我々は彼の専門的な技術サポートのために博士ハーヴェイヘンズリーに感謝。動物施設と小動物イメージング施設の研究所：この作品は以下のフォックスチェイスがんセンター（FCCC）の施設の利用の恩恵を受けた。この作品は、FCCC / UPenn（P50 CA083638）、FCCCコアグラント（P30 CA006927）における卵巣癌SPORE、および卵巣癌研究基金によって部分的にサポートされていました。

卵巣腫瘍細胞のI.準備<ol><li>文化の中でルシフェラーゼを発現する卵巣癌細胞株を成長する。ルシフェラーゼの源はホタル、ウミシイタケ、または他の種にすることができます。蛍光タンパク質を発現する細胞を使用することもできます。このデモのために我々は、ホタルルシフェラーゼを発現する卵巣癌細胞株、OVCAR5を、使用してください。 </li><li>ルーチン細胞培養法を用いて細胞を回収。 </li><li>リン酸の細胞懸濁液（10,000細胞/μL）に保つには、注射の時まで氷上で（PBS）緩衝生理食塩水。 </li></ol> II。 Intrabursalインジェクションこの手順では、二人目からの援助を必要とします。すべての外科手術は無菌条件下で行われている。これは、手術衣を着用し、無菌手術器具、注射器、および針の使用が含まれます。 <ol><li>塩酸ケタミン（100 mg / mL）を、キシラジン塩酸塩溶液1.6mL（100 mg / mLの）、アセプロマジン（10 mg / mL）を1.5 mLを加え、0.9％塩化ナトリウムを20 mLの3 mLを混合することにより、麻酔液を準備します。 </li><li>動物の識別番号と観察可能な健康状態をチェックしてください。 8の投与量〜9 mL / kg体重（BW）を腹腔内（ip）注射により調製ケタミン - キシラジン - アセプロマジン麻酔で動物を麻酔。 </li><li>動物は動物の後肢に鉗子や指を使ってつま先のピンチを実行することにより麻酔の許容平野下にあることを確認してください。ペダルの反射がある場合は、動物は、この手順に応答しなくなるまで、麻酔の深い平野のを待ちます。 </li><li>動物の背側は頭が離れて直面していると、その尾を手前に向けて滅菌ガーゼパッド上に横たわっていた。切開の点は、正中線の左または右にと卵巣上記位置しています。切開の時点で70％アルコールで毛皮をそぎ落としたり、濡らし。 </li><li>鉗子を使用して接液肌を持ち上げ、背内側位置に、直接卵巣脂肪パッドの上にはさみで小さな切開を行います。卵巣の脂肪パッドが腹膜壁の表面の下に表示されるはずです。脂肪パッドは、それを囲む濃いピンクの組織とは対照的に、その白い色で容易に認識可能です。 </li><li>ゆっくりと腹腔壁のライニングを持ち上げて、（5）上記のような小さな切開を行います。 </li><li>切開に隣接して正中線上に滅菌生理食塩水に浸したガーゼのパッドを配置。卵巣の脂肪パッドの位置を確認し、静かにそれを引き出し、ガーゼの上に置きます。ブルドッグクリップで脂肪パッドをクランプして卵巣を安定させます。嚢につながる卵管の曲がりに針の挿入（30ゲージ、G）を可能にするなど、解剖顕微鏡、位置卵巣の下で。針が正しい位置に挿入されると、それは嚢の下に表示されるはずです。 </li><li>ゆっくりと注射器が注射部位に置かれている間嚢と卵巣の間に細胞懸濁液5μLを注入する注射器のプランジャーを押してください。このステップでは、二人が必要です。他の人が針の位置を維持しながら、一人は、プランジャーをプッシュ。穿刺部位を密封するために、かつ慎重に十分な嚢と尿細管を引き裂くしないように迅速にニードルを取り外します。滑液包は、適切な注射で少し膨らんだように見えるはず。 </li><li>ブルドッグクリップからの脂肪パッドを離して、ゆっくりと戻って腹腔内に生殖器官や脂肪パッドを交換してください。下のライニングを介して上部の腹膜ライニングを引いて体壁を静かに閉じます。外科ステープルまたは創傷クリップで皮膚を閉じます。 </li><li>後ろのケージで回復動物を配置し、低体温を避け、回復をスピードアップするために安全な熱源を提供しています。呼吸数と使いやすさ、筋緊張の復帰、そして自発的に移動する能力を監視する。これらは、回復に向かって進行中のすべての良い指標である。ステープルまたは創傷クリップは7日以上の手術後に削除することができます。 </li></ol> III。経口強制経口投与<ol><li>丸い先端で18〜20 G強制経口針や栄養チューブを使用してください。