Name: live confocal imaging of developing arabidopsis flowers
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

著者は彼のサポートのための教授エリオット・M・マイヤーウィッツ感謝したい、として技術的な問題の解決に彼らの助けのためのカリフォルニア工科大学の生物学的イメージング施設で、ダートマス大学博士とアンドレス・コラゾで原稿上のコメントと同様に、アン・ラバンウェイライブ共焦点イメージング。ナタナエル・プルネットの仕事は、エリオット・M・マイヤーウィッツにグラントR01 GM104244を通じて米国国立衛生研究所によってサポートされています。

1.メディアと料理の準備<ol><li> 2％アガロース0.5センチメートル（深さ2cm、約6センチ幅）丸いプラスチック製の箱を充填して解剖皿を準備します。 </li><li> イメージングの料理を準備します。 <ol><li>直立共焦点顕微鏡のために、長方形のプラスチックは、イメージング媒体0.5センチメートル（3センチメートル深い4.5センチ幅、約7センチ）ボックスヒンジ埋める（セクション1.3を参照して、「イメージング媒体」; 図1F）。 </li><li>倒立共焦点顕微鏡用：（セクション1.3、「イメージング媒体」を参照; 図1G）イメージング媒体と鍔に正確に（1センチメートル深い、約3.5センチ幅）小さなペトリ皿を埋めます。 </li></ol></li><li> イメージング媒体を準備します。 <ol><li>シングルポイントイメージングのために、1％アガロースを使用します。 </li><li>時間経過実験のために、ビタミンなし（0.5Xムラシゲ及びスクーグ基礎塩混合頂点増殖培地を使用して、1％スクロース、0.8％アガロース、カリウムhydroxidでpH 5.8ビタミンを補充したE溶液[0.01％ミオ-イノシトール、0.0001％ニコチン酸、0.0001％の塩酸ピリドキシン、0.001％チアミン塩酸塩、0.0002％グリシン]とサイトカイニン[500nMのN6-ベンジル]）15。 </li></ol></li></ol> 2.植物の成長<ol><li>適切な選択とMSプレート（ビタミン無し0.5または1xムラシゲ・スクーグ基礎塩混合物を、0.8％寒天、水酸化カリウム溶液でpH 5.8）で滅菌した種子をまきます。長い一日（16時間光）または連続日に場所プレート、2週間16〜22℃の条件。 </li><li>堅牢な開発を可能にするのに十分な間隔で土壌への移植苗。短日に入れ工場、3週間16-22°Cの条件。 注：直接、早期開花とあまり活発、および解剖がはるかに困難です花序で結果を移植した後、長い一日または連続日の条件で植物を育てます。同様に、短日コンディットの下で植物を残します3週間以上のためのイオンは一日の長さに依存しない開花とあまり活発です花序になります。 </li><li>長い一日（16時間光）または連続日に転送する植物、それらの花まで16-22℃の条件。花序2-10センチのとき茎頂を解剖するのが最も簡単です。 </li></ol>茎頂の3解剖<ol><li>オプション：細かい研ぎ石と軽油のドロップを使用して、点状ではない、彼らはブレード状にするために実体顕微鏡下に鉗子を研ぎます。 </li><li>彼らは壊れるまで、ピンセットで花柄のベースを押すことで、主花序からの長角果、古い花のつぼみと二次花序を削除します。倍率ことなく、できるだけ多くの花を削除する（ 図1、AとBを比較）。 </li><li>鉗子、解剖皿のアガロースでピアス縦穴を使用して、花序の最後の0.5cmに切断し、アガロースに垂直に固執。残り花芽は、アガロース表面上でなければなりません。 </li><li>茎頂が完全に浸漬されるように、滅菌脱イオン水で撮像皿を埋めます。 （CとDを比較し 、 図1）実体顕微鏡下で解剖皿を置き、1,000μLピペットで水ジェットを作成することによって、茎頂の周りに閉じ込められた空気を除去します。 </li><li>実体顕微鏡下で、柄の切断（ 図1E）まで、柄の基部又は芽の上に押すことによって結像されるべきではなく、花の芽を除去するために鉗子を使用します。残り花柄が若い花芽の除去を妨げるよう花梗は、ステムとの接合部できれいに破ることが重要です。 </li><li>撮像のみ花芽ステージ5と若い（ 図2A）は 、ステージ6~8の花蕾を切開する前に水を除去した場合。イメージング花芽ステージ5と古いが、がく片の切除に進んでいる場合（セクション5.1を参照してください）。それ以外の場合は、プロ3.7段階にCeedで。 </li><li>鉗子を用いて、撮像皿の中に垂直穴を貫通し、培地中の解剖頂点直立スティックのみシュート頂端分裂組織ように花芽を取り囲む媒体の表面上にあります。花芽は必ずしも正確幹（ 図2A）のように配向されていないとして結像されるべき花蕾（単数または複数）に応じて、わずかに試料を傾斜させる必要があるかもしれません。 </li><li>必要に応じてサンプルを染色に進みます。