この方法は、インタクトなシロイヌナズナの葉の免疫などの動的生物学的事象中の目的の遺伝子の時空間的調節に答える助けとなる。この技術の主な利点は、数日にわたって植物の葉を生み出した土壌中のプロモーター活性の時空間的ダイナミクスを捕捉できることです。この手順を開始するには、プラスチックセルプラグトレイにオートクレーブ土壌を充填します。
各細胞に1つのトランスジェニックシロイヌナプシス種子を播種する。23°Cに維持されている成長室にトレイを移し、2〜3週間連続した白色光条件下で植物を成長させます。病原体の接種の2日前に、グリセリンストックからavrRpt2を持つ病原体を、1リットル当たり100ミリグラムのリファンピシンと1リットル当たり50ミリグラムのカナマイシンを含むNYG培地にストリークする。
摂氏28度で48時間インキュベートします。プラスチックチップを使用して、培地の表面に現れる細菌細胞を収穫する。10ミリモル塩化マグネシウムを含むプラスチックチューブに細菌を移し、それらを再中断します。
その後、600ナノメートルで溶液の光学密度を測定する。通常0.2のOD600に対応するミリリットル当たり1億コロニー形成単位に細菌細胞の最終濃度を調整します。まず、2~3週齢の植物を含むセルプラグを慎重に切り取り、植物に損傷を与えないようにします。
バランスを保つために、空のセルプラグトレイにセルを設定します。接種のために目に見えて健康な葉を選択してください。一般的に、植物の底から第3、第4、および第5の葉は扱いやすいことを示します。
長期間のタイムラプスイメージングのために接種前に植物を保持している土壌に水を与えます。場合により、ストレス応答性プロモーターを解析する場合、病原体接種前の蛍光体顕微鏡下で葉を調べ、YFPシグナルの存在を検証する。次に、浸潤時に病原体との直接接触を避けるために使い捨てラテックス手袋を着用する。
1ミリリットルの無針プラスチック注射器を使用して、慎重に細菌の懸濁液で葉の腹軸側に浸透します。葉の半分に小さな部分を接種することで、PR1プロモーター活性の良好な可視化が可能となる。柔らかいペーパータオルを使用して、浸潤した葉の浸潤領域を取り巻く領域から余分な細菌の懸濁液を吸収します。
接種直後に、外科用テープを使用して、浸潤した葉がガラススライドの中央に位置するように、プラスチックトレイにガラススライドを固定します。接種された葉の刃がガラスのスライドの中に完全に取り付けられていることを確認して下さいます。浸潤した葉のペティオールに沿ってスペースに合わせて二重層プラスチックテープを2つに切り、各部分の隅を切り取ります。
細かいピンセットを使用して、各部分のカットコーナーが葉の刃のベースに合うように、これらのテープをペチオールの両側に貼り付け、テープピースがペティオールまたはリーフブレードに触れないようにします。次に、テキスト プロトコルの図 2 に示すように、二重層化されたプラスチック テープを追加で準備します。このテープを以前に貼り付けた部分の上に貼り付けて、ペティオールの上に橋を架け、テープ片の間にペティオールや葉の刃を直接捕まないように注意してください。
次に、小さな外科テープを葉の刃の先端の上のガラススライドにそっと貼り付け、スライドに非常に柔らかく固定します。スライドに直接触れているテープの部分だけをしっかりと押し下げます。ペチオールがガラススライドとプラスチックテープピースの両方に非常に柔らかく固定されるように、ペチオールの境界に外科テープの別の小片をそっと置き、ガラススライドまたはプラスチックテープ片に直接触れている外科テープの部分のみをしっかりと取り付けます。
浸潤した葉から離れて隣の葉を静かに保持するために土に穏やかに200マイクロリットルピペットチップを挿入します。まず、蛍光体顕微鏡をオンにします。画像化のために立体顕微鏡の対物レンズの下の空間に植物をセットする。
タイムラプスイメージングのパラメータを設定します。従来のYFPフィルタを使用して、YFP信号を可視化します。テキサスレッドフィルターを使用してクロロフィルの自己蛍光を可視化し、PCDドメインがYFP陽性細胞層に囲まれた暗い領域として表示されるようにします。
次に、従来のepi-brightフィールド設定を使用して追加の光暴露ステップを行い、光が植物の免疫に大きな影響を与えるため、タイムラプスイメージングの間隔期間中に光暴露のためのステップをプログラムすることを確認します。タイムラプスイメージングプログラムを実行します。数日間の長期観察のために、植物に適切に水をやすることを検討してください。
画像取得後、データ セットからの間隔で光の露出に使用する余分なチャネルを省略します。画像解析ソフトウェアを使用して、対象地域解析など、さまざまな方法でデータを解析します。本研究では、インビジニドプス葉の取り付けのための多目的な方法が、生体内タイムラプスイメージングのために実証されている。
avrRpt2誘導ETIを用いたタイムラプス画像データの代表的な例は、一連の画像として、またタイムラプスムービーとして得られる。avrRpt2誘導ETI中にpPR1-YPF-NLSを用いた実験に成功し、PCDドメインを取り巻くYFP発現病巣および数層の細胞から明らかなように、PR1プロモーターの一時的な活性化が観察される。PCDドメインを取り巻く細胞におけるPR1プロモーターの活性化は、通常、接種後約5時間で始まり、接種後約12時間でピークを迎え、接種後最大40時間続く。
この手順を試みる際には、テキストに記載されているようにタイムラプス条件を慎重に設定する必要があります。この手順に従って、プロモーター活性を、分析ソフトウェアを用いて定量的および定性的に分析することができる。これらの分析は、シロイヌナズナ植物の生きている葉で起こる生物学的事象における遺伝子発現の時空間的ダイナミクスを探求するのに役立ちます。
