我々は、視覚モデル支援のための映像制作·編集とカールトンからマーティン·ベルトラン没入型メディアスタジオ/神経再生研究室で専門的な技術支援のためカールトン没入型メディアスタジオからマルクレオナルドに感謝したいと思います。作者は感謝博士マリリンKeaneyとオタワのアニマルケアと獣医サービスの大学の彼女の献身的なスタッフのすべての専門家の助言を認める。この作品はSALBとSF、カナダの財団への神経変性リピドミクスにおけるヘルスリサーチ/ CIHRトレーニングプログラム（TGF-96121）にSALB、老化のCIHR研究所と戦略的トレーニングイニシアチブに保健研究のカナダ研究所（CIHRは、MOP 62826）によって賄われていたSFにSFとSF、オンタリオ州イノベーショントラスト、およびAutodesk研究へのイノベーションのため。 ACMはCIHRのバンティングとベスト博士賞を受賞しました。 NVは加齢と神経変性リピドミクスでCIHR研修プログラムの研究所からポストプロのフェローシップを受信します。

1。準備する試薬<ol><li>必要になるまで無菌膣洗浄は、再蒸留水（蒸留H 2 O）をオートクレーブ滅菌し、室温で密閉容器に保管してください。 </li><li>細胞学的評価のために、蒸留H 2 Oを100mlにクリスタルバイオレットの粉末0.1グラムを追加よく混ぜる。必要になるまで、クリスタルバイオレット染色液（0.1％）を室温で密閉容器に保存することができます。 </li></ol> 2。収集膣細胞（膣胞洗浄） <ol><li>無菌200μlの先端の先端にラテックス球を置き、滅菌蒸留H 2 Oは、ボリュームの指針となるべきものとして、先端にグラデーションを使用しての約100μlを描く。 </li><li>彼女のケージのマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の後肢/後端にケージホッパー（フタ）の上に彼女を置く。 </li><li>しっかりと尻尾をつかんで後端を持ち上げる。マウスは今ホッパーを把握するだけで彼女の前足を持つことになります。この時点でマウスが排尿することがあります。もしそうなら、排尿が止まるまで待ちます。そこに膣の入り口に残った尿である必要があり、個別の先端（ すなわち 、あなたのサンプル採取チップ）を使用して過剰ddH 2 Oで口をすすぐことをお勧めします。 </li><li>膣（および頸部）刺激がラットの1,2に偽妊娠を誘発することができるようにオリフィスを貫通しないように注意しながら膣の開口部ddH 2 Oを充填したチップの先端を置きます。最近の報告では、マウスは、この効果の影響を受けにくくなりますそれにもかかわらず、注意を繰り返し分析3の侵襲の程度を最小限に抑えるよう注意が必要を示唆している。 </li><li>優しく膣管のオープニングで水の体積の半分（〜25から50μl）に四半期を排出するバルブを押し下げる。液体が自発的に先端挿入せずに管の中に吸引されます。ゆっくり電球に加わる圧力を解放します。流体は、先端に戻って撤退します。流体の吸引を防ぐために、早すぎる圧力の放出を避ける電球に。たばこのフィルターは、この目的のために有用であろう。 </li><li>単一試料中に十分な細胞数を得るために、同じチップ、電球、および流体を使用して、前のステップ4から5回繰り返します。 </li><li>スライドガラス上に液を入れ、汚れが完全に室温で乾燥することができます。一度乾燥した、これらの発情塗抹標本を直ちに染色または保存され、後日染色することができる。 </li></ol> 3。クリスタルバイオレットを用いて細胞染色法* 4 <ol><li>クリスタルバイオレットが1分間染色含むコプリンジャー（または他の同等の染色槽）で乾式スライドを配置します。 </li><li>蒸留H 2 Oを含有する第二のコプリンジャーに取り外し1分間ddH 2 Oでスライドを洗浄します。繰り返します。 </li><li>染色塗抹との接触を避け、軽量組織ワイパー付きスライドの端から過剰蒸留H 2 Oを削除します。 </li><li>スミアとカバーの上部にあるグリセロールのピペット約15μlのスリップ。あるいは、他の組織学的マウンティング試薬は、非拡散、より恒久的な染色を得るために利用することができます。 </li></ol>ここで説明する*染色法は、どの研究室で行うことができる最も簡単な手順です。他の方法としては、追加の詳細を提供することができます。たとえば、パパニコロウ染色を用いて、有核上皮細胞の成熟度は、染色されたターコイズと、より成熟した細胞は、ピンクやオレンジ色に染色された未成熟細胞と区別することができます。