染色および/またはすぐにサンプルを撮影していない場合は、水を追加し、脱水症状を防ぐために、イメージング皿を閉じます。倒立顕微鏡を使用している場合、透明なプラスチックボックスに撮像皿を置き、それを閉じます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> 図1：ライブ共焦点イメージングのための茎頂の調製。 （A - E）の解剖イメージングのための頂点を撃ちます。花序（A）の前と長角果や古い花の（B）を除去した後。 （C - D）茎頂は、先端部（C）に捕捉された気泡を有する、解剖皿に水に浸漬し、気泡（D）を除去した後。 （G）（F）直立および倒立共焦点顕微鏡のステージ上で、イメージング皿で茎頂のビュー- （E）はステージ5（G F）よりも古い花芽の解剖の後、解剖皿に頂点を撃ちます。 （F）において、40X水浸漬レンズを水に浸漬レンズの先端部と、頂点の上方に配置されています。 （G）において、茎頂がレンズの先端に画像形成媒体を接続水柱で、逆さま40X水浸漬レンズ上に配置されます。 （F）が小さいパネルは、HIGを示します画像形成媒体に挿入茎頂を持つ赤い長方形エリア、彼女の拡大図です。赤と青の線は、それぞれ、媒体及び水の表面を示します。 （H - I）水浸漬レンズの先端でより多くの水を添加可能カスタムメイドのデバイスの例：の指から製造されたスパークプラグブーツ（H）からなるシリコンゴムスリーブ、及び仮設スリーブpowderlessラテックス手袋（G）。スケールバー= 0.5（A）でCMと（B）、（C）および（D）0.1センチメートル、及び（E）で100μmです。この図は、最初の参照14に掲載されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.染色注：細胞壁やプラズマ膜は、それぞれ、ヨウ化プロピジウムまたはFM4-64で染色することができ、細胞の解像度を達成するために撮影時。代替的に、原形質膜にタグ付けされた蛍光タンパク質とレポーター株は6、16を使用することができます。 <ol><li>撮像皿から水を除去し、媒体の表面に染料を希釈回避するために乾燥していることを確認します。 </li><li>実体顕微鏡下で、1mg / mlのヨウ化プロピジウム溶液、または10μLピペットで切開頂点80 / mlのFM4-64溶液のいずれかの20〜30μLを加えます。試料全体が均質な染色を確保するために染料で覆われていることを確認します。 </li><li> FM4-64を使用する場合、ヨウ化プロピジウム、または20分を使用している場合は2分間染色します。 </li><li>滅菌、脱イオン水で2回洗浄します。 </li></ol> 5.がく片アブレーション注：ステージ4で、がく原基はFMをカバーし始めます。彼らが成長するにつれ、彼らは下にある組織からの蛍光をフィルタリング、およびイメージングプロセスを妨げます。萼片は、いずれかの金属ピンmounteを使用して手動で除去することができますピン万力上のD、または新興がく原基にレーザアブレーションを使用して成長することを防ぎます。あるいは、萼片が存在しないか、花の中央部は、通常、（ 図 2F）17を展開しながら、FMをカバーしていない葉状器官で置換された、例えばapetala1-1ような変異体を使用するいくつかの場合には可能です。 <ol><li> 花芽段階で萼片切除5及び古いストレート金属針保持ピン万力を使用して（図2、E1-E2） <ol><li>実体顕微鏡下で解剖頂点と解剖皿を置き、そして最大倍率を設定します。滅菌、脱イオン水で茎頂を浸し、あるいは、がく片を解剖しながら、定期的に茎頂に水を適用するために千μLピペットを使用しています。 </li><li>ピン万力で、茎頂に対する接線方向、軸外がく片の上にピンを配置します。それは離れて破断するまで静かに離れて茎頂からの萼片を押します花芽から。 </li><li>向軸萼片と同様に進みますが、茎頂に向けて萼片を押してください。 </li><li>横がく片と同様に進みますが、茎頂に対して半径方向にピンを配置し、花のつぼみから離れて、側にがく片を押してください。 </li><li>脱水症状を防ぐために、数分間滅菌、脱イオン水で茎頂を浸し。 </li></ol></li><li> 段階3-4でがく片原基のレーザアブレーション（図2、C5、D5） <ol><li>共焦点顕微鏡のステージ上で染色し、解剖頂点と撮像皿を置き。 （第6章、「撮影設定」を参照）探して、画像にそれを準備するかのように頂部に焦点を当てます。 </li><li>レーザーアブレーションシステムソフトウェアを使用して、彼らは花の分裂組織を覆う開始する前に出現萼片原基の山と先端に対応する切除ゾーンを定義（典型的には、軸外及び向軸萼片のためのステージ3で、および後期段階で3 /早いです横SEのステージ4仲間）。 </li><li>設定されたレーザパワーと適切なパラメータへの滞留時間は、基礎となる組織にあまりにも多くのダメージを与えることなく、十分な細胞を切除します。