胃管針は、その最後の肋骨に動物の頭の先端からの距離を超えるべきではない。 </li><li>動物の識別番号と観察可能な健康状態をチェックしてください。親指と指で肩の皮膚をつまんで優しく首筋動物を。拘束は、前部の手足が道の両側と外に拡大するために十分なだけの会社でなければなりません。動物は、針で把握できないようにする必要があります。 </li><li>ゆっくりと首と食道を通る直線を形成する、人差し指で動物の頭を後ろに引きます。親指の内側にある動物の背中をサポートしています。 </li><li>優しくして力のない、口の両側にと舌上胃管に針を挿入する。の滑らかな動きでは、針は口の屋根反対と食道下に渡す必要があります。重力は、会議の抵抗なく針を導く必要があります。どんなRESISTANがある場合CEは、針を削除し、再起動してください。動物のギャグとツバメの反射は、挿入時にトリガされることがあります。しかし、動物からの抵抗やあえぎはないはずです。動物は、針が鼻と胸の動きをチェックして場所にあるときに呼吸していることを確認することが重要です。 </li><li>徐々に用量のボリュームを分配するために注射器のプランジャーを押してください。 </li><li>ゆっくりと、それが食道を下に挿入された方法と同じ角度と経路で胃管栄養針を取り除く。 </li><li> 5〜10分間そのケージとモニターの呼吸と動作するために動物を返します。 </li></ol> IV。in vivoイメージング 我々はintrabursalキャビティに注入された細胞の挙動を監視するためにキャリパーライフサイエンスを使用してください。このシステムを用いた実験は、通常、腫瘍移植の時から4〜16週間の期間を持っている。 <ol><li> 1 mLのPBSで5〜20 mgを溶解し、滅菌のための0.22μmの膜を通して濾過することにより、D -ルシフェリン（ホタルルシフェラーゼの基質）の溶液を調製します。 </li><li>酸素とイソフルランガスの両方をオンにすることによって誘導室を充電してください。のみ誘導室へのガスの流れをONにします。動物がイメージを作成する準備が整うまで、イソフルラン流量が低レベルに維持されている。 </li><li>動物の識別番号と観察可能な健康状態をチェックしてください。イソフルランガスとの荷電誘導チャンバ内の動物を置きます。 </li><li>動物が麻酔のように見えるときにチャンバーから動物を取り外します。 30G針を用いて腹腔内注射によって調製ルシフェリン溶液200μLを実現。試験期間を通じてルシフェリンの注入およびイメージング性能の間の時間の一貫性を保つために、注射の時間を記録することが重要です。 </li><li>誘導室に戻ってルシフェリンを注入された動物を置きます。 </li><li>適切な設定にイメージングシステムを設定します。最初の動物の画像を取得する前にシステムを初期化してください。 </li><li>誘導室にガス流量をオフにし、画像処理室にガスの流れをONにします。 </li><li>麻酔動物の背側または腹側を上に置きます。適切な麻酔の誘導を維持するためにノーズコーンに動物の鼻を配置してください。動物のように緑のイルミネーションで示される&quot;金利グリッドのポイント&quot;内にあることを確認してください。 </li><li>室のドアを閉めて、適切なタイミングで画像を取得。時間は速度によって決定することができる。 </li><li>イメージングチャンバーから動物を削除し、そのケージに戻す置きます。 &quot;Intrabursalインジェクション&quot;で説明されているように動物の回復を監視します。 </li></ol> V.代表の結果<img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。同所マウスモデルにおける卵巣腫瘍細胞のin vivoイメージング 。ルシフェラーゼを発現するOVCAR5細胞は、右の卵巣にintrabursally注入し、経時的に撮像した。画像は、IVISのスペクトルイメージングシステムを用いて注入した後、日13（左）、17（中央）、および22（右）撮影した。背側は、下のパネルにある上側のパネルと腹側に示されています。注射後22日間は、腫瘍細胞の腹膜広がりに注意してください。 動物実験は、フォックスチェイスがんセンターの動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

