この作品は、CBER / FDA-NIAID / NIH省庁間協定YI-AI-6153から01、FDA / CBER学内資金、およびFDA医療対策イニシアティブによってサポートされていました。 TCT、MNB、VPM、LMS、およびKDKは、米国エネルギーDepartmenと米国の間で省庁間の合意を通じて科学教育のためのオークリッジ研究所が投与生物学的製剤評価研究センターでの研究の参加プログラムに任命によってサポートされていた食品医薬品局。

標準シリアル希釈液の調製（図3A） NOTE：Prの/鉛セットにより標的配列を含有する線状化プラスミドの連続希釈系列を定量RT-PCRアッセイの定量的標準として使用される。 IFNサブタイプのための各標準段階希釈セットは90アッセイプレートを実行するのに十分なボリュームが含まれています。アッセイに使用される標準希釈曲線の4点が20~32（ 表3）の範囲からCt値をカバーするように選択される。 <ol><li>簡単に解凍、渦、および標準（50 PM）遠心分離し、サケ精子DNA（ssDNAは、10 mg / ml）でストック溶液。 </li><li>水の20.3ミリリットルでのssDNAの51μLを混合することにより17標準希釈セットのためのssDNA /水ミックスを調製する。 </li><li>標準希釈セットに対して1つの8チューブPCRストリップにラベルを付けます。 注：ストック溶液からの標準連続希釈物の調製は2〜3時間かかります。 </li><li> FへのssDNA /水ミックスの190μlの分注IRSTストリップ内のチューブと5残りのチューブに一本鎖DNA /水ミックス180μ​​lの。 </li><li>のssDNA /水の190μlのチューブに50 pMの標準在庫からの10μlを転送することにより1:20希釈を行って、混ぜる。渦かつ迅速なPCRストリップを遠心する。 </li><li>シリーズの次の管に最も最近に希釈されたチューブから20μlのを転送することにより1:10希釈を行います。渦かつ迅速なPCRストリップを遠心する。 </li><li>希釈系列の最後のチューブまでの手順を繰り返し1.6は標準を受けています。 </li><li>繰り返しは、各規格の1.3から1.7を繰り返します。 </li></ol>以下の表3​​を参照してくださいプライマー/プローブ（PR / Pb）のとノーテンプレートコントロール（NTC）作業ストックミックス（図3B）の調製注：各1.7ミリリットルPR / Pbは株式と128.6μlのノーテンプレートコントロール（NTC）作業ストックミックスは30アッセイプレートを行いますワーキングセット。 <ol><li> PR / Pbは作業用ストックミックスを設定して準備します。 NOTE：PR / Pbのセットの準備とNTC作業ストックストック溶液からミックスは2〜3時間かかります。 <ol><li>ストック溶液の調製のために超純水で100μMにおけるプライマーおよびプローブを再懸濁する。 </li><li> 17 2ミリリットルチューブまでのラベル。アッセイに含まれる各PR / Pbのセットのための1。 </li><li>簡単に解凍、ボルテックス、及びプライマー（100μM）、プローブ（100μM）、および一本鎖DNA（10 mg / ml）でストック溶液を遠心分離機。 </li><li> 12.5μlの電子マルチチャンネルピペットを使用して、すべてのチューブに一本鎖DNAの2を添加する。 、適切なフォワードプライマーを追加リバースプライマー、及びPr / Pbは、株式チューブをワーキングセット各プローブ。アカゲザルのPr / Pbのセットについて、ヒトIFNサブタイプおよび表2をターゲットに PR / Pbのセットについては、表1を参照してください。各PR /鉛の量を持って来るために水を加え200μlに作業用ストックチューブを設定します。 注：追加するためのプライマー、プローブの量、および水のPr /鉛の必要な最終反応濃度に依存するセット。 </li></ol></li><li> NTC作業用ストックミックスを準備します。 <ol><li> NTC作業銘柄のラベル2つの5チューブPCRストリップはミックス。 </li><li>適切なNTC通常在庫ミックスチューブにセット各PR /鉛の14.3μlを転送します。 NTCウェルについてのPR / Pbのセットの組み合わせについては、表4を参照してください。 128.6μlに最終容量をもたらすためにNTC作業ストックミックスのそれぞれに水を追加します。 </li><li>ボルテックス、簡単に遠心し、氷の上または長期保存のために-20℃で暗所にチューブを置く。 </li></ol></li></ol>下記の表4を参照してください<ol start="3"><li> PR / Pbはワーキング株式を設定し希釈する。 <ol><li> NTC作業ストックミックスに必要なPR / Pbのセットのアリコートを除去した後、それぞれのPrの最終容量を持って水を1.5ミリリットルを追加/ Pbは1.7ミリリットルに株式チューブをワーキングセット。 </li><li>ボルテックス、簡単に遠心し、氷の上や、より長期保存のために-20℃で暗所にチューブを置く。 </li></ol></li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。自動化されたマルチチャンネルピペッターを用いて、384ウェルアッセイプレートの調製<ol><li> Prは/鉛セットの96ウェルソースプレートを準備し、NTCは、384ウェルアッセイプレートに分注するために混合する。 NOTE：Prの/鉛働きストックミックスからソースプレートの調製は、1時間未満になります。各96ウェルソースプレートは、6つの384ウェルアッセイプレート（ 図3C）を作るのに十分である。 <ol><li>簡単にボルテックスとPr / Pbは作業株式やNTC作業用ストックミックスを設定して遠心分離機。 </li><li>チルド96ウェル冷却ブロックに新たな96ウェルプレートを配置し、各PR / Pbのセット用の井戸を指定するか、NTCは、ウェル（ 図2参照）を受信混ぜる。 </li><li> 250μlの電子マルチチャンネルピペットを用いて96ウェルプレートに水を追加します。PR / Pbは（ターゲット17のための4つのウェルを除く）も設定され、すべての水の66μL分注する。 4ターゲット17のウェルに水を82.5μlの分注する。すべてのNTCへの水の27.5μlの分注よく混ぜる。 </LI&gt; <li>正しいPR / Pbは96ウェルプレートの指定されたウェルに株式をワーキングセット追加：正しいPR / Pbを54μLを分注（ターゲット17のための4つのウェルを除く）の井戸を設定し、指定PR / PBに作業ストックを設定します。分注ターゲット17 PR /鉛の67.5μlを指定されたターゲット17 PR / PBに作業ストックを設定井戸を設定する。指定されたウェルへの正しいNTC作業ストックミックスの22.5を添加する。 </li><li>内容は井戸の底にあることを確認するために700×gで1分間接着プレートシールと遠心機で96ウェルプレートをシール。 </li><li> 96ウェルプレートアダプターを用いて、ボルテックスミキサーで96ウェルプレートに置き、1000rpmで1分間混合する。遠心分離機700×gで5分間、96ウェルプレート。 </li><li>同じ日に使用している場合以外の場合、使用するまで-20℃で保存し、4℃で暗所に96ウェルソースプレートを保管してください。 </li></ol></li><li> PR / Pbは自動化されたマルチチャンネルピペッターを使用して設定し、追加することによって、384ウェルアッセイプレートを準備します。 NOTE：96ウェルソースプレートから六アッセイプレートの調製は、3-4時間かかります。 <ol><li>プレートを作る前に、4℃に冷却巣を事前に冷やし及び分20〜25リットル（LPM）との間で吹いて空気の流れを80℃〜125℃までのプレート蒸発器とボトムヒートブロックを予熱。 </li><li>自動化されたマルチチャンネルピペッターに切り替え、二重のソフトウェアのアイコンをクリックすることにより、IFNアッセイプレートを作るためのプロトコルを開きます。 </li><li>プラットフォームをセットアップするには、プラットフォームの1位の完全に完全なピペットチップボックスを配置し、4位の96ウェルソースプレート、及び6位の新しい384ウェルプレートは、再生ボタンを押すことで実行を開始します。 注：実行が完了すると、各ウェルはPR / Pbのミックスの5μLが含まれます。 NOTE：384ウェルアッセイプレートは0.025μgのあるのssDNAの最終的な量を各ウェルに添加。 </li><li>穏やかにウェルの底にある流体を確実にするために平らな面に384ウェルアッセイプレートをタップして、接着剤を適用するプレートシール。 </li><li>遠心機700×gで1分間プレート。