一般的に、使用したレーザーアブレーションシステムに応じて、適切なパラメータは最初の花の他の部分に影響を与えず、その後FMの上に成長させるためのがくを防ぐために除去されることに十分な細胞を確実にするために試行錯誤のプロセスを通じて識別される必要がつぼみ。あまりにも多くのレーザーパワーを使用し、花の中央に損害賠償時間の結果を住居、その成長および/または生存に影響を与えます。適切なパラメータが識別されると、彼らはその後の実験のために再利用することができます。 注：最初の切除が不十分で判明した場合、それは次の日に第二のアブレーション（ 図2、C4及びD2）に進むことが可能です。 </li></ol></li></ol> 6.イメージングのセットアップ<ol><li> 正立顕微鏡を使用してください。 <ol&gt; <li>媒体の表面が2.5〜5ミリメートル水（ 図1F）に覆われるように、滅菌脱イオン水で解剖頂点と撮像皿を埋めます。完全にサンプルを浸します。 注：正立顕微鏡で撮像する場合、いくつかの頂点が同じ撮像皿に配置することができます。イメージングプロセスは時間以上続く場合は、ヨウ化プロピジウムを希釈する傾向があり、いくつかのサンプルは、撮像前に再染色を必要とするかもしれません。 </li><li>顕微鏡ステージ（ 図1F）上の撮像皿を置き。水浸漬レンズを低下させ、レンズの先端を水中に浸漬するように段階を上げます。解剖頂点を破砕またはイメージング媒体中にレンズを浸漬しないように慎重に進みます。 </li><li>気泡がレンズの先端に捕捉されている場合、それを除去するために千μLピペットで水ジェットを作ります。 </li><li>落射蛍光照明、XYコンを使用してレンズフィールドに位置解剖頂点の下トローラ。接眼レンズを通して見るとZのコントローラを用いて試料に焦点を当てます。サンプルを粉砕しないようにするために慎重に進んでください。 </li><li>画像化される、花芽のズームを共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、あなたのサンプルを画像化に進んでください。 </li></ol></li><li> 倒立顕微鏡を使用してください。 <ol><li>千μLピペットを用いて、レンズの先端に、滅菌脱イオン水の液滴を置きます。 </li><li>撮像皿逆さまを持ち、1,000μLピペットで、解剖頂点に、滅菌脱イオン水の液滴を加えます。 </li><li>顕微鏡ステージ（ 図1G）に撮像皿逆さまに置きます。サンプルを粉砕しないように慎重に進んでください。 </li><li>落射蛍光照明下で、XYコントローラを使用してレンズの先端にわたって解剖頂点を位置付けます。試料は、レンズ先端の水滴に達するまでZコントローラと、慎重にステージを下げます。水柱はbetw形成すべきですレンズの先端と媒体EEN。 </li><li>水柱が形成されない場合は、慎重千μLピペットでサンプルに水滴を追加します。水柱（ 図1Hおよび1I）の確立および維持を容易にする、その先端に、より多くの水を追加するためにレンズに間に合わせのスリーブを加えます。 </li><li>落射蛍光照明下で、接眼レンズを通して見て、Zコントローラを用いて試料に焦点を当てます。サンプルを粉砕しないように慎重に進んでください。 </li><li>画像化される、花芽のズームを共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、サンプルを画像化に進んでください。 </li></ol></li><li>経時実験を行う場合、撮像皿から水を注ぐと時点間での脱水を防止するために、それを閉じ。長い一日（16時間光）または連続日のサンプル、16〜22℃の条件で撮像皿を置き。各時点の前に再染色サンプル。 注：develoにいる間の細胞pingの花器官は、毎秒1日に1回または2回花の分裂組織の分裂で、より高速なセルを分割することができ、および細胞系統は、時点ごとに24時間を追跡するのは簡単です。必要であればしかし、それは6時間ごとにサンプルを画像化することが可能です。 </li></ol>撮像パラメータ7.留意事項注：イメージングパラメータを設定する方法は、使用、共焦点システムに大きく依存します。下記のいずれかの共焦点顕微鏡を用いて使用することができ、これらのパラメータのいくつかのための提案です。撮像パラメータの詳細な考慮事項については、 議論のセクションを参照および14を参照します。 <ol><li> XY解像度の場合：良い携帯解決のために1,024×1024を使用しています。代替的に、解像度を犠牲にし、撮像時間を短縮するために512×512を使用します。 </li><li> Z分解能の場合：0.5〜1.5μmのステップサイズを設定します。ステップサイズを下げるとZ分解能も撮影時間を増加させます。 </li><li&gt;ピンホールの場合：1-1.5風通しの良いユニットにピンホールを設定します。ピンホールを大きくすると、信号の強度を増大させるだけでなく、非焦点面からの騒音。 </li></ol>共焦点データの可視化8。 <ol><li> ムービーにはまだ花の開発の時点の画像をONにします。 <ol><li>ソフトウェア（ 例えば 、フィジー）に（JPEGまたはTIF形式）の静止画像を開きます。 </li><li>スタックへの画像&gt;スタック&gt;画像に移動します。オープン画像はスタックにグループ化されます。 </li><li>スタック内の画像の順序は年代順に対応していない場合は、それらを並べ替えるためにスタックソータープラグイン（プラグイン&gt;スタック&gt;スタックソーター）を使用します。 </li><li>ムービーにスタックを有効にするには、&gt;名前を付けて保存&gt; AVIファイルに移動します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flower+Development+in+Arabidopsis:+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs.">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li><li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development.">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li><li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li><li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes &amp; Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li><li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana.">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li><li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima.">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li><li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana.">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li><li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging.">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li><li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).</li><li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li><li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem.">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds.">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li><li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li><li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+GFP::cDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency.">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li><li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development.">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li><li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex.">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators.">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX.">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

