我々は、POLAR :: POLAR-EGFP構築するための時間経過プロトコルとリンPillitteriの開発を支援するためのアマンダRychelに感謝します。また、PM-rbが構築提供するためABRCに感謝しています。このプロトコルは、日本科学技術振興機構からさきがけ賞の支援により開発されました。 POLARの研究はまた、ワシントンロイヤリティ研究基金（RRF-4098）、国立科学財団（MCB-0855659）の大学によってサポートされていました。 KMPは、NSF大学院リサーチフェロー（DGE-0718124）であり、本学では、ハワードヒューズ-GBMFの研究者でもある。

1。種子消毒<ol><li> 33％の家庭用漂白剤、0.1％トリトンX-100：種子消毒液を準備します。 </li><li>所望の蛍光レポーターコンストラクト（s）と遺伝子型（S）1.7 mlチューブ、滅菌溶液1mlを適用を運ぶ場所の種。 15分間nutatorでインキュベートする。 </li><li>無菌フードでは、背後にある種子を残して、チューブから消毒液を除去するためにピペッターを使用しています。 1ミリリットル滅菌水ですすいでください。 4回繰り返します。 </li><li> 2日間以上、4℃でインキュベートする。 </li></ol> 2。商工会議所スライドメディアの準備<ol><li>溶解するまでバクト200mlのフラスコ内の水に寒天（アガロース純粋ではない）、およびマイクロ波の0.5％溶液の20ミリリットルを混ぜる。ソリューションを煮沸するときは注意してください。 </li><li>約60℃に冷却ソリューションを</li><li>ピペッターを用いた寒天溶液1mlを採取し、徐々にチャンバースライド内部のカバーガラス（ラボ·テックIIチェン＃1.5ドイツのカバーガラスシステム）に適用されます。ソリューションワットHICHは、接着剤や割れたガラスを溶かすことがあまりにも早すぎるホットまたは適用される。 </li><li>すぐに寒天溶液の第二mlを加える。寒天培地は完全にスライドチャンバーの底をカバーする必要があります。この最小限のメディアでは、水分を維持し、ガス拡散を可能にすることにより、四から五日間貯蔵養分​​が含まれている植物の子葉、、で開発をサポートするために十分です。 </li><li>チャンバーと実験台上でクールなスライドが覆われている。フラスコをしっかりとカバーされている場合、解決策は、将来の使用のために保存され、再加熱してもよい。 </li></ol> 3。種子の解剖<ol><li> 4°C貯蔵種子から無菌のチューブを取り外します。 </li><li>解剖顕微鏡のステージ上にティッシュペーパーを置き、水で湿らせます。滑らかな表面を作成するために組織を調整します。組織を切開するための種を安定させるために使用されています。 </li><li>ピペットでチューブから組織への20から30種を、ビューの解剖スコープのフィールドにそれらを配置するように注意してください。 </li><li>鋭い鉗子（Roboz、＃5生物学の先端）を使用して、慎重に苗内側から種皮を除去します。外側と内側の両方の外皮を除去しなければならない。 </li><li>撮像する際子葉、それは胚軸と幼根を除去するために有益である。子葉は、このプロトコルの下で数日間のために開発するのに十分な栄養素が含まれています。無傷の場合、胚軸は、ビューの時間経過のフィールドの子葉を外に移動し、劇的にまっすぐに長くなります。胚軸の自由子葉をスライスするためにメスを使用してください。 </li><li>マイクロチューブまたは同様に、水に浸漬解剖子葉を開催しています。 </li><li>子葉の希望数に達するまで3.4から3.6を繰り返します。 15から20まで成功解剖をマウントする前に、推奨されています。 </li></ol> 4。チャンバースライドで取り付け子葉<ol><li>小さ ​​い（18 mm 2）のカバースリップ、寒天培地をカットとチャンバースライドのガラス基盤からレイヤー全体を持ち上げるを使用。 </li><li>持ち株からの水の最低ピペット解剖子葉持ち上げた寒天層下チャンバースライドにチューブ。 </li><li>優しく子葉上に寒天を下げる。余分な水が存在する場合は、子葉を乱さないように注意しながら、組織とそれを取り除く。マウントが完了すると、標本はもはや簡単に移動するべきではありません。 </li><li>チャンバースライドにカバーを置き、顕微鏡のステージにスライドを移動します。 </li></ol> 5。タイムラプスイメージング<ol><li>画像希望のフルオロフォア（s）に倒立共焦点顕微鏡をセットアップします。使用LSM700パラメータ：GFP、440から530 nmのバンドパスフィルターと488nmおよびコレクションでの励起のために、RFP、570から610 nmのバンドパスフィルターと555 nmおよびコレクションでの励起のために。 </li><li>マウントされた損傷のために検体を検査します。顕微鏡ソフトにプログラムそのまま、正しくマウント子葉の場所を。禅、2009年：20倍対物レンズとチャンバースライドの中心に客観的な動きに子葉に焦点を当てる。 アクイジションモード下では、0.5にズームを変更し、 フレームサイズ&lt;/ 48x48ピクセルにem&gt;です。 体位体位下のチェックボックスをオンにして、 スキャンの概要のイメージ[...]ボタンを選択し、30から35に水平方向および垂直方向のタイル数を増やします。スキャンが完了すると、観察する各子葉で[ディメンション]タブと場所の十字線の下に位置]ボタンをクリックします。 </li><li>すべてsamples.In禅2009の子葉の表皮を網羅Zシリーズを設定しますzスタックチェックボックスをクリックします。 