我々は、議論とコメントのためのスザンナ·ヒューイット、特に、Skokラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康補助金総合研究所R01GM086852、RC1CA145746（JAS）によってサポートされています。 JASは白血病リンパ腫協会の学者です。 JCは、がん研究所のア​​ーヴィング研究所フェロー。 MMは、国立科学財団助成統合大学院教育研究見習（NSF IGERT 0333389）によってサポートされています。

1。フルオロフォアとのDNAプローブのラベリング：ニック翻訳（〜6時間） <ol><li>クリーンBAC DNA（マキシプレップにより調製）またはプラスミドやPCR産物は、H 2 Oに再懸濁した全てが、標識に使用することができます注堅牢FISHの信号については、プローブは少なくとも10キロバイトに及ぶべきであること。 </li><li> 37℃（全ての試薬 ​​を表1に記載されています）で30分間のRNaseのDNAインキュベートする。 </li><li> 16℃（ 表2、表3を参照）で2時間、ニックトランスレーション反応をインキュベートする。直接標識の代替方法は、（：魚タグ、インビトロジェン例）を使用することができる。 </li><li> -80℃で1時間反応を不活性化する-20℃℃または一晩</li><li> 2％アガロースゲル上でプローブサイズを決定します。塗抹標本は、約300から500塩基対（Cy5でプローブのスミアが表示されていないことに注意してください ）での過半数で、100〜1,000 bpの間でなければなりません。 DNAが十分に消化されていない場合は、それ以上のDNA Pol IはとDNase Iを反応に添加し、16℃でさらに2時間インキュベートすることができます</li><li>暗闇の中で2時間、H 2 0で埋め2リットルビーカーで0.025ミリメートルフィルター上のプローブを精製する。 </li><li>次のようにプローブにブロッキング要因を追加します：COT-1 DNA、Hybloc10μgのDNAとDNAプローブ10μgのためのサケ精子の100μg10μgの。 -20℃で保存されたDNAプローブ</li></ol> 2。プローブ降水量/変性/プレアニーリング（3-4時間） <ol><li> 0.3μgおよびDNAプローブ1μgの間には、カバースリップあたりに使用されます。ミックス-80℃で1時間インキュベート3M NAACの0.1倍量（pH5.2）との100％エタノールを2.5倍量のプローブ、℃または-20℃で一晩、4℃、13,000 rpmでスピンダウン℃で30分間。 DNAプローブの量はDNAとハイブリダイゼーションの核領域の品質に応じて調整することができることに注意してください。直接標識の代替方法は、減少した量の使用を許すかもしれませんプローブ。 1スライド上の複数のDNA FISHシグナルの検出のために、異なるプローブ（反復配列のようなプレアニーリングしてはならないプローブを除く）一緒に沈殿させることができる。同時に行われ、いくつかの実験のためのプローブも一緒に析出させることができる。ペレットを軽く（プローブの少量が沈殿している場合は、ペレットが見えないかもしれません）を使用する蛍光団によると着色することがあります。 </li><li>乾燥ペレットと37から45℃（約20分間）で暗所（エッペンドルフサーモミキサーを使用して）を振とうしながらカバースリップあたり（ 表4を参照）15μlのハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁します。 </li><li> 75から95で5分間変性プローブ​​℃、 </li><li> 30〜60分間、37℃でプローブをプレアニール。プレアニールの長さは、プローブの複雑さと品質に応じて調整することができる。 </li><li>一晩ハイブリダイゼーション用のカバーガラス（セクション3を参照）にプローブを適用します。 </li></ol> 3。 3次元DNA魚 - 一日目（〜3時間） <ol><li>非接着細胞を1×PBS（カバースリップあたり5〜10μlの1×PBS中〜2×10 5細胞）を少量に濃縮し、ポリ-L-リジンコートカバースリップの中央にドロップされます。接着細胞は、少なくとも24時間（〜70％コンフルエント）（カバーガラスを0.1％ゼラチンでコーティングしてもよい）のカバースリップ上で培養されるべきである。スクエア18×18に24〜24ミリメートルのカバーを6ウェルプレートに配置され、プロトコル全体、各溶液2ミリリットルを（あるいはラウンド1.5mmのカバーガラスが12/24-wellプレートに配置することができます）ウェルあたりに使用されます。 </li><li> RT（4％PFAの株式は-20℃で保存し、等分することができます）で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1×PBS、pHが7から7.4で細胞を固定してください。パラホルムアルデヒド（16％）溶液で購入することができ、または4％の原液を粉末/プリルから調製することができる。パラホルムアルデヒド粉末を調整し、氷の上で&gt; 60℃（pHは溶解を容易にするために8-9に増加させることができる）、冷却されたダウンで1X PBSに溶解さED pHが7から7.4にし、濾過し、ハヤブサに分注し、-20℃で週間保存</li><li> 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で5分間冷やした冷0.4パーセントトリトン-X-100 / 1X PBSで細胞を透過。透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができるNBは ：DNAのFISHは免疫と組み合わされている場合は、免疫染色は（ セクション4を見てください）、この段階で行うべきである。 </li><li> 37℃で1時間、1×PBS、1×PBS中の0.1μg/μLのRNase Aを持つインキュベート細胞内で3回洗浄した後℃にカバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセットで除去されます。任意の抵抗が発生した場合は、カバーガラスは、細胞の損傷を避けるために、1×PBSでフラッディングされなければなりません。 </li><li> 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で10分間冷やした冷0.7パーセントトリトン-X-100 / 0.1M HCl中で細胞を透過。 </li><li> 3回洗浄した後、私nを1×PBS、室温で30分間1.9 M塩酸で変性細胞。交互に、細胞を少なくとも30分間75から80℃で50％ホルムアミド/ 2×SSC中で変性させることができます。ハイブリダイゼーション長（および温度）細胞型に応じて最適化することができることに注意してください 。 </li><li>氷冷1X PBSで3回洗浄した後、℃の暗多湿室で37℃で一晩プローブを用いて細胞をハイブリダイズする。カバーガラスをスライド上のプローブの15μlの上にドロップセル側を下に置かれ、ラバーセメントで封止されている。 </li></ol> 4。 3次元免疫魚 - 初日（6月7日〜HR） <ol><li>組み合わせた免疫蛍光DNA /魚のため、免疫染色は、0.4％トリトンX-100（ ステップ3.3）で透過処理した後に実行されるべきである。 </li><li>室温で30分（2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清、0.1％のTween-20）のためにブロッキング溶液中で細胞をインキュベートします。ブロッキング溶液を濾過し、1.5mlのEppendorfsに等分し、mに格納されている-20℃でonths </li><li>湿潤チャンバー内の室温で1時間、タンパク質またはブロッキング溶液で希釈した関心のヒストン修飾に対して惹起された一次抗体を用いて細胞を培養する。ここでは、H2AXのリン酸化セリン-139（;詳細については、 表5を参照して 、γ-H2AX、ミリポア）に対する抗体の一例を示す。カバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセット（必要に応じて1×PBSで水浸し）で削除されます。希釈およびインキュベーション長は抗体および細胞型の品質に応じて調整することができることに注意してください。 </li><li>振とうしながら、0.2％のBSA / 0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。 </li><li>暗くて湿ったチャンバー内で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切な蛍光色素標識二次抗体を用いて細胞をインキュベートします。ここでは、との検出の例を示す二次ヤギ抗マウス抗体（のAlexa Fluor 488または555、インビトロジェン、詳細については表5を参照）。ハプテン標識二次抗体（ビオチン、ジゴキシゲニン、等）を使用することもできる。この場合、適切な検出（ストレプトアビジン、抗DIG、etc）のための余分なステップは一晩、DNA-FISHハイブリダイゼーションの前または後に実行することができます。 </li><li>暗闇の中で振とうしながら、0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。 </li><li>暗闇の中で室温で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1X PBSでポストフィックス細胞。 </li><li>前述のRNase A（ ステップ3.4）中でのインキュベーションからのDNA FISHを続ける。 </li></ol> 5。 3次元DNA FISH /免疫魚 - 2日目（〜2時間） <ol><li>慎重にラバーセメント、2X SSCと洪水のカバーを取り外し、慎重にピンセットで除去し、洗浄液を含むウェルの中に置いてください。 </li><li> 37℃で30分間振とうしながら、暗闇の中でCの2×SSC中で細胞を洗浄します。</li><li>振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間2×SSC中で細胞を洗浄します。 </li><li>振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間1×SSC中で細胞を洗浄ホルムアミドと変性の場合には、洗浄は、次のように置き換えなければならないことに注意してください：50％ホルムアミド/ 2×SSCおよび2x SSC、5で3回洗浄で3回洗浄37℃で、それぞれをmin℃に </li><li>全DNAの対比は1.5μg/ mlのDAPI（4,6 - ジアミジノ-2 - フェニル）を含むゴールドマウンティングメディウムを延長で細胞をマウントします。カバーガラスをスライド上に媒体をマウントの10〜15μlのドロップにセル側を下に配置し、マニキュアで封止されている。スライドは、-20℃で数ヶ月の​​ために保持されてい</li></ol> 6。 3D顕微鏡と分析<ol><li> 3D画像は、異なる顕微鏡システムで取得することができます。我々の実験では、0.3μm以下で区切ら光学切片はライカSP5 AOBS共焦点システム（音響光学ビームスプリッタ）で収集されます。 視神経の間の分離に注意してくださいリットルプレーンは分析の種類に応じて調整することができる。 </li><li> 3D画像スタックは、さまざまなソフトウェアやツールを用いて分析することができる。我々は、関心のある遺伝子座の間の距離の測定値を評価するために、サブ核コンパートメントまたはタンパク質と興味のある遺伝子座の協会の様々なタイプを分析するイメージJソフトを使用しています。 </li><li>異なる種類の細胞やステージ間の比較は、目的の異なる遺伝子座の間の比較：すべての統計分析は意義のペアごとの評価（複数可）と2（またはそれ以上）の異なる生物学的条件を比較するために行われている。 1.00E-3≤P≤1.00E-2 *;すべての統計的検定では、P値≤5.00E-2（= 0.05）（1.00E-2≤*著しいP≤5.00E-2重要であると解釈される*非常に重要な、P &lt;1.00E-3 ***非常に重要）。 </li></ol> 二つの対立遺伝子間の距離の全体の分布の統計解析。我々は最初のc我々はノンパラメトリック二標本コルモゴロフ·スミルノフ（KS）のテスト13,14を使用する実証的対立遺伝子間の距離の分布の差の有意性を評価する2 alleles.To間で測定された距離の範囲全体にわたって累積分布の周波数曲線をonstruct。 カットオフの最適な距離を使用して、2つの対立遺伝子の密接な関連の統計解析（すなわちペアリング）。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離で最も堅牢な差の範囲を指定するには、我々は2つのテールフィッシャー正確確率検定15秒のシリーズをご使用ください。すなわち、それぞれの測定距離で、我々は一つの条件が大幅に2つのサンプル間の短い距離で過剰表現されているかどうかをテストします。 P値の分布の最小値は、二つの対立遺伝子の密接な関連のカットオフ（ すなわちペアリング）として考慮されるべきである距離の範囲を示しています。続いて2テールフィッシャー正確確率検定は、tを使用されている同定されたカットオフ値15で2つの対立遺伝子のペアリングの意義を評価O。多重検定補正は16を実行フィッシャーテストの総数を考慮するために適用されます。 サブ核コンパートメントまたはタンパク質と目的の遺伝子座の協会の統計分析は、2つのテールフィッシャー正確確率検定は、異なる区画またはタンパク質15を用いて目的の遺伝子座の協会の意義を分析するために使用されます。

