この研究プロジェクトは、アルコール乱用やアルコール依存症、国立研究所から受賞番号R21AA017735（YS）によってサポートされていました。内容は、執筆者の個人的責任であり、必ずしもアルコール乱用やアルコール依存症や国立衛生研究所、国立研究所の公式見解を表すものではありません。筆者もこの原稿を編集するためのチャリシーモンゴメリに感謝したいと思います。

1。動物繁殖と食物連鎖ペプチドトリートメント<ol><li> 2時間男性のホームケージに雌マウス（〜6週齢、平均体重20グラム）を配置することにより品種C57BL/mice。 </li><li>直後に精子プラグおよび/または膣スメアをチェック。 </li><li>正の場合は、胎生0（E0）、この時点を指定する。 </li><li> 3）、1）アルコール（エタノール）液体食群（ALC）、2）ペアフィード対照群（PF）：E7に最近4説明したように、制御、治療群（3群）に重量マッチ妊娠雌が割り当てられているアルコール暴露流動食（ALC/ADNF-9）と一緒ADNF-9ペプチドの腹腔内（IP）注射を受けるべきであるペプチド治療群、。 ALCとPF食事の準備の詳細と腹腔内注射の手順は、我々の最近の仕事の4で見つけることができます。 </li><li>栄養素の唯一の供給源としての自由なアクセスとして提供することができる毎日のアルコール液体食を測定します。 T個別に結ばPF流動食OはALCダムも同様に毎日測定することができます。 </li><li>前の24時間の間に消費流動食の量を30 mlのがスクリューキャップチューブを卒業し、作りたての食事はE7からE13まで毎日提供されるべきであるから、記録することができます。 </li></ol> 2。胎児と胎児の脳の顕微解剖の解剖<ol><li>深く頸椎脱臼に続いてCO 2の手順でマウスを安楽死でE13に妊娠マウスを生け贄に捧げる。 </li><li> 70％エタノールで切開の腹部サイトを清掃します。 </li><li>滅菌はさみやピンセットを使って腹部切開を行います。 </li><li>腹部が開いたら、1鉗子でそれを保持していると離れて子宮から子宮間膜を引き裂くために他の鉗子を使用して子宮を解剖する。胚を穿刺避けるために徐々に、この手順を行うことを確認してください。 </li><li>子宮から胚を取り出し、ハンクス平衡塩溶液を含む細胞培養ディッシュ（60ミリメートル×15ミリメートル）にそれらを移す<html> （HBSS）氷冷水た。 </li><li>顕微解剖のために実体顕微鏡下に全体の胚から胎児の脳を解剖。 </li><li>マイクロダイセクション用超微細鉗子を使用して、頭蓋骨を露出するために頭の上部分に胚の皮膚をやってのける。 </li><li>一度頭蓋骨が露出していると明らかにその後脊髄と脳幹領域における脳の後部から始まる頭蓋骨はがし、顕微解剖の実体顕微鏡下で可視化。 </li><li>後方から頭の前方部分に作品によって頭蓋骨片を剥離することを確認してください。 </li><li>胎児の脳を視覚的にさらされると、それらの抽出を続行します。 </li><li>原基嗅球のベースから後脳のベースに胎児の脳を解剖。 </li><li> Postfixはすべて2〜3日のために4％パラホルムアルデヒド中で胎児の脳を解剖した。あなたがウェスタンブロット法または酵素アッセイのためにそれらをテストしている場合にも、それぞれのダムからの他の胎児の脳を凍結することができます。 </li></ol>NT &quot;&gt; 注意：動物の使用のための手順は、インスティテューショナルアニマルケアによって承認と制度動物ケアのガイドラインに従っていると国立衛生研究所での委員会を使ってトレド大学の委員会のためのガイドを使用していた実験動物のケアと利用。 3。セクショニング用ゼラチンで胎児の頭脳を埋め込む<ol><li>ゼラチングレードAの10％を準備</li><li>途中ピールアウェイ埋め込み金型を記入し、ゼラチン固化するまで待ちます。 </li><li>固化したゼラチンの上に置きコントロールおよび出生前治療胎児の脳のサイド·バイ·サイド。これは、対照群と実験群の両方との間に細胞死の免疫検出の一貫した状態を保つことである。 </li><li> （ゼラチンが高すぎないことを確認してください）​​完全な金型を作るために胎児の脳の上にゼラチン液を追加します。 </li><li> 15分間の胎児の脳を保持している準備ゼラチン金型を冷蔵。 </li><li>はがす2日間の4％パラホルムアルデヒドに既製ゼラチン含む胎児の脳を転送し、プラスチックと埋め込み型。 </li><li>冠状切片用に厚さ50μmでビブラトーム切片マシン（ライカVT 1000S）を使用して、ゼラチンでプレイスとセクション固定胎児の脳。それは良いの解剖学的特徴を提供しますので、この厚さは我々の研究でテストされる。また、25μmの厚さと高も10％のゼラチンで胎児の脳の埋め込み含むこのテクニックを使用してテストすることができます。冠状セクションは前脳の大脳基底核隆起レベルでビブラトームを使用してカットされたことに注意してください</li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液中の胎児の脳切片を収集する。 </li><li> Superfrostプラス水中でスライドで胎児の脳切片をマウントします。 </li><li> 15分間取り付けられたセクションを乾かします。 </li><li> TUNEL反応の翌日のテストのためにPBSでスライドを（胎児の脳切片搭載）に置きます。 </li></ol> 4。デためのTUNEL反応細胞死またはアポトーシスの護 （TUNEL：TdTを媒介dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）。このアッセイは、細胞死を決定することを目的とする。 <ol><li> 37°C（20ミリリットルPBSで混合プロテイナーゼKを300μl）で5分間プロテイナーゼK（20μgの/ ml）でSuperfrostプラススラ​​イドに搭載された胎児の脳切片を扱う。スライドは）5 Plendオープンマイレで組み立てられる。 </li><li>オービタルシェーカーで5分間PBS三回と胎児の脳切片を（スライドにマウント）すすいでください。 </li><li> 3％、室温で10分（3ミリリットル30％27中のH 2 O 2ミリリットル、100％メタノール）（スライドはシェーカーすべきではありません）のためにメタノール中のH 2 O 2とセクションをインキュベートする。 </li><li>オービタルシェーカーで5分間PBS三回でセクションをすすぐ。 </li><li>氷上で2分間（4℃）（100μlのトリトンX + 0.1グラムのクエン酸ナトリウム+ 99.9ミリリットルdistilleための透過性付与溶液のセクション（0.1％、0.1％クエン酸ナトリウムでトリトンX-100）をインキュベートdは水）。 </li><li>オービタルシェーカーで5分間PBS中のセクションを2回すすいでください。 </li><li>スライド内のセクションの周りの乾燥した場所。 </li><li> PAPのペンを使用してSuperfrostプラススラ​​イド上の障壁を描画。これは、任意のTUNEL陽性細胞の検出のためのセクションを治療するために使用される溶液の漏れを防止することを目的としている。 </li><li> 37℃で1時間、TUNEL反応混合物（ボトル1から50μlを、ボトル2〜450μl）を°Cを持つセクションをインキュベートし、制御がボトル2からの溶液中でのインキュベーションによって使用される。 </li><li> PBS三回軌道シェーカーで5分で洗い流してください。 </li><li>組織の周りの乾燥した場所。 </li><li> 37℃で30分のためにコンバータ-PODでセクションをインキュベート</li><li>トリス塩酸（pHは7.5、0.05 M）との5分間のセクションを三回すすいでください。 </li><li> 0.05％の3&#39;-3&#39;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB）及び0.003％H 2 O 2（25ミリリットルトリス塩酸、pH7.5中、0.05 M +25μlを3％H 2 O 2 + 500で7分間のセクションをインキュベートμlのDAB）4℃（氷）と暗闇の中で（新しい5 Plendオープンメーラーにこのプロシージャを行うことを確認してください）​​でOribtalシェーカー下。 </li><li> PBS三回オービタルシェーカーで5分でセクションをすすぐ。 </li><li> PBS中では24以上の時間PBSでスライド·セクションを維持し、次節プロトコルで詳細としてニッスル染色のためにそれらを処理します。 </li></ol> 注意：DABは発がん性物質である。手袋を使用して、一度にすべての実験が終了し漂白剤で使用するすべての料理をきれいに。 5。顕微鏡観察のための胎児の脳切片の調製のためのニッスル染色<ol><li>ニッスル染色法は、生物学的安全フード内で行われるべきである。 </li><li> 2分間脱イオン水でスライドセクションをすすぐ。 </li><li> 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 6分間95％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li>脱ワットのセクションをすすぐ2分間えー。 </li><li> 3分間ステインクレシルバイオレットのセクションをインキュベートする。 </li><li> 2分間脱イオン水のセクションをすすぐ。 </li><li> 2分間70％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 95％エタノールで切片+ 3分間3ミリリットルの氷酢酸をインキュベートする。 </li><li> 2分間95％エタノールで切片をインキュベートする。 </li><li> 2分3回、100％エタノールのセクションをインキュベートする。 </li><li> 10分3回キシレンのセクションをインキュベートする。 </li><li>胎児の脳切片を保持するスライドをパーマウントとカバースリップガラススライドを用いて実装することができる。 </li><li>マウントは、顕微鏡観察や分析の前に一晩スライドしたままにしておきます。 </li><li>顕微鏡観察と顕微鏡写真はライカ正立顕微鏡下で行うことができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