これらの違いは、早朝または深夜の発情前期を上演するために使用できます。4 4。膣細胞診<ol><li>現在のセルの種類を決定するために光学顕微鏡下で塗抹を調べます。顕微鏡検査は、封入のためにグリセロールを使用しているとき、クリスタルバイオレットは時間をかけて細胞から拡散するように染色した後、直ちに行われるべきである。顕微鏡写真では、細胞診を文書化するために、分析の際に取られるべきである。 </li><li> entirを調べることから始め低倍率のe塗抹。代表的な地域を選択して、高倍率に移動します。あなたは、角化扁平上皮細胞、白血球、および/ ​​または有核上皮細胞（ 代表的な結果は、 図1A〜C）が表示されます。存在する細胞の割合は、サンプル採取（ 代表的な結果は、 図1D-G）と彼女の即時のホルモン状態の時間（ ディスカッション 、 図2）でマウスの発情期を決定することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果 細胞診：3つの主要な種類の細胞は膣塗抹標本で検出することができる：（1）有核上皮細胞（ 図1A）、（2）角化扁平上皮細胞（ 図1B）、（3）白血球（ 図1C）。有核上皮細胞が染色された細胞質軽く、暗いステンド形質膜、および楕円形の核を持っている（ <strオング&gt;図1A）。角化扁平上皮細胞はそれらの有核上皮前任者よりも、より多角形状、均一に染色され、核（ 図1B）を欠いている。多形核白血球は、その不規則な形状、暗くステンドポリモーフィック型核、小サイズ（ 図1C、黒矢印）によって上皮細胞と区別することができる。尿汚染がスメア中に存在すべきである、尿酸の結晶が容易に予想される、任意の細胞型（ 図3）に似ていないその結晶構造によって検出されます。これが発生し、優勢な細胞型の曖昧な検出すべき、スミアは破棄され、目的のステージング用に使用すべきではない。 ステージング：塗抹標本で観察された細胞型の相対比は、サンプル採取の日（ 図1D-G）の上でマウスの発情周期のステージを識別するために使用することができます。発情前期の間に、細胞がほぼ独占的にアールラウンドのクラスタ、整形式有核上皮細胞（ 図1D、白い矢印で示さ代表セル）。発情期の間に、細胞が密集したクラスター内に存在し、主に角化扁平上皮細胞（ 図1E、矢印で示す代表的な細胞）である。発情後期中に、小さなステンド暗く白血球（ 図1F、黒い矢印で示された代表的な細胞）が優勢。角化扁平上皮細胞は、しばしば断片（ 図1F、黒矢印で示す代表的なセル）で、観察することができる。発情間期の間に、珍しい角化扁平上皮細胞はまだ（ 図1G、黒矢印で示す代表的な細胞）が存在しているかもしれませんが、白血球はまだ（ 図1G、黒い矢印で示された代表的な細胞）が優勢。発情後期は発情間期中の有核上皮細胞の出現によって発情間期と区別することができる（ <stron<html>グラム&gt;図1G、白い矢印で示さ代表セル）。 <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 （A）は、有核上皮細胞、（B）は角化扁平上皮細胞、および（C）白血球：膣スメアの細胞学的評価は、主に次の3つの種類の細胞が膣塗抹標本で検出された発情段階を識別するために使用することができます 。塗抹標本内に存在これらの細胞型の比率は代表的な結果で説明したように（D）発情前期は、（E）は発情期が、（F）は発情後期、または（G）は発情間期のマウスを識別するために使用することができます。代表的な角化扁平上皮細胞へのE、FおよびGポイントの黒矢印。代表leykocytesにC、F、Gの点の黒矢印。 DおよびGハイライト代表の白い矢印は上皮細胞核。 jpgのは &quot;alt =&quot;図2 &quot;/&gt; 図2。膣スメア細胞診は、基礎となる内分泌事象を反映しています詳細はまたディスカッションで提供されています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。尿酸の結晶が尿に汚染されたサンプルの現在の次のクリスタルバイオレット染色可能性があります （A）の結晶は透明であり、様々なサイズ（矢印と（B）に拡大された箱入りの領域）にすることができます。無細胞はこの分野に存在していない。細胞学的染色のために使用されるフ​​ィールド内で尿酸結晶の汚染が存在する必要があります、それは正確に存在し、塗抹標本を廃棄すべきセルの種類を識別することは困難かもしれません。スケールバー=50μmである。

