研究は賞の数R01CA174385下国立衛生研究所（NIH）の国立癌研究所によってサポートされていましたこの文書に報告した。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1。試薬の調製<ol><li> 500ミリリットルのRPMI-1640と5 mlペニシリン - ストレプトマイシンそれぞれ、L-グルタミン、およびHEPES溶液を混合することにより、RPMI-PLGHを準備します。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-PLGHを混合することにより、R10溶液を調製します。 FBSはさらに〜30分間56℃の前で熱不活化である。 </li><li> 37℃でプレ暖かい℃のRPMI-PLGH 50mlのPBSを15ミリリットル、無菌コニカルチューブでR10の15ミリリットル。 </li><li> PDMSにおけるnanowellsのアレイの作製：シリコンマスターは、本質的に以前に10を説明したフォトリソグラフィを用いて作製される。徹底的にプラスチック製のナイフを使用して使い捨てカップの10:1の重量比でシルガード184エラストマーキットのベースと硬化剤を混ぜる。ドガ1時間真空チャンバー内で混合。 、nanowellアレイ上に混合物を注ぐスライドガラスで密閉して、30分間放置します。 ℃で2時間、80に設定したオーブンにアセンブリを移し、1時間室温で冷ます。エラストマーは最新版でしょうこの期間中の電子と意志スライドガラスに接着する。 PDMS nanowell配列を含有するガラススライドは慎重に、シリコンマスターリフトオフスコッチテープで覆われており、将来使用するまで保存されています。 </li></ol> 2。標的細胞（T）のラベル<ol><li> 5分間、340×gで遠心分離することにより滅菌15mlコニカルチューブに血球計数器とペレット細胞を用いた細胞培養から500万標的細胞をカウントします。細胞培養は5ミリリットル総容積（密度= 100万/ ml）に前日分割し、T-25フラスコ（VWR）中で培養される。血球計数器を用いて細胞計数のためのプロトコルは、以前11を詳細に説明してきた</li><li>メディアの約50μlを残して余分なメディアを吸引します。 </li><li> （最終濃度2.5μM）を150μlのRPMI-PLGHに0.5μlのCTRストック（1mM）を混合することにより、携帯トラッカーレッド（CTR）のワーキング溶液を調製します。標的細胞への作用溶液を150μlを加え、P200のピペットを用いてよく混合します。交互に、PKH 26（最終濃度2μM）を製造元の指示に従って、ラベル標的細胞を使用することができます。 </li><li> 20分間37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol> 3。エフェクター（E）細胞標識<ol><li> 5分間、340×gで遠心分離することにより滅菌15mlコニカルチューブに血球計およびペレット細胞を用いた細胞培養から500万エフェクター細胞をカウントする。 </li><li>余分なメディアを吸引</li><li> R10のメディアの1ミリリットル（5μMの最終濃度）を5mMのVybrantバイオレット株式1μlを添加してVybrant DyeCycleVioletステインソリューションの作業溶液を調製します。細胞への実用的なソリューションを追加し、P200のピペットを用いて再懸濁します。交互に、PKH 67（最終濃度2μM）を製造業者の指示に従って、ラベル標的細胞を使用することができます。 PKH 67が使用されている場合は、それらが同じ蛍光チャンネルにあるので、その後SYTOXグリーンは使うべきではありません。アポトーシス目標の列挙は、専ら使用して行われこの場合nnexinV染色。 注：時間経過ではなく、エンドポイントの測定を行う場合は、Vybrantバイオレットのような紫の染料は避けるべきである。 </li><li> 20分間37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol> 4。密度勾配を用いた生細胞と死細胞の分離<ol><li>それぞれ、ターゲットとエフェクター細胞に6.8ミリリットルおよびRPMI-PLGHの6.0ミリリットルを加え、穏やかに上下にピペッティングにより混和します。 </li><li>標的細胞とエフェクター細胞を含む各コニカルチューブの底にのFicoll-Paque Plusの層3.5ミリリットル。 FICOLLとメディア間の層の良好な形成を確保するためFICOLLゆっくり層。 </li><li> 30分間340 xgで両方のチューブを遠心分離します。ノーブレーキと加速しています。 </li><li>遠心中、4ウェルプレートにあらかじめ温めておいたPBSを7ミリリットルを転送します。 nanowellアレイ（PDMSで作製）を準備エタノールでスライドガラスの底をきれいにし、1分間のプラズマ酸化剤を用いた高RF設定でPDMSを酸化させる。このステップでは、STEますまた、親水性のPDMSをレンダリング中nanowell配列をrilize。直ちにPBSを含むプレートにnanowellアレイを移動する。 </li><li>バイオセーフティキャビネットにプレートを移し、過剰のPBSを吸引除去する。 30から45秒後、10ミリリットルのDI水と電子レンジ、それに100mgの寒天粉末を添加して10ミリリットル1パーセントNoble寒天を作る。配列を固定化して凝固寒天は10分待機するnanowellの配列が含まれているスライドガラスの上端と下端に暖かい一パーセントノーブル寒天を適用します。 3ミリリットルPBSおよび吸引過剰寒天を追加します。 </li><li> nanowellアレイの上面上にR10の3ミリリットルを追加し、約10分間平衡化しましょう​​。 </li><li>遠心分離をフィコールに続いて、各管の最上層から5ミリリットルメディアを吸引除去する。細胞を含有する層を吸引しないように注意してください。 </li><li> 、P1とFICOLLとメディアの間の層1〜2ミリリットルを回収することにより細胞（白層）収穫000ピペットと新しい滅菌コニカルチューブに移動します。それがあなたの格言を確認しながら細胞の両方のセットに対してこの手順を繰り返し回復細胞をIZE。 </li><li>フル加速とブレーキで5分間340×gで遠心分離によるピペッティングし、ペレットによるミックス、各チューブにあらかじめ温めておいたRPMI-PLGHの3ミリリットルを追加します。 </li><li>余分なメディアを吸引し、各チューブにあらかじめ温めておいたRPMI-PLGH 5 mlを加え、5分間、340×gで遠心操作を繰り返します。 </li><li>余分なメディアを吸引除去し、R10の500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>血球計算盤にトリパンブルー排除法を用いて生細胞数を数えます。 </li></ol> 5。 Nanowellアレイ上にセルの読み込み<ol><li> nanowellアレイから余分なメディアを吸引除去し、アレイ全体の新鮮なR10の2ミリリットルを追加します。 nanowellアレイの上面は、それが細胞の分布に影響を与えるとして、あまりにもウェット/ドライでないことを確認しながら再度吸引してください。 </li><li> nanowellアレイ表面上にR10の200μlの預金1×10 5個のエフェクター細胞（密度= 5×10 5細胞/ ml）。 </li><li>細胞は5分間静とenに標準的な組織培養顕微鏡検査を使用してみましょう細胞の分布が望ましいことを確認してください。必要に応じて複数のセルを追加します。 </li><li>敷金1×10 nanowellアレイ表面上の200μlのR10の5の標的細胞（密度= 5×10 5細胞/ ml）。 </li><li>細胞は5分と細胞の分布が望ましいことを確実にするために標準的な組織培養顕微鏡検査を使用するために解決しましょう​​。必要に応じて複数のセルを追加します。 </li><li> 2ミリリットルR10と吸引余分なメディアで慎重nanowell配列をすすぐ。 </li><li> 15ミリリットル滅菌コニカルチューブに3ミリリットル予め温めR10を準備します。ステイン0.5mMのSYTOXグリーン核酸の3μL（終濃度0.5μM）及びワーキング溶液を調製したアネキシンV-アレクサフルオル647の60μlを添加する。細胞をウェルからはずれていないことを確認しながら慎重に4ウェルプレート上に実用的なソリューションを追加します。 </li><li> 15分間37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol> 6。イメージングの1 <ol><li>蛍光MICRを使用nanowell配列の画像を取得oscope：この例では、我々は電動ステージとLambda-DG4を装備し、Z-1顕微鏡ツァイスObserverを使用。 </li><li>ソフトウェアや顕微鏡を初期化し、透過光や他の蛍光チャンネル上の信号強度を確認してください。全体的に、に対応した5つのチャンネルがあるでしょう：透過光、アネキシンV-647（Cy5のフィルタ）、CTR（DsRedをフィルタ）、SYTOXグリーン（FITCフィルター）、およびVybrantバイオレット（DAPIフィルター）。顕微鏡は、それが飽和状態を回避しながら、ノイズに対する最大の信号を確実にするためにセットアップしていることを確認します。 </li><li> nanowellアレイ用のXとYの位置を設定します。ゼロの位置を設定するとnanowellアレイスタンプの左上隅に7×7 nanowell·アレイ·ブロックの中心にフォーカスを初期化することによって、プロセスを開始します。正確には、各ブロックに焦点を反映するように各ブロックの中心とz値と一致するように、x、yの位置を設定します。 </li><li>位置とフォーカスがすべて設定されたら、リニアモードで画像取得を設定し、画像を取得するようにしてください。 <sチョン·&gt;注意：実験前に顕微鏡で少なくとも30分でインキュベーターとCO 2に必要な有効にした場合。 </li></ol> 7。ポストイメージング 6時間インキュベーター（37℃/ 5％CO 2）にnanowell配列を含む4ウェルプレートを転送します。 8。イメージング2 ステップ6で説明したように第二の時点で画像を取得。 9。画像解析<ol><li> nanowells内の細胞の占有率は、適切な画像分割プログラムの使用（ 例えば ImageJは、によって決定され<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ）本質的には以前に説明した9,12。 </li><li>顕微鏡画像（T = 0時間; トン0）の初期セットの分析は、正確に1つのライブターゲットセル（同定含む個別nanowellsのデータベースを生成するために使用され赤）と無死んだ細胞（Annexin V染色により同定、緑）[T1t 0 nanowells]; CellTracker赤で。 </li><li>顕微鏡画像の第2セットの分析は（T = 6時間、6トン） が独立して1標的細胞（赤）[T1t 6 nanowells]を含むnanowellsの2番目のデータベースを決定するために使用されます。整合性チェック（データベースクエリ）がt 0におけるすべてのライブの目標が一致した目標の最終的なセットを（T1t 0 T1matchとして指定された= T1t 6を持って nanowellsとして実装）を生成するためにトン6でターゲットにマッチしていることを確認するために実装され</li><li> nanowellsにおけるエフェクター細胞の数がt 0でVybrantバイオレット染色法を用いて決定される[E1 nanowells] </li><li>データベースクエリ（E1T1として指定されたE1およびT1 が一致しているnanowellsとして定義）は、単一のターゲットと同時インキュベートシングルエフェクターを含むnanowellsを識別するために実装されています</li><li>エフェクター誘導アポトーシスは、iによって採点される<html> t 0とt 4（トン6のアネキシンVターゲット染色によるE1T1）で正アネキシンVでの負のアネキシンVで目標をdentifying。 </li></ol> 10。ニコンBioStation IMを使って殺すのオプションタイムラプスイメージング<ol><li>カバーガラスの底が付いてペトリ皿を取ると正確にカバースリップに収まるnanowellアレイチップ（ステップ5で調製したもの）の小片を切り出す。カットしながらチップが濡れたままでいることを確認してください。 </li><li>ミックス1×10 6目標と100μlの培地で1×10 6 T細胞、カバーガラス上に移します。 </li><li>約15〜30分で細胞が落ち着くようにすることができます。 </li><li>急速に小nanowellアレイチップを反転してカバースリップの上に置きます。 </li><li>なお、チップの上部にイメージング、場所中に1つまたは2つの20ミリメートル×20mmのカバーグラスを動かすことができないことを確実にするために。皿の底にチップをプッシュするように優しく圧力をかける。 </li></ol>テント&quot;&gt; 注意：nanowellアレイチップの底が高分解能イメージングのために厚すぎるので、逆さまにしなければならないこの時には、細胞の多くが洗い流され、これはステップ9.2で、セル番号を容易に制御することができないので。そしてステップ9.3におけるインキュベーション時間は、最適化されなければならない。