ここでは、共焦点顕微鏡と水浸漬レンズをシロイヌナズナ花芽を開発し、ライブの画像化のためのプロトコルを提供します。これが直立または倒立顕微鏡のいずれかで行うことができますが、元を使用するように簡単かつ迅速です。異なる共焦点システムは、速度、感度、および波長を分離する能力の点で有意に異なることも注目に値します。同じサンプルで、最高の共焦点顕微鏡は現在、画像、いくつかの異なるチャネル（ 図2G 例えば GFP、YFP、DsRedのヨウ化プロピジウム）を可能にします。いくつかの共焦点顕微鏡は、同時に複数のフルオロフォアからの蛍光を収集し、その後それらを分離することができ、スペクトル検出器が装備されています。定期的な検出器を使用する場合は、しかし、レーザーやフィルタのセットが異なる蛍光体からの蛍光を励起し、分離するために使用する必要があります。いくつかのフルオロフォア（ 例えば 、CFP ANを完全に明確な発光スペクトルを有しますYFP）D、及び同時に画像化することができます。他のフルオロフォアは、部分的に重複する発光スペクトル（ 例えば、GFPおよびYFP）を有し、そして通常撮像時間を増加させる、別々に画像化される必要があります。近くに蛍光団を画像化することもしばしば他のチャンネルへの漏洩から1発蛍光団からの蛍光を防ぐために、各チャンネルのために収集され、どのくらいスペクトルの制限が必要です。これは、レーザパワーと利得の増加によって補償することができる収集された信号の強度の損失を引き起こします。しかし、長期の撮影時間と増加レーザパワーは漂白剤及び/又は試料に損傷を与えることができます。増加したレーザパワー及び/またはゲインもバックグラウンドノイズを増加させることができます。各サンプルの信号強度、解像度、撮像時間の最適化は、試行錯誤のプロセスを介して行われ、永久的なトレードオフを伴います。 このプロトコルは、解剖茎頂の側面で開発花芽のライブ共焦点イメージングを実行する方法について説明します。それ茎頂は、植物の残りの部分に接続されていないとサイトカイニンを含む培地中で成長しているという事実は、SAMと花の発達に影響を与える可能性があると主張することができます。しかし、この媒体は解剖茎頂分裂組織が正常なplastochronで新しい花芽を生成し、これらの花芽は、通常15を開発することを保証するために、試行錯誤のプロセスを通じて経験的に設計されました。同様に、がく解剖は、遺伝子発現パターンや花の残りの発展に影響を与えるように表示されません。 SAMのライブ共焦点イメージングを実行するためにどのように他のプロトコルの詳細は、まだ植物（ 例えば 、参照11）の残りの部分に取り付けられています。そのようなプロトコルはするように適合され、及び特にサイトカイニン関連のプロセスを研究するとき、花の開発のイメージングのために有用な選択肢を提供することができます。しかし彼らはいくつかの欠点が存在する：幹伸長やねじれをし、花芽の向きを変えます。 A植物の残りの部分に結合して茎頂を画像化することは正立顕微鏡でうまく動作しながら、ND、それは倒立顕微鏡でこれを行うにはるかに複雑です。 液浸レンズは、「乾燥」レンズ（空気によってサンプルから分離されている、すなわちレンズ）よりも良好な開口数（NA）を有し、したがって、共焦点顕微鏡を使用する場合に重要である試料のより微細な分解能を提供します。イメージングプロセスの間脱水から茎頂を防止しつつ、水浸漬レンズを使用すること、したがって、ドライレンズよりもはるかに良いNAを提供します。グリセリンと油レンズは水のレンズよりもさらに高いNAを持っているが、それらはサンプルもタイムラプス実験の間に成長し続けて茎頂、の大きさに非常に実用的でないカバースリップの使用を必要としています。サンプルの大きさを考えると、長い作動距離を有するレンズを使用することも重要である（花の段階に応じて、スタックが上150μmの厚さであることができます）。我々は、典型的には、1のNA及び1.7〜2.5ミリメートルの作動距離と20又は40Xレンズを使用します。 共焦点顕微鏡ソフトウェアは、三次元再構成（ 図2、B1、B2およびB4）とスライスビュー（ 図2、B3）を含む共焦点データを視覚化するためのいくつかの方法を、提供します。最も一般的に使用される三次元ビューは、共焦点のZスタックの最大強度投影（ 図2、B1及びB4）であるが、いくつかのソフトウェア（ 例えば ZENとIMARIS）ものより深い部分からの信号をフィルタリング透明度の景色を眺めることができ表皮層で発現起こるプロセス、又は遺伝子を見たときに有用であり得るサンプル（ 図2、B2）。信号強度は、いずれかの画素INTEを使用して、単一の色（ 図2、B1）で符号化することができますnsity、またはカラーコードを使用して（ 図2、B4）。 ライブ共焦点イメージングだけでなく、花の開発に貴重な定性的な洞察を提供しています、それはまた、潜在的に定量的なデータの豊富な発達生物学者を提供します。異なるソフトウェア（ 例えば IMARIS、フィジー、MARS-ALT、MorphographX 15、20、21）の数、または1つまたはいくつかのレポーター、または異なる細胞におけるレポーターの発現レベルを発現する細胞の量の定量化を可能にします。そのようなソフトウェアはまた、自動細胞分割を行う細胞系統を追跡し、成長を定量化するために使用することができます。この別のソフトウェアには、同様のツールを提供していますが、また、多くの点で異なります。 MARS-ALTとMorphoGraphXはIMARISのAとは異なり、植物15、20、21のために特別に設計されましたNDフィジー。 IMARISおよびMARS-ALTは、サンプル全体のセグメント化および分析を可能にしながらMorphoGraphXのみ、表皮層のセグメント化および分析を可能にします。ただし、MARS-ALTは、3つの異なる角度15からの同じサンプルの前イメージングを必要とし、IMARISは単一のスタックを必要とします。定量的な情報へのアクセスは、花の開発の我々の理解を促進することが重要です。