プレート乾燥機に384ウェルアッセイプレートを置き、接着プレートシールを取り外して、井戸の真上に384ウェルマニホールドを配置する。 </li><li> 384ウェルアッセイプレートの内容乾いた、新しい接着プレートシールを適用すると、使用するまで4℃で暗所に箔、ラベル、およびストアに包む。 注意：プレートを少なくとも6ヶ月間4℃で保存することができる。 </li><li>繰り返しステップは3.2.3-3.2.6 6×まで、384ウェルアッセイプレートを用意するか、96ウェルソースプレート内の液体が枯渇する。 </li><li> 、冷却巣をオフにしてソフトウェアを閉じて、自動化されたマルチチャンネルピペッターをオフに切り替える。プレート乾燥機の電源をオフにします。 </li></ol></li></ol> 4.ロードと384ウェルアッセイプレートを実行する<ol><li> （二ハウスキーピング遺伝子（HKG）HKG、ssDNAを、PCRマスターミックス、及び水のPr / Pbのセットで構成されてよくミックスを調製し、乾燥し、384ウェルアッセイプレートに添加する<stronG&gt;図3D）。 注：ミックスの調製とアッセイプレートをロードするには、1〜2時間かかります。アッセイプレートを実行すると、以下で2時間かかります。 <ol><li>各HKGミックス1.5 mlチューブにラベルを付けます。 </li><li> 84.9μlの水でのssDNA（10 mg / ml）での2μlの希釈します。希釈された一本鎖DNAの2μlを、水の11.8μL、マスターミックスの23μLを追加し、正しい20X HKGのPr / PRの9.2μlを各チューブ、ボルテックス、および簡単に遠心分離機にセット。 </li><li>ヒトアッセイにHKGとしてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）及びユビキチンC（UBC）を使用して（ 材料表を参照）。アカゲザルアッセイにHKGとしてGAPDHおよび18SリボソームRNAを使用してください。 注：このアッセイを行うために使用HKGは柔軟であり、細胞タイプに適切な遺伝子を反映すべきであるが、試験されるGAPDH、UBC、および 18Sは、一般的に使用されるHKGの例である;。他のHKGがより適切である。 </li></ol></li><li>サンプルとPOSITIを準備よく乾燥した384ウェルアッセイプレートに添加することが、試料または陽性対照cDNA、マスターミックス、及び水から成る混合物を、制御VEの。 21プレートウェル（ 図3D）に分配するために十分な量のサンプルおよびポジティブコントロールミックスを準備します。 <ol><li> cDNA合成に先立ち、DNアーゼ消化段階でRNAサンプルを調製し、製造元の指示に従ってください。 </li><li>製造業者の説明書に従ってRNアーゼH（各サンプルの24μlの最終容量）で処理したRNAの少なくとも500ngののcDNA合成から予め試料および陽性対照を調製する。使用するまで-20℃で調製したcDNAを保管してください。簡単に解凍、ボルテックス、およびサンプルcDNAを遠心する。 </li><li>各24μlのサンプルおよび陽性対照チューブにマスターミックスの78.8μLと水の54.8を添加する。 </li><li>簡単にボルテックスチューブを遠心分離機。 </li></ol></li><li>基準およびNTCうまくミックスを準備し、CONマスターミックスと水sistingは、乾燥した384ウェルアッセイプレート（ 図3D）に添加する。基準がよく混ぜるために、1.5ミリリットルチューブにマスターミックスの275μlに水165μlを添加する。 NTCのためによく混ぜ、1.5ミリリットルチューブ内のマスターミックスの52.5μlに水の52.5μlを添加する。簡単にボルテックスチューブを遠心分離機。 </li><li>ミックスやサンプルのローディングのため乾燥した384ウェルアッセイプレートを準備します。 <ol><li> 4℃から384よく乾燥アッセイプレートを外し、700 X gで1分間遠心する。 </li><li>接着プレートシールを削除して、さまざまなミックスやサンプルは（ 図1）をピペットされる場所を指定するためにプレートのウェルを概説し、チルド384ウェル冷却ブロックにプレートを置きます。 </li></ol></li><li>標準うまくミックス、標準と384ウェルアッセイプレートをロードして、NTCはよく、サンプル、ポジティブコントロール、およびHKGミックス（ 図3E）を混ぜる。