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Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はnanowellsの配列（ 図1）でエフェクターや目標の共インキュベーションを介して有効高スループット、単一セルの細胞傷害性アッセイのためのプロトコルの概要を示している。スループットに加え、技術の主な利点は、順番に標的細胞として、自己またはプライマリ/マッチした腫瘍細胞の使用を可能にする標的細胞工学を必要とせずに所望の標的細胞に対するエフェクター?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 W / O、L-グルタミン</td><td> Cellgro </td><td> 15から040-CV </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> Cellgro </td><td> 30から002-CI </td><td> 10,000 IUペニシリン万μg/ mlのストレプトマイシン</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td> Cellgro </td><td> 25から005-CI </td><td> 200 mM溶液</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td><td>たくさんのテスト</td></tr><tr><td>セルトラッカーレッド染色</td><td>インビトロジェン</td><td> C34552 </td><td> 50μgの</td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycleバイオレット染色</td><td>インビトロジェン</td><td> V35003 </td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> SYTOX緑色核酸染色</td><td>インビトロジェン</td><td> S7020 </td><td> 5mMの</td></tr><tr><td>アネキシンV-のAlexa Fluor 647 </td><td>インビトロジェン</td><td> A23204 </td><td> 500μlの</td></tr><tr><td>ダルベッコPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21から031-CV </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td> Noble寒天</td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100グラム</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8154 </td><td> 0.4％液、滅菌濾過</td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausserサイエンティ</td><td> 1492 </td><td>輝線</td></tr><tr><td> 4ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrickプラズマクリーナー</td><td> Harrickプラズマ</td><td> PDC-32G </td><td>基本的なプラズマクリーナー</td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td>ツァイス</td><tD&gt; </td><td>蛍光顕微鏡（以下の三つの部分で動作します） </td></tr><tr><td>ラムダ10月3日</td><td>サター·インストゥルメント</td><td></td><td>フィルタコントローラ</td></tr><tr><td>ラムダDG-4 </td><td>サター·インストゥルメント</td><td></td><td>超高速波長スイッチャー</td></tr><tr><td>浜松EM-CCDカメラ</td><td>浜松市</td><td> C9100-13 </td><td> CCD-顕微鏡カメラ</td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 mlコニカルチューブ</td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td>ニコンBiostation </td><td>ニコンインスツル株式会社</td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿</td><td>マテック株式会社</td><td> P35G-0 </td><td> 35ミリメートルペトリ皿、10ミリメートルマイクロウェル</td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