または、頂端分裂組織 - - 芽や根の植物体の大部分は、ステム・チップで、または近くに位置する細胞のグループからポスト胎生形成しています。大人の植物のすべての地上構造物は、継続的にその側面に横方向の臓器を作り出す茎頂分裂組織（SAM）、から派生：栄養段階の間、葉、花の分裂組織（FMS）、それは生殖相に遷移した後。順番にFMSが花へと発展します。シロイヌナズナSAMは、一度に横臓器いずれかを生成しながら、繰り返し、螺旋パターンで、FMSが同時に解明複数発達プログラムと、部分的に同期して4つの渦巻き内の花器官の4種類の生成します。異なった花器官のアイデンティティの仕様の基礎となる遺伝子ネットワークは、部分的に花のdevelopmeのが、多くの側面（レビューのために、参考文献1、2を参照）が解読されていますNT、花器官の位置と渦巻きの間の境界の定義など、よくわかっていないまま。 植物の開発の初期の分子遺伝学的研究は、主に遺伝子発現を解析するために、このようなin situハイブリダイゼーションおよびGUSの記者のように 、技術に依存していました。これらのメソッドは、豊富な情報を提供し、大幅に植物の成長と花の開発の我々の理解に貢献してきたが、重要な制限があります：彼らは良い携帯解像度が不足している、同じ内の複数の遺伝子の発現パターンを簡単に観察することができません。サンプルは、そして重要なのは、唯一の死者、固定組織に適用することができます。共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの制限を克服し、植物の形態形成の基礎をなす過程を調査するための強力なツールと発達生物学者を提供しています。具体的には、共焦点顕微鏡は、Cであり、それらの形成、全体生組織および器官の観察を可能にします完全な開発などの典型動的なプロセスを理解することがritical。 ライブ共焦点イメージングは広く、（ 例えば参考文献7、8（ 例えば 、3参照4、5、6）が、いくつかの報告を除き、SAMによる植物の空中成長と横方向の臓器の生産を分析するために使用されてきました9、10）、それが広く花の開発の研究に適用されていません。 SAMのライブ共焦点イメージングのためのプロトコルは（11、12を参照するなど ）が利用可能であり、どのようにイメージSAMを囲む開発花芽をするための優れた基盤を提供します。しかし、イメージング花芽具体的な課題を提示します。例えば、花芽を迅速SAMよりも大きくなり、ステージ4で、萼片は、（参照13に記載のように段階）FMを覆う起動し、下にある組織（ 図2A）からの蛍光を調光。ここでは、直立または倒立顕微鏡と水浸漬レンズのいずれかを使用して、シロイヌナズナの花のつぼみの開発にライブ共焦点イメージングを実行する方法を説明する詳細なプロトコルを提供します。我々は以前、参照14で、このプロトコルを発表しました。

