージングに必要な、組織の損傷とミクログリア活性化のリスクを増加させ、イメージングセッションの限られた数を可能にする。ここでは、2光子顕微鏡を使用して、長期間にわたってin vivoでのマウスのミクログリアを監視するための慢性的な薄頭蓋骨のウィンドウ法を提案する。私たちは、断続的な観察の三週間の経過とともに半透明のまま並列したガラスカバースリップで安定した、アクセス可能な、間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を調製する方法を示しています。このTSCWの準備ははるかに免疫学的に不活性薄く開いて開頭術または反復頭蓋骨よりミクログリアの活性化に関してであり、数週間の期間中にイメージングセッションの任意の数を可能にします。我々は、軟膜表面下≤150μmまで増強緑色蛍光蛋白質とミクログリアを視覚化するCX 3 CR 1 GFP / +マウス4でTSCWを準備。我々はまた、この準備が耐久性のあるmicrogliosisを誘導できるTSCW、隣接するタットHIV - 1の神経毒性タンパク質、の定位脳の注射と組み合わせて使用​​することができることを示している。したがって、この方法では、HIV関連の神経認知障害（HAND）とneuroinflammatoryコンポーネントと他の神経変性疾患のモデルで生きている脳内の時間をかけてミクログリアの形態と運動性の変化を調べるために非常に便利です。

Watch this Scientific Journal Video about A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation at JoVE.com

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。<em&gt; in vivoで</em&gt;経頭蓋二光子顕微鏡を用いて数時間、数日または数週間にわたって。我々は、HIV - 1調節タンパク質タットの隣接定位注入によって活性化することができる静止ミクログリアの断続的な観察を可能にする間伐 - 頭蓋骨のウィンドウを準備する方法を示します。

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K ビュー.  University of Rochester. 我々は繰り返しマウスミクログリアを可視化し、単球を循環させるための方法を説明します。 in vivoで経頭蓋二光子顕微鏡を用いて数時間、数日または数週間にわたって。我々は、HIV - 1調節タンパク質タットの隣接定位注入によって活性化することができる静止ミクログリアの断続的な観察を可能にする間伐 - 頭蓋骨のウィンドウを準備する?...

ビデオ: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング