このプロジェクトは、ジョンズ·ホプキンス大学、 ゲートウェイ科学イニシアティブ及びキアゲン社を通じて学長のオフィスによって部分的にサポートしていた

はじめに：単一の細菌コロニーを一晩インキュベートされ、適切な培養液を接種するために使用されるべきである。細菌ペレットは、その後、市販のゲノム分離キットを用いてゲノムDNAを精製するために処理される。精製されたゲノムDNAは、サンプルは、タンパク質の混入がないことを保証するために280分の260（nm）の比を&gt; 1.8を持っている必要がありますパイロシーケンシングテンプレートの生成に必要なゲノムDNAの量が10〜20 ngのである。 テンプレートのA.増幅 （PyroMark PCRハンドブック; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com /ハンドブック</a> 1） PCR反応を設定する 注：一方のプライマーは、その5 &#39;末端にビオチン化しなければならず、それはそれは、テンプレート作成用HPLC精製することをお勧めします。我々は、PCRとSEのPyroMarkアッセイデザインソフトウェア2.0を推奨短いリードシーケンシング用に最適化されたquenceプライマーの設計は、しかし、プライマー-BLAST（ <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> NCBIから）もできますプライマー設計のために使用される。 <ol><li>必要なすべてのソリューションを（ 表1に記載）解凍し、それぞれ徹底的に混ぜる。 表1に従って反応を設定します。すべての作業は室温で行うことができる。 </li></ol> 注：PCRマスターミックスは、ほとんどのケースでは満足のいく結果を提供する1.5mmの最終濃度のためのMgCl 2を含んでいます。より高いの Mg 2 +は濃度が必要な場合は、25のMgCl 2の最大3.5μlの反応液に添加することができる。 <ol start="2"><li>徹底的に軽く上下にピペッティングによって反応ミックスを混ぜて、その後、適切な量をPCRチューブに分注する。 </li><li> templatを追加各PCRチューブに電子は、DNA。私たちは、ゲノムDNA 10ngのをお勧めします。 </li><li>表2に従ってサーマルサイクラーをプログラムする。 4の最終ホールド°Cは、利便性をお勧めします。 100μlのミネラルオイルとオーバーレイ反応、加熱蓋なしでサーマルサイクラーを使用している場合。 </li><li>サイクラーにPCRチューブをセットし、サイクリングプログラムをスタートする。 </li></ol> B.真空ステーションプロトコルビオチン化PCR産物を固定化する<ol><li> 図4によるとマスターミックスを作る。 </li></ol> 注：ピペッティングの前に、静かに均一な懸濁液を確実にするためにストレプトアビジンコートセファロースビーズのボトルを振る。 <ol start="2"><li>使用したPCR産物の量に応じて、ウェルあたり80μlの総容積を与えるためにPCRプレートの各ウェルに60〜75μlのマスターミックスを分注する。 </li><li>各ウェルに5-20μlのビオチン化PCR産物を追加します。 </li><li>ストリップCAに井戸を封印オービタルシェーカーを用いて室温（15〜25℃）で5〜10分間1,400 rpmでPCRプレートをPSとを攪拌。 </li></ol> DNAの変性とプライマーを配列の追加<ol><li>バッファをアニーリングと0.3μMにシーケンシングプライマーを希釈し、反応プレートの各ウェルに25μlずつ分注する。ワークステーション上にプレートを置きます。 </li><li> 図5図に従って、ワークステーションの谷を埋める。 </li><li>真空ポンプの電源を入れ、真空ツールのスイッチが（ 図6）上に設定されていることを確認してください。トラフ5で高純度水（ミリQ 18.2 MW Xセンチまたは同等品）（ 図5）でフィルタープローブをフラッシュします。リフィルステップ12で使用するための新鮮な高純度水でトラフ。 </li><li>すぐに働くことは、ワークステーション上のビーズをPCRプレートを配置。両方のプレートはサンプルがロードされたときと同じ向きであることを確認します。 </li><li> ON真空スイッチと、真空を下げる20秒またはすべてのボリュームを吸引されるまでPCRプレートのウェル中に工具。ビーズを真空ツール（ 図7）によって捕捉される。 </li><li>まだON真空で、20秒間、またはすべてのボリュームが吸引されるまで70％エタノール（谷1）を使用してツールをフラッシュします。 </li><li> ON真空で、20秒間変性溶液（谷2）ツールをフラッシュまたはすべてのボリュームが吸引されるまで。 </li></ol> 注：変性Solutionは目や皮膚刺激性である水酸化ナトリウムが含まれています。常に白衣、手袋、保護用眼鏡を着用してください。 <ol start="8"><li> ON真空で、20秒間洗浄バッファー（トラフ3）でツールをフラッシュまたはすべてのボリュームが吸引されるまで。 </li><li> ON真空では、すべての液体が吸引ツールの外に排出することができるように、5秒間90°を超えて垂直に真空ツールを上げる。ポンプの電源をオフにして、反応プレートと真空ツールを揃える。に真空ツールを下げ井戸やそっとでは、配列決定プライマーを含むウェルにビーズを解放するために左右に振る。 </li><li>バキューム·ツールをきれいにするために、10秒間高純度水（トラフ4）内のフィルタのプローブを攪拌する。 </li><li> ON真空スイッチとすべてのボリュームが吸引されるまで20秒以上のために高純度水（谷5）ツールをフラッシュします。 </li><li> 5秒、90°Cを超えて垂直に真空ツールを上げ、その後、真空をOFFに切り替えると &quot;駐車場&quot;の位置に格納します。 </li></ol> DNA鎖に配列決定プライマーをアニーリング<ol><li>予め温めておいたプレートホルダーに反応プレートを置きます。 </li><li> 2分間80℃ヒートブロック°Cの上にプレートを加熱する。 </li><li> 5分間室温で冷却するようにカウンターの上にホルダーと場所からプレートを取り外します。 </li></ol> Pyromark Q24操作 注：電源コードの上にある電源スイッチを使って楽器をスイッチオン。星TUPは、1分ほどかかる場合があります。 <ol><li> PyroMarkゴールドQ24試薬ハンドブック2に記載されている指示に従って、カートリッジを埋める。測定器ソフトウェアで実行ファイルを設定し、必要なボリュームを決定し、[ツール]メニューの下に事前実行情報を選択する</li><li>楽器に既にあった場合、それが実行を行っていないことを確認した後、ふたを開ける。蓋が開いている場合、それはそうすることが安全であるときに可聴警告信号が送られる。 </li><li>カートリッジのゲートを開いて、ラベルが（ 図8）手前にしてカートリッジを挿入します。カートリッジが正しく（ラインが正面に見えるはずです）が挿入されていることを確認し、ゲートを閉じます。 </li><li>楽器内部のサンプルを用いて、板保持枠と位置プレートを開きます。 </li><li>プレート保持枠と機器蓋（ 図9）を閉じます。 </li></ol>実行の開始<ol><li>実行ファイルをUSBスティックを挿入sが機​​器の前面にUSBポートに測定器ソフトウェアで作成された。 </li><li>メインメニューの &quot;ファイル名を指定して実行&quot;を選択し、 &quot;OK&quot;を押します。 </li><li>目的の実行ファイルを選択し、 &quot;選択&quot;を押してスクロール矢印を使用します。 </li></ol> 注：楽器はすべての設定圧力と温度のレベルに達したとき（これには数分かかる場合があります）試薬の分注を開始します。実行中、計器画面がリアルタイムで選択ウェルのパイログラムを表示します。他の井戸のパイログラムを表示するには、スクロール矢印を使用します。 実行の完了<ol><li>楽器は、実行が終了すると、実行ファイルをUSBスティックに保存されていることを確認すると、 &quot;閉じる&quot;を押します。 </li><li> USBスティックを取り外します。実行が終了する前に、それが削除された場合は、USBスティックを挿入します。 &quot;管理&quot;とし、 &quot;コピー保存されていない操業&quot;を選択します。 </li><li>実行ファイルが開かれ、測定器ソフトウェアを用いて分析し、比較することができるIdentifireソフトウェアを使用して、既知の微生物のライブラリ。 </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

この記事への生産とフリーアクセスはQiagen社が主催しています。 著者アーメド、ドローチャー、ジェッセンとヴァルディは、この記事で使用される試薬および器具を生産キアゲン社の従業員です。

いくつかの新しい次世代シーケンシング法が実用化されている。最も広く使用されている方法の三人は合成によるイオン半導体シーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、およびシーケンシング（SBS）であり、これらのメソッドの3-11各合成による配列決定に依存しますが、取り込まれたヌクレオチドの検出のための新たなプラットフォームを採用しています。イオン半導体シーケンシング、DNAの一本鎖でシーケンストランドのためのテンプレートとして機能します12ポリメラーゼ及びヌクレオチドがパイロシーケンシングのように順次追加されます。ヌクレオチドが成長するDNA鎖に追加されると、水素イオンが放出される。水素イオンは、電界効果トランジスタ基盤のセンサーによって検出される。 単一分子リアルタイムシーケンスは、ゼロモード導波管（ZMW）に依存します13 ZMWが単一ポリメラーゼ分子がウェルの底部に取り付けられている小さな構造です。それは、フロールように点灯している香り分子を検出することができる。各ヌクレオチドは、蛍光分子でタグ付けされています。蛍光標識ヌクレオチドが組み込まれたように、検出器は、ヌクレオチドを​​識別します。次のヌクレオチドが追加されると、蛍光分子が切断される。14 合成によってシークエンシング（SBS）。15一本鎖テンプレートが生成され、次いで、相補鎖が合成されるユニーク配列のクラスターが生成されるように、標的DNAを増幅するユニークな方法を使用する。各ヌクレオチドは、蛍光分子で標識されており、各基地添加後に添加される塩基の蛍光が記録される。