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.">Spontaneous pseudopregnancy in mice.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).</li><li>Armaiz-Pena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrous+cycle+modulates+ovarian+carcinoma+growth.">Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+Whitten+effect+in+female+mice+by+synthetic+analogs+of+male+urinary+constituents.">Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).</li></ol>

著者らは、利害の衝突を宣言しない。動物に関するすべての実験は、オタワアニマルケア委員会の大学とアニマルケアに関するカナダ評議会によって定められたガイドラインおよび規制に厳密に従って行った。

細胞類型におけるこれらの変化は、基本的な内分泌のイベントを示している。発情周期の発情前期フェーズは、月経周期中のヒト卵胞期に相当し、17-β-エストラジオールのレベル6と同様、プロラクチン7（ 図2の小さなサージを循環におけるプレ排卵増加によって定義され発情前期、左パネル）。 17-β-エストラジオールの増加は間接的に、順番に、循環8,9（ 図2中に黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモンを解放するために下垂体前葉に敏感な細胞を活性化し、視床下部および中隔の性腺刺激ホルモン放出ホルモンニューロンを刺激する、発情前期、左パネル）。発情前期の動物から採取した膣スメアでは、細胞は、ほぼ独占的に楕円形の有核上皮細胞（ 図1D、図2、発情前期、右パネル）です。卵胞刺激HORMのピーク1レベル信号排卵、発情10,11への参入。発情期、17-β-エストラジオールレベルの低下やプロラクチン濃度の間にピーク6,7（ 図2、発情、左パネル）。膣スメアが塊になって、しばしば不規則な形の角化扁平上皮細胞（ 図1E、図2、発情、右パネル）のほぼ独占的検出によって特徴付けられる。発情後期への参入はプロゲステロンホルモンレベル6の継続的な上昇と一致していると人間の黄体期12の始まり（ 図2、発情後期、左パネル）に対応しています。プロゲステロンのレベルが上昇し始めると黄体活性化6,13,14（ 図2、発情後期、左パネル）に対応して17-β-エストラジオールのレベルの小さなサージがあるとして。この段階で膣スメアに存在する細胞の種類は、断片化され、角質化した上皮細胞と小さな暗いステンド白血球（Figurアール電子1F、 図2、発情後期、右パネル）。最後に、マウスでは発情間期へのエントリーは人間の黄体期後期12に対応し、ピーク6を発生し、血中プロゲステロンレベル。黄体の退縮は、プロゲステロンのレベル15,16の後続の急激な低下（ 図2、発情間期、左パネル）につながる。白血球は、発情間期の間にスメアで一世を風靡。角質化した上皮細胞の頻度は減少し、有核上皮細胞は、直前に発情前期（ 図1G、図2、発情間期、右パネル）への移行を検出することが開始されています。 要約すると、この簡単な日常のプロトコルは毎日ホルモンの変動を推定して、次の予防措置を講じている場合は生殖状態を変更することなく、実験用マウスの発情ステージを確立するために使用することができます。サンプリングは、非侵襲的なプロトコルdescを使用し、毎日1回のみ行われるべきではない膣管、吸引、および攪拌の繰り返しの浸透に比べて、ここribed。これは、細胞学的評価を混乱かもしれスメア中に存在することが白血球やその他の細胞型で生じる炎症応答17その結果、膣の炎症を引き起こす可能性があります。また、あってもコロニーに収容され、雌では、それも無発情期の18の誘導と、この識別は、生殖や性別のホルモン影響の解釈に有用であり、病気の研究など、さまざまなマウスで拡張発情間期と発情期のステージを見ることは正常です。サイクルの長さの変動も年齢とともに女性と7,19-21のコロニー内の住宅の違い（個人またはグループ·ハウジング）によって導入される。女性専用コロニー内に収容された女性がサイクリングを中止し、サイクリングはサイクリング24,25を引き出すための男性の尿で前処理したケージへの曝露によって再インストールされることができるが長引く発情間期18,22,23の状態を入力することができます。したがって、individuaを確立する与えられたマウスのlのサイクルの長さは、それは2つの完全なサイクルが観察されるまで、ここで説明した非侵襲的な評価は、注意して、毎日実行することをお勧めします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td></tr><tr><td>無菌200μlのピペットチップ</td><td> Diamed </td><td> E340901 </td></tr><tr><td>ラテックス球（1ミリリットル） </td><td>フィッシャー</td><td> 03-488-21 </td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー</td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット（25g）の染色</td><td>フィッシャー</td><td> C581-25 </td></tr><tr><td>軽ティッシュワイパー</td><td> VWR </td><td> 82003-820 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> BP229-1 </td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス（22x30） </td><td>フィッシャー</td><td> 12-544A </td></tr></tbody></table>

performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification

げっ歯類での生殖状態を評価するの迅速な手段だけではなく、生殖機能障害の研究に有用であるだけでなく、病的なチャレンジに続く組織変性のホルモン調節（または再生）に新しいマウスの病気のモデルと調査の生産のために必要とされる。発情前期、発情期、発情後期、発情休止と：マウス生殖（または発情）サイクルは4段階に分かれています。卵巣ステロイド17-β-エストラジオールとプロゲステロンの循環レベルで定義されている変動は、性腺刺激ホルモンは、黄体と卵胞刺激ホルモン、これらの生殖段階を経て黄体刺激ホルモンプロラクチン信号遷移。ネズミ膣内の細胞類型の変化は、これらの基礎となる内分泌事象を反映しています。有核上皮細胞、角化扁平上皮細胞、膣スメア中に存在する白血球の相対的な比率の毎日の評価は、ネズミ発情を識別するために使用することができます段階。侵襲性の程度は、しかしながら、これらのサンプルを収集する際に採用すると、生殖状態を変更し、スメアの細胞学的評価を混乱させることができる炎症性応答を誘発することができます。ここでは、彼女の生殖サイクルを変えることなく、雌マウスの発情周期のステージを決定するために使用できる単純な、非侵襲的なプロトコルを記述します。膣スメアで優勢な細胞類型の収集と分析による発情周期の4つの段階を区別し、我々はこれらの変更が内分泌状態を基準に解釈することができる方法を示すために、どのように我々は詳細。

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Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

ここでは、単純な、非侵襲的なコレクションと膣の塗抹標本の細胞学的評価によるマウス生殖（発情前期、発情期、発情後期、もしくは発情間期）の段階を識別する方法について説明します。我々はさらに膣細胞診は、ネズミ生殖サイクルを通じての移行の基礎となるホルモンの循環レベルを反映する方法を説明します。

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

110.1K ビュー.  Neural Regeneration Laboratory and Ottawa Institute of Systems Biology. ここでは、単純な、非侵襲的なコレクションと膣の塗抹標本の細胞学的評価によるマウス生殖（発情前期、発情期、発情後期、もしくは発情間期）の段階を識別する方法について説明します。我々はさらに膣細胞診は、ネズミ生殖サイクルを通じての移行の基礎となるホルモンの循環レベルを反映する方法を説明します。

ビデオ: Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

気道抵抗測定とマウスにおける気管支肺胞洗浄液のサンプリングのためのリバーシブル、非侵襲的方法

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

生物学

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

の生細胞サイクル分析<em&gt;ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとVybrant DyeCycleバイオレットDNA染色を使用して&gt;組織

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

微生物の同定とキャラクタリゼーションのためのパイロシーケンシング

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

ステージング蛹期間およびショウジョウバエ guttiferaの翼色素沈着測定のためのメソッド

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

多様なマウス脂肪デポの同定と解剖

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...