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上記の詳細テクニックは、リンパ球の30,31を開発中の免疫グロブリンおよびTCRA / D座のV（D）J組み換えの規制を分析するために私たちの研究室で使用されていた。我々は、この技術は、異なる細胞型では、様々な核タンパク質、核コンパートメントと遺伝子座の検出に適応させることができると確信しています。プロトコルの修正が必要になることがあり、この場合に集?...

エピジェネティックなメカニズムトリガ成立と発達と細胞型特異的転写プロファイルの継承。 1レベルでこれは、アクティブまたはサイレントゲノム領域を定義クロマチン包装の変調を伴う。大規模に、ゲノムと核構造のグローバル3D組織はまた、転写パターンの制御に役割を果たしています。したがって、これらのepigenomic機能の解剖は、遺伝子が6-11を規制されている方法を完全に理解するために不可欠です。 組み合わせた免疫蛍光法および3DのDNA FISHは、特異的な相互作用/核内のDNA配列および/またはタンパク質の関連を評価することによって、分子および生化学的解析を補完するユニークな機会を提供します。さらに、このようなクロマチン免疫沈降（ChIP-seq）が染色体またはキャプチャのコンフォメーションなどのゲノムワイドなハイスループット技術は深いシーケンシングと相まってしばらく（4C-SEQ、5Cは、Hi-C）にグローバルdatを提供細胞集団は12日 、免疫蛍光/ DNA FISHの技術は、単一細胞レベルでの解析を可能にします。 ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫FISH）が続いたDNA FISHによって免疫蛍光法およびDNA配列によってヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。このプロトコルの利点は、DNAやタンパク質の構造の保全を組み合わせた視覚化したものです。この分野での我々の経験では、既存のプロトコルを改善し、簡素化することができるようになりました。我々は組換えを受けてリンパ球におけるDNA二本鎖切断を検出するには、このプロトコルを使用していたが、この方法は、他のタンパク質と他の細胞型に適用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP2470 </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ</td><td> ＃R4642 </td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td>シグマ</td><td> ＃DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td>アレクサdUTPを</td><td>インビトロジェン</td><td> C-11401に＃C11397 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3またはCy5 dUTPを</td><td>フィッシャー</td><td> ＃45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>ロッシュ</td><td> ＃04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol Iは</td><td>バイオラボズ</td><td> ＃M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025μmフィルター</td><td> Millipor電子</td><td> ＃VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> COT-1 DNAを1 mg / mlの</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNAを1 mg / mlの</td><td>応用遺伝学</td><td> ＃MHB </td><td></td></tr><tr><td>サケ精子</td><td>シグマ</td><td> ＃D1626 </td><td>粉末をH 2 O中に10 mg / mlで再懸濁される</td></tr><tr><td> NAAC（酢酸ナトリウム、pH 5.2緩衝液） </td><td>シグマ</td><td> ＃S7899 </td><td></td></tr><tr><td>フィコール400（モルBIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td>第525位</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（MOL BIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP431 </td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸パウダー</td><td>シグマ</td><td> ＃D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE（生理食塩水リン酸ナトリウム、EDTA）を20倍ソリューション</td&gt; <td>フィッシャー</td><td> ＃BP1328 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP227 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12-548-B </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12から550 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> ＃0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10×PBS、 </td><td>フィッシャー</td><td> ＃MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液</td><td>シグマ</td><td> ＃P8920 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、プリル、95％ </td><td>シグマ</td><td> ＃441244 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100、MOL BIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン）フラクションV </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクトルラボ</td><td> ＃S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20を、モルBIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC（食塩クエン酸ナトリウム）20倍ソリューション</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Gold退色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI（4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール） </td><td>シグマ</td><td> ＃D9542 </td><td></td></tr><tr><td>最高のテスト1コートラバーセメント</td><td>アートやオフィス用品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1に特異的な試薬及び小型機器。 </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

3D共焦点顕微鏡（3DのDNA FISH）を、続いて3次元的に保存核にDNAプローブを用いた蛍光 in situハイブリダイゼーションは、個々の細胞における遺伝子座の位置、サブ領域の染色体または全体の領土を視覚化するための最も直接的な方法を表しています。このタイプの分析は、核のグローバルアーキテクチャだけでなく、核空間内の特定のゲノム遺伝子座や地域の行動への洞察を提供します。免疫蛍光法は、他の一方で、核タンパク質の検出（修正ヒストン、ヒストンバリアントと修飾、転写機構や要因、原子力サブコンパートメントなど）を許可します。免疫蛍光法および3DのDNA FISHを組み合わせるにおける主要な課題は核の3Dアーキテクチャと同様に抗体によって検出されるエピトープを保持する一方であり、他方では、DNAプローブの浸透が検出できるように遺伝子座や染色体テリトリーの1月5日。ここでは、3D保存核内ゲノム遺伝子座とクロマチン修飾の可視化を組み合わせたプロトコルを提供します。

DNAと免疫FISHはBおよびTリンパ球の開発時に抗原受容体遺伝子座のV（D）J組み換えのプロセスに関連付けられている核の組織の変化を研究するためにSkokラボで使用されています。私に私たちを有効にする）遺伝子座の両端（収縮）の間の測定距離は上記の詳細技術ⅱ）対立遺伝子または遺伝子座の間の測定距離（ペアリング）、iii）は座、静脈内で発生するDNA損傷を解析するには）対立遺伝?...

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Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K ビュー.  New York University School of Medicine. ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNAベースの魚種の識別プロトコル

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

ウズラ·アヒルキメラを使用して顔面発展に種特異的な貢献を評価する

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

凍結切除ゼブラフィッシュ胚に対する順次免疫蛍光と免疫組織化学

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.