手短にボルテックスし、プレートに分配する前に、すべてのソリューションを遠心。 <ol><li> 30μlの電子マルチチャンネルピペットで各標準ウェルに混ぜるだけでなく基準の6μL分注する。 12.5μlの電子マルチチャンネルピペットでよく指定さへの正しい標準段階希釈の1.5μLを分注する。 </li><li> 30μlの電子マルチチャンネルピペットで各ウェルNTCに混ぜよくNTCの7.5μLを分注する。 30μlの電子マルチチャンネルピペットで指定されたウェルにサンプルの7.5μLを分注する。 HKG PR / Pbは12.5μlの電子マルチチャンネルピペットで指定されたウェルにミックス2.5μlの分注する。 </li><li> 30μlの電子マルチチャンネルピペットで残り水とマスターミックス混合物の7.5μlの空の井戸を埋める。水の7.5μlを一人でも動作します。 </li><li> 700×gで1分間、光学接着フィルム及び遠心分離機で384ウェルアッセイプレートをシール。 2600 rpmで2分間ボルテックスミキサーで密封し、384ウェルプレートをボルテックスそして700×gで5分間遠心する。 </li><li>アッセイレイアウトのテンプレートを開き、実行を開始し、定量RT-PCR機に封入された384ウェルアッセイプレートを置きます。 注：結果は、スプレッドシートのように、分析のためのテキストフ​​ァイルとしてエクスポートすることができます。 </li><li>アッセイのための次の最適なサーマルサイクラー反応条件を使用した：i）50℃で2分間、ii）は95°Cで10分間、iii）は、95℃25秒間、iv）は59℃で1分間。 40サイクル、手順IIIおよびIVを繰り返します。 </li><li>表計算アプリケーションソフトに定量RT-PCRプラットフォームからの生データをエクスポートします。直線性を観察する標準曲線として設定された各4点標準をプロットします。 ΔCqを計算することによって、または4点標準曲線27に基づいて、コピー数による解析を実行します。 </li></ol></li></ol>以下の図3を参照してください

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Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

このレポートでは、デザイン、バッチ生産、研究実験室の設定で非常に類似した遺伝子のセットの転写を測定するためのアッセイの分析に向けたアプローチについて説明します。ここで報告されたハイスループット定量RT-PCRアッセイは、IFN-γを測定し、 -高い特異性を有するλサブタイプ。この方法は、2つの重要な側面は、相同遺伝子ファミリーのメンバー及びPr / Pbのセットをプリロード信頼性と一貫性384ウェルアッセイプレートを作成するための製造プラットフォームの開発を区別するのPr / Pbのセットの設計を含む。定量RT-PCRプローブは、それらの特異性29の強化に向けた構造的な（MB）または化学（LNA）アプローチを取り入れる。アカゲザルアッセイ（ 表2）のプライマーセット2については、増幅不応性変異システム（ARMS）をさらに30特異性を増強するためのプライマー配列に組み込んだ。それはenhaにエクソン - エクソンジャンクショ​​ンをターゲットにするのが最善ですが私はIFN遺伝子型がイントロンを欠いているため定量RT-PCR反応のNCEの特異性は、これは不可能であった。したがって、ゲノムDNAは、PCR反応で増幅され、RNA抽出後、DNase処理によって分解されなければならない。 Prは/鉛セットのターゲット領域は、各IFN成熟ペプチドのコード領域に限られていた。なぜならIFN-αサブタイプ、特に成熟したペプチド領域の間で高い配列類似性は、特異性を確実にするために感度を犠牲にすることが必要な場合があった。これは特に、他のIFN-αサブタイプと比較したとき成熟ペプチド転写物は4つだけのユニークな拠点を持ち、IFN-α17、の場合と同様。ターゲティングIFN-α17は、プローブに特異性を制限し、複数のサブタイプの転写物を結合するプライマーを必要とした。結果として、PCR反応は、それによってPCR試薬およびloweriのかなりの割合を消費し、IFN-α17以外の亜型を増幅するIFN-α17に特異的なプローブからの蛍光信号の振幅をngの。