パイロは &quot;合成による配列決定&quot;の原則に基づいているシーケンス核酸への迅速かつ正確な方法である。 &quot;合成により配列決定は、&quot;一度に一つの基地相補鎖を合成する一本鎖DNAテンプレートを使用し、組み込まれた塩基（A、T、G、C又は）化学発光シグナルの検出によって各段階で検出することを含む。パイロシーケンシング反応は、鋳型DNA、のdNTP（dATPを、dGTPを、dTTPの、dCTPを）、DNAポリメラーゼ、ATPスルフリラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびアピラーゼが含まれています。合成反応は、4つのdNTPおよびビオチン化一本鎖鋳型DNAにDNAポリメラーゼのいずれかを添加することによって開始される。 DNAポリメラーゼは、ピロリン酸の次のリリース（ 図1）で、テンプレートの上に補完的なdNTPを組み込まれています。 ATPスルフリラーゼは比例してATPのピロリン酸に変換されます。 ATPは、オキシルシフェリンにルシフェリンルシフェラーゼ媒介変換のための触媒として作用する光（ 図2）を生成します。光の強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例し、一つ以上の特定のdNTPは（のdATP、dTTPを、dGTPを、またはdCTPを）を順次テンプレート鎖（ 図3）上に存在するかどうかを判定する。取り込まれていない任意のdNTPは、従来の合成反応の継続のための次のdNTPを添加するアピラーゼによって分解される。一本鎖DNAテンプレートのDNA配列が決定されるまで、この &quot;合成による配列決定&quot;反応は、4つのdNTPを添加して繰り返される。 パイロシーケンシング反応のアニメーションを表示するには<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">、ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

パイロシーケンシングでは、細菌種を識別する菌株を識別および抗微生物剤に対する耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出するために使用することができる微生物のゲノムの配列決定を容易にする汎用性の高い技術である。微生物学アプリケーション用パイロシーケンシングの利点は、迅速かつ信頼性の高いハイスループットスクリーニングや微生物や微生物のゲノム変異の正確な識別を含む。パイロは、合成反応中に組み込まれ、特定のヌクレオチドの存在を決定しながら、同時に相補鎖の一塩基を合成することにより、DNAの配列が含まれます。反応には、4つのデオキシリボヌクレオチド（dNTPを）を順次加えて、非法人のdNTPは、合成反応の隣のdNTP添加前に酵素的に分解されて固定化された一本鎖鋳型DNA上で行われます。テンプレートに組み込まれた特定の塩基の検出は、chemilumの発生によって監視されるinescent信号。化学発光シグナルを生成するのdNTP順序は、テンプレートのDNA配列を決定する。パイロシーケンシング技術のリアルタイムシーケンシング機能は、単一のアッセイで迅速な微生物の同定を可能にする。また、パイロシーケンシング器具は、いくつかの抗微生物抵抗で発生する可能性のあるSNPのタイピング、点突然変異、挿入、および削除、ならびに複数の遺伝子コピーの定量化を含む抗微生物薬剤耐性の完全な遺伝的多様性を分析することができパターン。