いいえ開示は行われませんように。

本研究で提示方法論と技術は出生前の胎児の脳のアルコールへの暴露とこれらの効果の予防に栄養ペプチドの役割の効果を実証する。これらは別の妊娠段階で胎児の脳で虐待や他の有毒化学物質の他の薬剤を研究する方法についての情報を提供することができる。 繁殖パラダイムに関しては、いくつかのケースでは精子プラグの検出が観察されないことがあります。こ?...

ここに記載の実験方法の目的は、摂食microdissecting、及び細胞死を検出し、繁殖を含むいくつかの技法を用いて胎児のアルコール暴露モデルにおいて栄養ペプチドの神経保護効果を評価することである。我々の研究室からの仕事は1-5消費アルコールの量の長期的に人間の飲用パラダイムのようになります適度な飲酒のモデルとしてアルコールと混合された流動食を必要としてきた。我々と他の人が胎児のアルコール暴露の有害な影響に対して神経保護の3つのペプチド誘導体を同定した。動物モデルを用いた胚の段階でアルコール暴露を調査研究は、神経保護潜在的なメカニズムの同定につながり、介入手順の開発を可能にすることができる。これは、妊娠中のアルコール暴露の有害な影響の神経保護効果及び減衰に関する十分な情報を提供することができる。 出生前のアルコール暴露の影響の可能性の予防は、in vitro 6,7 で神経保護およびin vivo 1,2,4,8,9 に関与することが示されているペプチドで妊娠マウスの治療を含むことができる。これらのペプチドのうち、ADNF-9またはSALとして知らSALLRSIPAは、活動依存神経栄養因子（ADNF）7,10から派生しています。活動依存神経保護タンパク質（ADNP）6,11、由来の配列NAPVSIPQペプチドと呼ばれるNAPのもう一つのペプチドは、アルコール暴露12,13に関連付けられている酸化ストレスに対する強力な保護効果を示した。また、最近、胎児のアルコール暴露モデル2における重要な神経保護の役割を果たすと思われる新規合成したペプチド、colivelinを同定した。 ColivelinはADNF-9とAGA-（C8R）HNG17（PAGASRLLLLTGEIDLP）で構成されています。これらのペプチドの使用の重要性は、それらの能力を有することであるアルコール誘発性アポトーシスおよび脳の成長欠損の影響を防ぐために、血液脳関門を通過する。 実験方法は、アルコール誘発性アポトーシスに対する神経保護効果をテストするためにC57BL / 6マウスを使用していました。我々はそれが精子プラグと膣スメア1-5の検出により明らかにすることができるように正確に、胚の日を0（E0）を推定するために、代わりに一晩の繁殖の2時間窓を採用しています。これはフリーアクセスの代わりに妊娠したマウスにストレスを誘導することが強制経口経路を通じてアルコールの配信と考えられているように我々は、栄養チューブで流動食を使用している。一方、マイクロダイセクションは、初期胚の段階で胎児の脳を解剖したときに発生することがあり胎児の脳組織の柔らかさに起因して挑戦することができます。ここでは、マイクロダイセクションを含むすべての課題に対処するための可視化手法を示す。さらに、胎児の脳切片にも挑戦することができますので、我々は採用しているゼラチン埋め込むピールアウェイ用いた金型で胎児の脳を埋め込む伴う手法。私たちは、50ミクロンの厚さで自由に浮遊セクションで胎児の脳の切断に成功している。これは、私たちは、細胞死の識別を含む、胎児の脳切片におけるコンテンツタンパク質の任意の変化を調べることができます。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