このようなIFNのような高度に類似する遺伝子を高感度かつ特異的Prは/ Pbのセットを設計するに向かって追加の課題は、GenBankデータベース中の注釈付き配列が、設計時に完全または包括的ではないおそれがある。再び、これは、新たに注釈付き配列が完全に設計時にデータベース中の配列のバージョンと整列しないようなIFN-α17の課題であった。 Prのを設計する際にそのため、/ Pbが集中的に研究されていない遺伝子のために設定し、定期的に標的遺伝子の最新注釈付きのシーケンスを確認するのが賢明です。最後に、Prは/鉛セットは転写されるが翻訳されないが偽遺伝子を増幅しないようにする必要がある。 Prは/鉛セットを設計した後、次の課題は、17の異なるPrは/鉛つの384ウェルプレート上にセットするのPCR条件を最適化されている。トラン規格はimporですPrは/鉛セットの特異性を試験し、多数の異なるPCR反応の定量RT-PCR条件を調和するために不可欠となるでTANT。転写産物標準に対してPR / Pbのセットをテストすると、その効率性と感度を確立します。非常に類似した偽遺伝子を発現するプラスミドは、PR / Pbが選択的に機能的な遺伝子の転写を測定設定していることを確認する必要があるかもしれない。転写規格はまた、ハウスキーピング遺伝子（ΔCq）の半定量分析と比較に加えて、分析（転写物の数）の定量的な手段を提供する。 複数の384ウェルアッセイプレートに96ウェルソースプレートからのロボットのマルチチャンネルピペットは、プレート間の結果の精度と一貫性を向上させる。サケ精子DNA（一本鎖DNA）を安定化及びPr / Pbは、プレートに分注した試薬を乾燥しないように、長期保存のための設定が維持される担体として使用される。プレートを乾燥させても反応の量を減少させる順番に貴重なサンプルを保存し、高価な試薬の使用を減少させる再現性のある結果のために必要な。こうした工程を経て、プレートのバッチは、半年以上の精度と一貫性を提供するように組み立てられる。 プレートの準備に続いて、品質管理対策は、プレートのバッチの整合性をチェックするために重要である。この目的のために、標準の追加の4組のプレート上で実行される。 「5倍標準」プレートがパフォーマンスを追跡し、個々のプレートの基準が比較されるデータセットを作成します。各標準の10 10倍希釈液をアッセイ設計の際に使用されていますが、スペースの考慮事項が4点を各アッセイプレート上の標準曲線のために、そして5倍標準プレートのために使用されていることが必要です。また、陽性対照は、プレートの有効性を保証するために、各プレートに含まれるべきである。 典型的に、一つのPr /鉛sから6アッセイプレートを調製するために3~4時間を要するourceプレート。それは研究室で一日に12プレートを準備することが可能である。各ヒトIFNサブタイプのアッセイプレートの17のPr / Pbのセットを調べ、15実験試料を収容することができるので、アセンブリの一日3060実験データ点まで発生させる能力を有するプレートのバッチを生成する。定量RT-PCRプラットフォームからの生データを処理し、自動的にあらかじめデザインされた解析テンプレートを埋めるために、スプレッドシート·アプリケーション·ソフトウェアでプログラミングスクリプトを使用して組み立てることができる。この方法は、実践的なデータ入力を最小限に抑え、それによってコピーエラーを防止し、治験責任医師は、データ分析ではなく、データ·アセンブリに集中することができます。ここで説明したように、このハイスループット定量RT-PCRアッセイは、ヒトまたはアカゲザルサンプル中のインターフェロンサブタイプの発現を測定するために適用することができ、他の種または相同遺伝子セットに使用するように適合させることができる。プレートレイアウトの柔軟性は、ユーザが遺伝子を調整するために、プライマー/プローブセットを変更することができ特定の細胞型またはモデル系に向けて関心。このアッセイは、免疫​​応答に関与するシグナル伝達機構を解明するために、病原体を研究細胞培養モデルにおける、または疾患モデルの文脈において、患者サンプル中のIFNの発現サインを測定するために適用することができる。

I型およびIIIインターフェロン（IFN）は、すべての脊椎動物1で、ウイルスや他の病原性の刺激と存在に対する免疫応答において重要である。免疫および非免疫細胞は、IFN 2発現及び分泌、ならびに応答をする。そのようなToll様受容体（TLR）、STING、およびRIG-Iのような自然免疫センサは、病原体関連分子パターン（PAMP）3,4の検出時にタイプIとIII IFNの発現を誘導する。ヒトでは、I型IFNは、IFN-β、-ω、-κ、およびIFN-αの12のサブタイプが含まれ、IFNAR1 / IFNAR2受容体に複雑な2,5をバインドします。 III型IFNは、IFN-λ1、-λ2、および-λ3を含み、IL10RB / IL28RA受容体複合体2に結合する。古典的には、I型およびIII IFNその後STAT1 / STAT2ヘテロダイマーを募集し、インターフェロン刺激遺伝子（ISG）6の転写を開始するそれぞれの受容体複合体に結合する。 ISGは、抗ウイルスおよびアンチから、機能の多様な範囲に関与している適応免疫応答7の活性化に増殖活性。 病原体は、回避破壊、及びIFNシグナル伝達経路の要素をハイジャックするように進化してきた多数のメカニズムが自然免疫応答8におけるIFNの重要性を実証する。例えば、ワクシニアウイルスはヤバ様病ウイルスは、IおよびIII IFNタンパク質10を入力阻害糖タンパク質を分泌しながら、私は9型 IFN隔離IFNAR1相同性を有するデコイ受容体を発現する。宿主防御におけるそれらの役割に加えて、IFNはまた、癌の監視および自己炎症性疾患の多数に関与している：乳癌細胞におけるIFNの発現のサイレンシングは、免疫監視11を制限する、IFN-αの過剰産生は、全身の開発の機構であるエリテマトーデス12、及びSTINGの誤った活性化はSTING関連血管障害におけるIFNの過剰な量に起因する全身性炎症につながる13。治療、IFNは、多発性硬化症14、そのようなHBV 15などの慢性ウイルス感染およびHCV 16,17、ならびにヘアリーセル白血病18および慢性骨髄性白血病の19のような癌を治療するために使用される。特定の生理学的プロセスにおけるIFNの関連性についての質問には、継続的にこのサイトカインファミリーのユビキタスな性質を明らかにする。 私IFN、特にIFN-αサブタイプを入力して、多くの場合、1エンティティ20-23としてではなく、密接に関連しますが、異なるタンパク質のグループとして考えられている。脊椎動物の進化24を通してIFN-αサブタイプを含む複数のIFN種の存在および持続性は、これらのサブタイプの少なくともサブセットは、特定のまたは独自の機能を有することを示唆している。これは、IFN発現の定義パターンを解読およびサブタイプ17のうちの1つ以上の特定の機能を特徴づけるために役立つ可能性がある。 Tを研究課題12 IFN-αサブタイプのシェア&gt; 50〜25％とIFN-λサブタイプはそれらのアミノ酸配列の81から96パーセント26を共有：彼は私とIII IFNサブタイプは、共有配列同一性に基づいていますを入力します。記載のqRT-PCRアッセイでは、分子ビーコン（MB）およびロックド核酸（LNA）蛍光プローブは、非常に類似のIFNサブタイプの配列間の単一塩基対の違いを判別し、IFNの発現サインの特徴付けを可能にする。アッセイの384ウェルプレート形式は、それぞれの転写物のコピー数及びΔCqによる分析を可能にする、定量的（転写物基準）および半定量的（ハウスキーピング遺伝子（HKG））措置の両方を含む。プライマー/プローブ（Prと/ Pb）を乾燥により可能に自動化されたマルチチャンネルピペット操作、及び長期保存によって容易バッチアセンブリは、アッセイの再現性、有用性、および実用性を高めるため、プレート上にセットする。 このプロトコルは、プロセスについて説明します384ウェルのqRT-PCRアッセイプレートヒトIFNサブタイプ（ 表1）を標的とする最大17の異なるPrは/ Pbのセットを有する（ 図1）を製造する。 Prは/ Pbは在庫ソースプレート（ 図2）は、ロボットのマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用して自動化することができるプロセスで複数の384ウェルアッセイプレートを調製するために使用されるワーキングセット。初期の焦点は、ヒトIFNの発現サインを研究するためのプロトコルを作成していたが、この方法は、同様にアカゲザルに適用されている。プレートレイアウトは若干異なっているとPr / Pbのセット（ 表2）は異なっているものの、ヒトおよびアカゲザルのプレートを作成するための全体的な製造方法は同一である。プロトコルの最小限の変更で、この方法は、密接に関連する遺伝子の他のグループを研究するためのアッセイの開発を可能にするために実行することができる。 図1と図2以下を参照してください 表1と表2ベルを参照してくださいOW