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利害の衝突は宣言されません。

卵巣癌は、すべての婦人科悪性腫瘍の1の死亡の主要な原因です。この病気の高い死亡率は、その後半の診断と信頼性の高い診断法2の不足によるところが大きい。さらに、従来の化学療法は、しばしば化学療法抵抗性と癌3の再発に遭遇。従って、新規な治療が効果的にこの疾患を標的とするために必要です。ヒト卵巣癌を標的とする新しい治療法の開発では、それは代表的な動物モデルを開発することが重要です。 同所動物モデルは、その1で、従来の異種移植モデルに勝る利点（例えば、皮下または腫瘍細胞の腹腔内注射）を持っています）それが腫瘍形成のプライマリサイトを再現する、2）それは転移の一般的なサイトを表し、3）それは、腫瘍細胞を提供する適切な微小環境4、5、6、7、8と相互作用する。げっ歯類では、卵巣を取り囲み、卵管と連続するユニーク性ファブリキウス膜を持っている。げっ歯類のこのユニークな解剖学では、同所卵巣腫瘍細胞の注入が可能になります。 Intrabursally注入卵巣腫瘍細胞は、それによってintrabursal膜内で成長し、腫瘍が進行すると腹腔内に広がって、人間の病気と同じように動作します。安定的にルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質を発現する細胞の注入は、またリアルタイムで腫瘍細胞のトラッキング動作を可能にします。生物発光および/ ​​または蛍光イメージング技術は、非侵襲的に9時間と勉強腫瘍の成長、分配、および回帰の長期間にわたって繰り返し画像腫瘍細胞、10、11にそれが可能になります。 同所性モデルを確立する際に、それはすぐに注入時に嚢から針を除去することが重要です。突然のニードルシールの取り外し穿刺部位と注入された細胞の漏れを防ぎます。しかし、同時に、動きは滑液包を引き裂くしないように穏やかなはずです。漏れはインジェクションが発生した場合、それは腹部でシードに細胞が発生し、潜在的に時期尚早では卵巣の外に広がる研究、すなわち、混乱させることができる。このイベントでは、特定の動物を記録し、前治療あるいは以降の分析から排除への腹膜内に複数の腫瘍部位の開発に続きます。強制経口投与を行う前に、それは最後の肋骨に動物の頭の先端から測定することによって、胃管チューブの長さをチェックすることが重要です。それは、動物の鼻にチューブをマークしておくと便利ですし、このマークを過ぎたチューブを渡す必要はありません。このマーク過去のチューブの挿入は、胃に穿孔が生じることもできます。チューブの長さを決定することが20才未満gを秤量若い動物または動物で特に重要です。食道下に胃管針を挿入すると、動物からの抵抗や闘争があってはならない。これは逆流につながるし、その後不正確な用量のボリュームを提供するだけでなく、動物にストレスを加えることができるとして、それは速すぎて溶液又は懸濁液を投与することが重要です。随時匹敵する撮像結果を得るために、それは、ルシフェラーゼの基質とイメージングの注入の間の時間の整合性を保つことが望ましい。時間の経過は、基板の注射の後に一連のイメージを取り、信号の動態を観察することによって決定することができます。卵巣癌の同所性マウスモデルの開発、薬物の経口送達、 および in vivoイメージングでは、卵巣癌の開発と普及をより良く理解するために必要なテクニックであり、最終的にこの致命的な病気を持つ患者の転帰を改善することができる新たな治療レジメンを評価。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

ヒトの癌と治療に対する反応は良好同所動物モデルで表されます。本論文では、卵巣癌の同所性モデルマウス、経口薬の配信、 および in vivo イメージングシステムで使用してリアルタイムでの薬物治療への応答における腫瘍細胞の挙動の監視による癌の治療法の開発について述べる。この同所モデルでは、ルシフェラーゼを発現する卵巣腫瘍の細胞は、それぞれの卵巣が囲まれているマウス嚢に直接注入することにより、局所的に適用されています。 D -ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼの基質の注入時には、ルシフェラーゼを発現する細胞は、生物発光シグナルを生成する。この信号は、in vivoでのイメージングシステムで検出し、個々の動物において腫瘍の成長、分配、および回帰を監視する非侵襲的な手段を可能にしています。を10 mL / kg体重の最大投与量は、胃に直接配信されると密接に臨床治療における薬物の配信のようなことするために強制経口投与を介して薬剤投与が可能です。したがって、技術は、、ここで卵巣癌、薬物の経口送達、及びin vivoイメージングの同所性マウスモデルの開発を説明したヒト卵巣癌および治療 ​​のより良い理解のために有用であり、この疾患をターゲットに改善されます。

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

卵巣癌の同所性動物モデルは、より良い人間の病気を複製し、従って、癌の進行と治療に対する腫瘍の反応の理解を高める。マウスモデルでは、ルシフェラーゼを発現する卵巣腫瘍細胞のintrabursal注射を受け取ります。治療は、経口胃管栄養法により投与される。腫瘍の成長はによって監視されています<em&gt; in vivoで</em&gt;イメージングシステム。

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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ビデオ: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

大腸癌の同所性マウスモデル

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

生物学

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

イメージングステント内再狭窄：安価な、信頼性、および迅速な前臨床モデル

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

生理条件下での細胞内膜リモデリングを調査するためのマウス皮膚における好中球移動のイメージング

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

mtHyper7を用いた生酵母細胞における過酸化ミトコンドリアのイメージング

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

著者スポットライト:ミトコンドリア研究の進歩 - 細胞内解析のためのmtHyper7バイオセンサー 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...