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

植物の成長と発展の研究は長い間死んで、固定組織を使用して、適切な細胞解像度を欠く実験技術に頼っています。数多くの蛍光体の開発と組み合わせた共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの問題を克服し、ライブのサンプルで、良い細胞の解像度で、同時にいくつかの遺伝子の発現を研究する可能性を開きました。ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールで植物生物学者を提供し、広く根の成長と茎頂分裂組織の側面に横方向の臓器の形成を研究するために使用されてきました。しかし、それは広くにより、このような花の分裂組織と共に成長がく片などの花を、イメージングに固有の課題に一部、花の開発の研究に適用され、そして下の組織からの蛍光をフィルタリングされていません。ここでは、アラブの開発、ライブでライブ共焦点イメージングを実行するための詳細なプロトコルを提示します直立または倒立顕微鏡のいずれかを使用して、花芽をidopsis。

図2は、異なる蛍光レポーター遺伝子を発現する生きたシロイヌナズナ花芽の共焦点Z-スタックの異なるビューを提示し、いずれかのヨウ化プロピジウム（ 図2、A-C5及びG）又はFM4-64（ 図2、E1-F）を用いて染色しました明確な細胞の解像度を提供しています。最も共焦点システムは、ヨウ化プロピジウムまたはFM4-64（ - 2F 図2A）のいずれかと一緒に、このようなGFPまたはYFPなどの非重複発光スペクトルを有する2つのフルオロフォアの画像化を可能にします。最良焦点システムも同じようなGFPおよびYFP、およびDsRedのような試料、およびヨウ化プロピジウム（ 図2G）に部分的に重複する発光スペクトルを有する複数のフルオロフォアを分離することができます。 タイムラプス実験の3つの例を図に示されています2及びがく片アブレーション、レーザアブレーションシステム（ 図2、C1-C5およびD1-D5）を用いて、または手動ピン万力と金属ピン（ 図2、E1-E2）のいずれかを行った後、通常の現像表示花芽。 図2に示されている花芽は、E1-E2が心皮原基は花芽の出現がく原基のステージ7レーザアブレーションで蕾の中心で観察されていない理由であるスーパーマン-1変異植物からのものであることに注意してください図2に示される、C1-C5はまだステージ5（ 図2、C5）で撮像することができるFMをカバーするのを防止します。逆に、 図2に示した花芽の場合には、D1-D5は 、レーザーアブレーションは、萼片の成長を遅らせたが、萼片は、最終的にステージ5（ 図2、D5によってFMの大部分を覆うように成長しました</強いです&gt;）。あまりにも多くのレーザパワーと滞留時間は、レーザーアブレーションの際に使用されている場合は逆に、ダメージは花の中心部に広がり、その成長に影響を及ぼし、時には全体の花芽のその後の死をもたらします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> 図2：ライブ花芽の共焦点Z-スタックの可視化。 AとB2は、透明性の図です。 B1とB4-Gは、最大強度の投影です。 B3は直交スライス図です。 （A - E2）花APETALA3遺伝子 （緑色）のためのビーナスレポーターを発現します。細胞壁は、ヨウ化プロピジウム（B4以外の赤、緑）で染色しました。 （A）花序。数字は花の段階を示しています。段階における萼片4及び5花金星レポーターの蛍光をフィルタリング、通常FOリングを実効値。一部の花芽が花序に比べて傾いて見えることに注意してください。 （B1 - B4）ステージ5花芽の同じ共焦点Zスタックの4つの異なるビュー：緑色（B1）または火災のカラーコードの画素強度で符号化されたビーナス信号強度と最大強度投影（B1とB4） （B4;カラーコードは、パネルの下部に示されています）。透明ビュー（B2）と直交スライスビュー（B3;スライスのXY、XZおよびYZ方向のパネルに示されています）。 （C1 - C5）ステージ5の段階3からの個々の花芽の4日間の時間経過。 （白色の形質としてマークされた）アブレーションは、1日目と3日目に行わ（D1 - D5）段階5で花芽の中心を覆うから萼片を防止するのに十分であったから、個々の花芽の4日間の時間経過ステージステージ3~5; 1日目、2及び3上で実行アブレーションは、花芽の中心を覆うから萼片を防止するのに不十分でした。 （E1 - E2）背軸と向軸がく片（E1）を手動で除去した後の個々の花のつぼみ、およびすべてのがく片の（E2）;白い矢印は、残りの萼片を示します。白のアスタリスクは、がく片の除去から生じる傷跡を示しています。 DR5-3xVenusN7レポーター18（緑色）を発現する（F）ステージ7 apetala1-1花 ;原形質膜は、FM4-64（赤）で染色しました。青い矢印は、がく片を交換し、花芽をカバーしていない葉のような構造を示しています。 （G）DORNROSCHEN-LIKE 7（緑）、SUPERMAN（赤色）のために金星レポーターする蛍光GFPレポーターを発現する第4段階花芽及びCLAVATA3 19（シアン）用のDsRedレポーターを、細胞壁は、ヨウ化プロピジウム（灰色）で染色しました。 D：1日; ST：舞台。スケールバー=25μmの。スケールは、C1-C5およびD1-D5で、B1、B2及びB4に同一です。この図は、基準14から変更しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K ビュー.  California Institute of Technology. ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。 

ビデオ: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

遺伝学

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

発生生物学

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

生物学

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

共焦点イメージングは、シロイヌナズナの花の開発のライブ

要約

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この動画の章

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

別の植物種から茎頂の共焦点のライブイメージング

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングとシロイヌナズナの微小機械的操作

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

の細胞特異的な分析

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

時空のCaを測定する

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

要約

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シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

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時空のCaを測定する

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

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ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングとシロイヌナズナの微小機械的操作

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。