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

記載のqRT-PCRアッセイは、細胞型および様々な状況下におけるI型およびIII IFNの発現パターンを分析するために実施することができる。例えば、ヒトI型およびIII IFN発現シグネチャは、TLRリガンドで刺激した6人のドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）で分析した。ポリI：C（25μg/ ml）を、LPS（10 ng / ml）を、イミキモド（10μM）、およびCpGオリゴヌクレオチド（1μM）（ 図4）。データは、表計算アプリケーションソフトウェアを使用して分析し、それらのタンパク質配列27の系統樹に応じて時計回りに配置されたIFN-αサブタイプを持つレーダーチャートとして示した。ヒトIFN発現のレーダチャートは、アッセイデザインに組み込ま分析の二つの異なる方法を用いて計算された対数スケールで示されている：HKG（ΔCq）に対して正規化した絶対Cqの値を、総RNAのマイクログラム（μgの）当たりのテンプレートのコピー数。コピー数の値は、結果oから計算される<html> FA転写物の標準曲線。データは、TLRアゴニストによって誘発ヒトIFN発現シグネチャは、リガンド特異的であることを示している。 以下の図4を参照してください ヒトIFN発現シグネチャのために実証されているように、アカゲザルにおけるI型およびIII IFNの発現シグネチャは、特定のTLRリガンドであった。 3時間（ 図5）はC（50μg/ ml）を、LPS（10μg/ ml）を、およびイミキモド（10μg/ ml）で3ドナーからのPBMCは、ポリIで刺激した。ベースラインでの非刺激細胞におけるIFNサブタイプの発現は低かった。 C：IFN-γサブタイプの限られた数は、LPS及びポリIに応答して発現させた。対照的に、イミキモドに応答してIFN発現が高く、サブタイプの発現は広かった。すべての3つのTLRは28アゴニストによるIFN-βおよびIFN-λ1の発現が増強された。 以下の図5を参照してください 常に &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> 図1：17 PR / Pbのセットで384ウェルアッセイプレートのレイアウト目標数は、PR / Pbのセットを指します。 4点標準曲線（濃い灰色の三角形）は、列1-5に追加されます。 HKGのPr / Pbのセット（白色背景）の列6,7、残りのカラムに加え、8-24は、17のPr / Pbのセットのいずれかに特異的である。サンプルは、列6-24（黒矢印）から、行APに追加されます。コラム5の下部にある2つのウェル（O5、P5）は水だけとマスターミックスを受け取る。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> 図2：17 PR / Pbのセットで96ウェルソースプレートのレイアウト目標数は、PR / Pbを指しセット。 Prは/鉛セットが複数のウェルに添加したときの黒矢印は表す。 NTCミックスは指定されたウェル（濃い灰色の背景）に追加されます。斜線2ウェル（F3、G3）が未使用である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> 図3：定量RT-PCRアッセイプロトコルにおける具体的な手順の概略 AE図はプロトコルの一部を選択します。 （A）工程1：標準の連続希釈液の調製。 （B）ステップ2：PR / PbおよびNTC作業ストックミックスの調製。 （C）ステップ3.1：Prの/ PbのセットとNTCミックスの96ウェルワーキングストックプレートの調製。 （D）ステップ4.1-3：384ウェルアッセイプレートをロードするためのミックスの調製。 （E）サンEP 4.5：384ウェルアッセイプレートのロード。図は右下の角を左、上から読み取られます。インターフェロン（IFN）アッセイのための試薬 ​​は-20 O℃で保存され、左の列に表示されます。行は、プロトコルでアクションを分離する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> 図4：末梢血単核細胞におけるヒトIFN発現シグネチャー（PBMC）は TLRリガンドで刺激し、そしてRNAは、定量RT-PCR分析のために採取したPBMC の刺激のために使用されるTLRリガンドに応じて異なっている 。