典型的なパイロシーケンシングの結果は、ソフトウェアを用いて実行するアンプリコンの生成に使用されるフォワードおよびリバースプライマーの位置、および保存された16Sリボソーム配列（ 図10）内のパイロシーケンシング反応に用いたプライマー配列決定を示す。プライマーとの間の可変配列サイトは、保存された配列決定プライマー（5&#39;-TACATGCAAGTCGA）を用いて細菌種の数が多い細菌同定を可能にする。内部品質管理として、DNA配列のブラケットは、可変領域が正しいDNA領域が分析されることを保証するためにチェックすることができる。パイロシーケンシングソフトウェアでは、細菌の同定のための細菌のリボソームの配列の内部データベースに生成されたシーケンスの比較および整列することができます。さらに、配列は、抗生物質耐性を付与する変異を決定するために分析することができる。 Helicobの23Sリボソーム遺伝子の変異の例については、分析アクター·ピロリ菌は、抗生物質耐性を付与する2変異パターン（GAAまたはAGA）（ 図11）を示しています。同じ患者からの複数の分離株の分析を同時に微生物の薬剤耐性の発生の疫学的調査を支援するために経時的に薬剤耐性の出現を追跡するためにアッセイすることができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> 図1。ビオチン化されたPCR産物はピロリン酸（PPiを）の発生につながる、DNAポリメラーゼによってdNTPのを組み込むためのテンプレートとして使用される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> 図2。 ATPスルフリラーゼは比例してプロである光を生成するオキシルシフェリンにルシフェリンルシフェラーゼ媒介変換のための触媒としてATP。ATPの行為にピロリン酸に変換ATPの量にportional。光はパイログラムトレース上のピークとして記録され、ヌクレオチドの取り込みを示している。次のdNTP、合成の継続のために追加される前に取り込まれていないのdNTPはアピラーゼによって分解される。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> 図3。一つ以上の特定のdNTPを（のdATP、dTTPを、dGTPを、またはdCTPを）を順次テンプレート鎖上に組み込まれた場合に発生する光の強度を示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> 図4。ビオチン化されたPCR産物を固定化するマスターミックスを調製するためのフローチャート。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> GE = &quot;常に&quot;&gt; 図5。 PCRプレート、PyroMarkプレート、およびトラフの場所とPyroMarkワークステーション。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> 図6。ポジションONとOFF真空スイッチの位置。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> 図7。真空ツール。真空ツールの適切な取り扱い。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> 図8。カートリッジゲートの場所にカートリッジにオープンしました。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> 図9。ゲートを閉じた状態でカートリッジが正しく挿入。 &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> 図10。ベース細菌の同定結果をパイロシーケン。PCRプライマーは、DNAテンプレートの保存領域用に設計され、そして配列決定プライマー（青で示されている）アンプリコン内の可変DNA配列を同定十分に特徴付けのすぐ上流に配置されている。 <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> 図11。パイロシーケンシングを用いたヘリコバクター·ピロリ菌に抗生物質薬剤耐性の検出。GAAまたはAGA配列を含むヘリコバクター·ピロリに抗菌耐性を付与する23S遺伝子の変異の分析は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="1"><tbody><tr> &lt;TD&gt; コンポーネント </td><td> 反応あたりの体積 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>パイロPCRマスターミックス、2倍</td><td> 12.5μlの</td><td> 1X </td></tr><tr><td> CoralLoadコンセントレイト、10倍</td><td> 2.5μL </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 25のMgCl 2（オプション） </td><td>変数</td><td> ≥1.5 mMの</td></tr><tr><td> 5X Q-ソリューション（オプション） </td><td> 5μlの</td><td> 1X </td></tr><tr><td>プライマー/プライマーB </td><td>可変/可変</td><td> 0.2μM/0.2μM </td></tr><tr><td> RNaseフリー水</td><td>変数</td><td> - </td></tr><tr><td> 総容積（鋳型DNAを添加した後） </td><td> 25μlの </td><td></td></tr></tbody></table> 表1。 PCRの反応混合物。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ＆NBSPは、 </td><td></td><td> 追加のコメント </td></tr><tr><td>最初のPCR活性化ステップ</td><td> 15分</td><td> 95°C </td><td> HotStartTaq DNAポリメラーゼが活性化される</td></tr><tr><td> 3ステップサイクリング：変性</td><td> 30秒</td><td> 94°C </td><td></td></tr><tr><td>アニーリング</td><td> 30秒</td><td> 60°C 56°C </td><td>ゲノムDNAのために バイサルファイト変換DNAのために</td></tr><tr><td>拡張</td><td> 30秒</td><td> 72°C </td><td></td></tr><tr><td> サイクル数 </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 最終伸長 </td><td> 10分</td><td> 72°C </td><td></td></tr></tbody></table> 表2。 PCRサイクル仕様。

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Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

パイロシーケンシングでは、細菌種を識別する菌株を判別し、抗菌剤に対する耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出するために使用することができる微生物のゲノムの配列決定を容易にする汎用性の高い技術である。このビデオでは、微生物のアンプリコンの生成、アンプリコンパイロシーケンシング、およびDNA配列分析のための手順が実証​​される。

微生物の同定とキャラクタリゼーションのためのパイロシーケンシング

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

46.9K ビュー.  Johns Hopkins University. パイロシーケンシングでは、細菌種を識別する菌株を判別し、抗菌剤に対する耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出するために使用することができる微生物のゲノムの配列決定を容易にする汎用性の高い技術である。このビデオでは、微生物のアンプリコンの生成、アンプリコンパイロシーケンシング、およびDNA配列分析のための手順が実証​​され?...

ビデオ: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

自然と実験室での微生物群集 - インタビュー

生物学

Biology of Microbial Communities  - Interview

微生物群集の生物学 - インタビュー

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

微生物システム生物学のケモスタットの使用

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

植物プロモーター解析: 同定とルート、インゲンの根粒特異的プロモーターの解析

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

インシリコで 宿主-病原体相互作用におけるcircRNAの同定と特性評価

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...