癌免疫療法は、腫瘍を標的とし、排除する免疫応答の特異性を活用することができます。遺伝的にキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように改変T細胞の養子移入に基づく養子細胞療法（ACT）は、臨床試験1-4のかなりの約束を示している。そこに車を使用して+ T細胞を、MHC非制限抗原を標的とし、宿主内でホーミングと永続最適な生存のためのT細胞を、官能化する能力を含む癌の治療のためにはいくつかの利点があり、そして最後に、CARのアポトーシスを誘導するために+宿主毒性5のイベントでのT細胞。 CARの最適な機能を線引き+臨床的利点を伴うT細胞は臨床試験の次の世代を設計するために不可欠です。多光子顕微鏡のように生きている動物のイメージングにおける最近の進歩は、免疫細胞機能の研究に革命をもたらした私nの生体6,7。これらの研究は、in vivoでのT細胞の機能についての我々の理解を進めているが、臨床試験でのT細胞ベースのACTは、T細胞の調製に利用することにより、臨床的有効性の注入後との事前注入の分子および機能的特徴をリンクする必要があるのを必要とします細胞毒性およびサイトカイン分泌、のようにT細胞の機能を監視し、インビトロアッセイ。標準的なフローサイトメトリーに基づいたアッセイは、単一細胞レベルでのT細胞の集団の全体的な機能を決定するが、これらは抱合体形成と寿命または複数のターゲット8を殺すために同じ細胞の能力を監視するには適さないことが開発されている。 ポリジメチルシロキサン（PDMS）のような生体適合性ポリマーで設計微細加工された配列は、空間的に小さなボリューム9のエフェクターや目標を閉じ込めるために特に魅力的な方法です。自動化されたタイムラプス蛍光顕微鏡との組み合わせで、カントーエフェクター - 標的相互作用のusandsはnanowell配列の撮像個々のウェルで同時に監視することができます。我々はここで広く、T細胞の細胞傷害機能を研究に適用することができ、単一細胞レベルでのT細胞媒介性細胞傷害性を監視するためのハイスループットな方法論を提示する。

ハイスループット細胞傷害アッセイのアプリケーションの例を図2に示されています。簡単に説明すると、ラベルの付いたCD19特異CAR + T細胞はnanowellアレイ（セクション1-5）の各ウェルに標識マウスEL4標的細胞と共培養した。最初のイメージは、アレイ上のすべての単一のnanowell（第6項）の占有を（エフェクターおよび/またはターゲット）を識別するために自動化された蛍...

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター - 標的抱合及びその後アポトーシスを監視するために、蛍光顕微鏡に接続されている。

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K ビュー.  University of Houston. 我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター - 標的抱合及び?...

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

免疫・感染学

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...