私のポリピーク応答の幾何平均：16時間で8時間（赤四角）でのC（25μg/ ml）を、4時間（緑の三角形）でのLPS（10 ng / ml）を、イミキモド（10μM）（紫色の菱形）は、CpG（1μM）で6ドナーから16時間（黒丸）、16時間（青丸）で刺激されていない制御がHKG UBCΔCq（左）の発現の関数としてまたはRNAのμg当たりコピー数（右）としてログ10スケールで示されている。 IFN-αサブタイプは、アミノ酸配列の類似性の系統プロットに従って順序付けられる。この図は、もともと免疫学と細胞生物学27に掲載されました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> 図5：末梢血単核細胞（PBMC）におけるアカゲザルIFN発現シグネチャーを刺激するために使用されるTLRリガンドに応答して、異なる PBMC（正方形、菱形、三角形で指定された）は、3つのアカゲザルからの全血から単離し、そしてC（50μg/ ml）またはイミキモド（10μg/ ml）を：リポ多糖（LPS）（10μg/ ml）を、ポリIで刺激された。細胞は、OPE（0時間目に採取したnの形状）またはIFN発現の測定のためのTLR刺激（黒塗りの3時間）後。タイプI、II、およびIII IFNの転写レベルは、HKG GAPDHΔCq（左）またはコピー数/μgのRNAを（右）などの発現の関数として対数10スケールで表示されます。この図は、もともとインターフェロンとサイトカイン研究28のジャーナルに掲載されました。 <img alt="表1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> 表1：ヒトIFNプライマー/プローブセット配列及び反応情報は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">、この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> 表2：アカゲザルIFNプライマー/プローブセット配列及び反応情報は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">、この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> プラスミド濃度（FM） </td></tr><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> ℃ </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> 表3：標準希釈設定濃度情報。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN PR / Pbのセットが追加された </td><td> 水のボリュームを追加（ML） </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β、-ω、-λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1、-α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6、-α8、-α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14、-α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21、-λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> 表4：NTC作業ストックは、情報をミックス。

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High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K ビュー.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

免疫・感染学

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

ラベル無料三次元定量的な位相画像を用いたリンパ球サブタイプの同定と機械学習

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...