ポジション·リストの下の各位置を選択し、ボタンに移動]をクリックします 。子葉の表皮の最上層の面に焦点を当てると、Zスタックの下の最初に設定 ]ボタンをクリックします。表皮が有用に表示されている最も低い位置にピントを合わせて設定された最後のボタンをクリックします。設定するには、最善のzスライス厚を示して、 最適の横にあるボタンをクリックしてください。これらの設定は、すべてのサンプルを包含することを確認するために各子葉をチェックし、zパラメータは個人ラージヒルに設定することはできません禅2009年idual位置。 </li><li>目的の解像度と長さの時系列を設定します。 3日間15〜30分の間隔は、表皮細胞分裂におけるタンパク質ダイナミクスのに有効である。この間隔は、必要に応じて変更することができます。禅2009年： 時系列チェックボックスをクリックします。 時系列の下では、テキストフィールドにスライダーやタイピングを用いて所望の画像の数のためにサイクルを設定します 。 30 の間隔を設定すると min を選択するプルダウンメニューを使用しています。 </li><li> xyzt多位置のスキャンを開始します。位置の数は、スキャンの仕様によって制限されなければならないことに注意してください。合計スキャン時間は、所望の間隔よりも大きい場合には、時点が正確でなくなります。 6同時位置の最大値は59で撮像する際GFPおよびRFP可能です我々のシステムを用いて30分間隔でzスライス。希望する解像度に変更フレームサイズと実験の開始]をクリックします ：2009年の禅。 </li></ol> 6。ビデオの編集<ol><li>共焦点データファイルから、最大強度、TIFFなどロスレス形式の画像ファイルとして各時間/位置の組み合わせと輸出のz投影する。ファイル名は、映画にそれらを結合するためのソフトウェアのための位置ごとに1シリーズ（ 例えば 、極性GFP_0001_pos1など、POLAR-GFP_pos1_0001、POLAR-GFP_pos1_0002ない）でなければなりません。禅2009年：その後、別々のファイル、 最大値投影にポジションを分割する処理]タブの下のサブセット：コピーを使用します。最後に、TIFF（： -シリーズエクスポート、フル解像度の画像ウィンドウファイル ）としてエクスポートします。 </li><li> bUnwarpJマクロ9（：登録：bUnwarpJプラグイン ） を実行して、連続した画像を配置するフィジー7,8を使用しています。 Monoに登録モードを変更します。すべての詳細オプションは、デフォルト値を使用することができます。長い時間の経過シーケンスの場合、自動的に一連の画像にbUnwarpJを適用するマクロ &quot;アフィン+一貫弾性2Dイメージのレジストレーション&quot;、およびオープンyをダウンロードしてインストールするそれを使用するイメージシーケンス：インポート：我々のデータは、 ファイルを使用しています 。 MOPSのランドマーク抽出と実行のチェックをはずします。 </li><li>整列した一連の画像を開いて、目的のビデオ形式（AVIは良い選択です）で保存するフィジー/ ImageJのまたはQuickTime Proを使用しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development.">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449 (1995).</li><li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis.">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).</li><li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このタイムラプス共焦点技術は極性および他の動的に変化するタンパク質の場合には、それらの機能を適切に理解するために重要であるシロイヌナズナの子葉の表皮の個々の細胞の蛍光標識タンパク質の発現と局在の縦断的研究を可能にします。以前は、持続時間タイムラプスイメージングはシロイヌナズナの根真菌感染症11、分裂組織の成長5,12を調べるために...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td>ワンチャンバースライド</td><td>ヌンク（サーモサイエンティフィック） </td><td> 15536​​0 </td><td>または二室（155379） </td></tr><tr><td>レーザースキャニング共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSM700 </td><td>禅2009ソフトウェア</td></tr><tr><td> 20倍の対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td> 420650-9901 </td><td> NAが0.8、プラン·アポクロマート</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ベンツ（ナショナル） </td><td> 431TBL </td><td>下から照らす</td></tr><tr><td> ＃5鉗子、生物学の先端</td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-4978 </td><td>非常に細かいヒント重要である</td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