胎児の脳の成長の初期胚の段階で出生前のアルコール暴露の影響を調査するための実験的なデザインが挑戦しています。これは主に胎児の脳の顕微解剖の難しさとアルコールへの出生前暴露により引き起こされるアポトーシス細胞の決定のためにそれらの切片によるものです。実験では、胎児の脳組織における細胞死の同定に繁殖マウスから可視化技術を提供ここで説明する。この研究は、C57BL /胎児のアルコール暴露とアルコール誘発性アポトーシスに対する栄養ペプチドの役割を研究するための動物モデルとして6マウスを使用していました。繁殖は、胚の年齢の正確な段階を決定するために、2時間マットウィンドウで構成されています。確立された胎児のアルコール暴露モデルは、胎児の脳における出生前のアルコール暴露の影響を決定するために、この研究で使用されている。これは、妊娠マウスのために栄養素の唯一の供給源としてアルコールやペアフィード流動食への無料アクセスが含まれます。 アポトーシスを調べるために、胎児の脳を第ビブラトーム切片装置との剥離を容易にするために、離れて金型を用いて、ゼラチンに埋め込まれている。パラホルムアルデヒドに埋め込まれ、固定された胎児の脳を容易に区画され、遊離浮遊切片は、アポトーシスまたは細胞死の決定のためsuperfrostプラススラ​​イドに装着することができる。 TUNEL（TdTを媒介性dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）アッセイは、細胞死またはアポトーシス細胞を同定するために使用されている。これは、APのことは注目に値するoptosisおよび細胞媒介性細胞傷害性は、DNAの断片化によって特徴付けられる。したがって、可視TUNEL陽性細胞は、細胞死またはアポトーシス細胞を示す。 ここで実験的なデザインは、アルコールと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドの役割の効果を研究するための確立された流動食の使用に関する情報を提供します。これは、繁殖と妊娠マウスを供給する、胎児の脳をmicrodissecting、およびアポトーシスを決定することを含む。一緒に、これらのビジュアルとテキスト技術は胎児の脳中の有害物質の胎児期曝露を調査するための源であるかもしれません。

実験方法は、2時間の繁殖ウィンドウは正確な妊娠段階を推定することが不可欠であることを示しているここで説明する。我々はE13歳で胚の解剖を示した。また、E13で胎児の脳の顕微解剖を示した。 図1に記載の手順は、いくつかの段階を（交流）を含む。胎児の脳原基嗅球のベースから後脳のベース（ 図1）に解剖されています。胎児の脳を、次に免疫化学的検出の?...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

実験デザインは、ここでアポトーシスと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドのアプリケーションでのアルコール曝露の影響を勉強に集中を提案した。育種から胎児の脳のコレクションへの詳細な説明が記載されている。アポトーシスを測定するための技術も詳細に説明する。

C57BL / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、ADNF-9、

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

experimental-methods-for-testing-effects-neurotrophic-peptide-adnf-9

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K ビュー.  University of Toledo. 実験デザインは、ここでアポトーシスと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドのアプリケーションでのアルコール曝露の影響を勉強に集中を提案した。育種から胎児の脳のコレクションへの詳細な説明が記載されている。アポトーシスを測定するための技術も詳細に説明する。

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

神経科学

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

器官小脳文化：アポトーシス課題と検出

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

MOG35 55 を受ける c57bl/6 マウスの矢状面運動歩行解析による実験的自己免疫性脳脊髄炎

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

マウスにおけるインテコール内合成タンパク質の定量測定

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

神経栄養性角膜炎の誘発のためのマウス角膜神経擦過傷

行動研究のためのC57BL/6マウスにおける思春期の社会的ストレスパラダイム

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female rodents is needed to understand its effects on ongoing brain development and behavioral outcomes. The chronic social defeat stress paradigm (CSDS) has been widely used to model social stress in adult C57BL/6 male mice by leveraging on the aggressive behavior displayed by an adult male rodent to an intruder invading its territory. An advantage of this paradigm is that it allows to categorize defeated mice into resilient and susceptible groups based on their individual differences in social behavior 24 h after the last defeat session. Implementing this model in adolescent C57BL/6 mice has been challenging because adult or adolescent mice do not typically attack early adolescent male or female mice and because adolescence is a short period of life, encompassing discreet temporal windows of vulnerability. This limitation was overcome by adapting an accelerated version of the CSDS to be used for adolescent male and female mice. This 4-day stress paradigm with 2 physical attack sessions per day uses a C57BL/6 male adult to prime the CD-1 mouse for aggressiveness such that it readily attacks the male or female adolescent mouse. This model was termed accelerated social defeat stress (AcSD) for adolescent mice. Adolescent exposure to AcSD induces social avoidance 24 h later in both males and females, but only in a subset of defeated mice. This vulnerability occurs despite the number of attacks being consistent across sessions between resilient and susceptible groups. The AcSD model is short enough to allow exposure during discrete periods within adolescence, allows the segregation of mice according to the presence or absence of social avoidance behavior, and is the first model available to study social defeat stress in adolescent C57BL/6 female mice.

著者スポットライト:マウスの神経発達に対する思春期の社会的逆境の影響を理解する

We developed an accelerated social defeat stress model for adolescent C57BL/6 mice, which works in both males and females and allows exposure during discrete adolescent periods. Exposure to this model induces social avoidance, but only in a subset of defeated male and female mice.

思春期C57BL/6雄雌マウスの社会的敗北ストレスモデル

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...