発達シーケンス全体細胞挙動の in vivo動態のイメージングは組織パターン形成のメカニズムを理解するための強力なテクニックです。動物の発生時には、鍵の細胞増殖とパターニングのイベントは非常に迅速に行われます。例えば、幼虫の体の計画に必要な線虫（Caenorhabditis elegans）のすべての細胞分裂が7分裂サイクル1で、受精後6時間以内に完了され、 ショウジョウバエの胚発生の16以上の有糸分裂は、24時間2未満で発生します。これとは対照的に、植物の開発時に細胞分裂は、通常、3,4,5日のオーダーで、遅いです。これはユニークな挑戦と植物器官形成時の細胞分裂と分化のイベントの動的挙動を文書化するための長期的ライブイメージングの必要性を課している。 シロイヌナズナ表皮が植物にシグナリング、細胞の運命、そして開発を調査するための優れたモデル系である。子葉では、この組織は、空気と均等に分散気孔が点在して耐水性舗装細胞、開いたり閉じたり、ガス交換と水の損失を制御することをバルブで構成されています。これらの気孔の適切な間隔は、それらの機能に重要であり、その開発は、非対称分裂と組織表皮（ 図1）を生成する細胞分化段階の順序に従います。 このプロトコルは、開発の数日間にわたって表皮内の細胞やタンパク質の観察を可能にします。この時間枠は、幹細​​胞の分裂と気孔と表皮舗装細胞を含む表皮細胞の分化の正確なドキュメンテーションを可能にします。蛍光タンパク質は細胞分裂と分化の過程で、そのダイナミクスを評価するために、目的のタンパク質に融合させることができる。この手法は、番目の気孔系統細胞の増殖段階で、私たちは新規タンパク質、POLAR 6の局在を理解することができますそれが細胞内で発現されている電子シロイヌナズナ子葉表皮は、除算が発生する直前に細胞表層の特性領域に非対称分裂のイベントや動きを先行。画像が登録され、合理化されたビデオは簡単に彼らが時間の経過とともに変化するような動的なタンパク質の局在および細胞型を可視化するために、パブリックドメインソフトウェアを用いて製造することができる。

<html>このメソッドを使用して収集された有益な時間ポイントのセットは、 図3に示します。 30分の時間スケールでの細胞膜はRFP（PM-RB）で標識され、GFPは、その天然のプロモーター下POLARタンパク質に融合されている（POLAR :: POLAR-GFP）6、我々は、タンパク質の局在の変化とともに細胞分裂を参照してください。を前に付けます。気孔の系譜フォーム幹細胞様さらに?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination at JoVE.com

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K ビュー.  University of Washington. 我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができ?...

ビデオ: Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

生物学

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...