私たちは、MIAモデル、自閉症、統合失調症研究の進歩への貢献のために後半博士ポール・H・パターソンを尊重したいと思います。我々は、このプロトコル上の彼の偉大なサポートのためにサルキスK. Mazmanianを認めます。ルーベンM.バイヨン、イヴェット・ガルシア・フローレス、カレンC. Lencioni、および行政支援のためのレスリーA.ノイマン。撮影上の支援のためのアリKhoshnanとヤンC.コ。 MIA誘導に対する助言のためのエレインY.シャオとナタリアMalkova。彼らの専門家畜産用のジェフリー・S・コクラン、ホアキン・グティエレス、クワンF.リー、ハイメ・ロドリゲス、ロレーナC.サンドバル、とナタリーA. Verduzco。この作品は、（ポール・H・パターソンにNIH 5P50MH086383-04、）NIHコンテセンター賞によってサポートされていました。自閉症は（ポール・H・パターソンに、＃7670）を語ります。 （サルキスK. Mazmanianへ＃322839）シモンズ財団。 NIHトレーニンググラント（K.-HCにNIH / NRSA T32GM07616）。 （ZY）は、カリフォルニア工科大学の夏学部研究フェローシップ（SURF）。アムジェン学者カリフォルニア工科大学（ZYへの）プログラム。そしてポストドクトラルフェローシップFRオム国家科学委員会、台湾（NSC 101から2917-I-564から039、W.-LWへ）。

すべてのプロトコルは、カリフォルニア工科大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認の下で実施しました。 時限交配ペアの1.準備<ol><li>遺伝子発現解析のために、少なくとも6行動実験のためのダムと3を使用してください。 注：マウスの​​約50％は時限交配から差し込まれるように、推定された雌マウスの二重番号を使用します。 </li><li>なし妊娠前に、年齢の8-16週でメスのマウスを使用してください。 注：女性のマウス雄マウスの前に性的な露出を持っていますが、妊娠していない許容可能です。 </li><li>ハウスは、雌マウスは、一緒に、お互いの隣に自分の発情周期を同期させるためにケージを置きます。 5成体マウスの筐体を可能にするために、5.5インチ以上の高さと75平方インチインテリアフロアで、標準的なマウスケージを使用してください。耳パンチを用いて、各メスのマウスにラベルを付けます。 </li></ol> 2.時限マットを設定しますINGペア<ol><li>暗サイクルが始まる前に、時限交配0-2時間を設定します。各ケージに2匹の雌マウスを置きます。マウスを取り出し、それらを個別に量ります。各雌のマウスの体重を記録します。 </li><li> 2雌マウスと各ケージに1人の男性にマウスを置きます。父方の交絡影響を最小限にするためにトリオの交配を使用してください。 </li></ol> 3.プッシープラグチェック（E0.5） <ol><li>暗サイクル終了後に雌マウス0-4時間を確認してください。ゆっくり尾の付け根からメスのマウスを持ち上げて、マウスがワイヤグリッド、ケージ上部、またはケージの縁をつかむことができます。 </li><li>膣栓の兆候を検索：膣のプラグインは膣口に見える白っぽい塊です。プラグがはっきりしない場合は、そっと膣口に200μlのピペットチップを挿入します。凝固からの抵抗は、膣プラグ形成を確認します。 1日に1回、膣プラグを確認してください。 注：ワギナプラグは交尾が発生したことを示すだけであり、したがってグラムありませんuarantee妊娠。膣栓マウスの特定の系統において同定することが困難であり得ます。プラグ識別の精度を高めるために、経験豊富なマウスの介護者から助けを求めます。 </li><li>新しいケージに差し込まマウスを移動して、グループがそれらを収容します。胚0.5日（E0.5）などの膣プラグ外観の日を定義します。 </li></ol> E10.5-11.5 4.、妊娠をチェックします<ol><li>ゆっくり尾の付け根を持ち上げて、マウスがワイヤグリッド、ケージ上部、またはケージの縁をつかむことができます。 例えば 、妊娠の兆候をチェックするために腹部領域を観察し、腹部の膨らみ（ 図1）。 注：妊娠の兆候が常にE10.5よりもE11.5でより明白です。 </li><li>妊娠を確認するために、マウスを計量。妊娠中のマウスは、一般的に非妊娠マウス（ 図2）と比較して、E12.5でE10.5で約20％重く、30％より重い重量を量ります。シングル家のきれいなケージで妊娠マウス。 </li></ol> 5. 20ミリグラム/キロポリ（I：C）の準備<ol><li>遺伝子発現解析のためにグループごとの行動実験のために、グループごとに少なくとも6ダムを使用し、3。解決策：ポリ（C I）の対応する量を準備します。 </li><li> 40ミリグラム/ mlの最終濃度を作るために50mlコニカルチューブ中のパウダー：ポリ（C I）を量ります。最小化し、注入量による応力を標準化、ポリ5μlのを注入するために、（I：C）マウスの体重（5μL/ gの、または5ミリリットル/キログラム）の各グラムのための溶液。 1kg当たり：MIAを誘導するために、我々は、ポリ20mgの（C I）を注入します。 注：ポリ濃度（I：C）必要に応じて溶液（20ミリグラム/キログラム）/（5ミリリットル/キログラム）= 4 mg / mlです。ポリので（私は：C）粉末を10％ポリ含む溶液（I：C）を、我々は（4 mg / mlで）/0.1=に40mg /ポリミリリットル（C I）の最終濃度を確認する必要があります。 注意：ポリ（I：C）粉末は、非常に軽いです。コニカルチューブにへらから転送中の任意の粉末を失わないように注意してください。 </li><li>円錐形の槽に0.9％塩化ナトリウム（生理食塩水）の対応するボリュームを追加eとキャップを閉じます。溶液が透明になるまで粉末：そっとポリ（C I）を介して生理食塩水の液滴を圧延することによって粉末を溶かします。 1分（ 図3C）、800×gでコニカルチューブを遠心。 0.22μmのフィルターにより溶液：ポリ（C I）をフィルタリングします。 1.5または2ミリリットルのマイクロチューブに：（C I）溶液にポリを転送します。オプション：ソリューション：ポリ（C I）の260/280比を測定するために、分光光度計を使用してください。製造業者によって記載されるように比率が1.54から1.82（ 図3）との間にあることを確認します。注：ポリ（I：C）を溶解するために使用される生理食塩水粉末をし、制御インジェクションとして働くには、滅菌し、医薬品グレードであるべきです。 </li></ol> 6.生理食塩水またはポリ（I：C）E12.5での注射<ol><li>スケール上でマウスを計量し、ケージに戻します。 （I：C）マウス：体重（グラム）5を乗じ=目標噴射量（μl）を生理食塩水とポリ両方のための注射の量を計算するには、次の式を使用します。 INSUL 0.3ミリリットルを使用します30グラムのマウス用の溶液、 例えば、150μlの：注射器で計算された生理食塩水の体積または20 mgの/ kgのポリ（C I）を策定します。 </li><li>ゆっくり尾の付け根によってマウスをピックアップし、ケージの上に置きます。ストレスによる交絡の影響を避けるために、穏やかに、マウスを扱います。その2つの上部のニップル（ 図4）の中心にマウスに対して約20°の角度、アップベベル、針を挿入し、生理食塩水またはポリ（I：C）を注入ソリューションを。注：針を注射した後、各マウスのために交換する必要があります。 </li><li>バックそのホームケージにマウスを置きます。他の交絡の影響を回避するために、静かな、交通量の少ない部屋にケージを置きます。 </li></ol> 7.ポリデイ・アフター（I：C）注射（E13.5） <ol><li>次の朝に注射したマウスを確認してください。体重を測定するためのスケールを使用してください。 注：ポリ（I：C）は、通常INJ日後に生理食塩水を注射したマウスよりも少ない重量を得る妊娠マウスに注射しection。 </li><li>子孫が生まれされるまでマウスを邪魔しないでください。 </li></ol> MIAの子孫の8ゲージ<ol><li> MIA誘導の交絡の影響を最小限にするために、MIAの子孫の使用状況を把握するために以下に示すガイドラインに従ってください。 <ol><li>産子数が5未満である早産または遅延誕生から、または場合リットルを除外します。 </li><li>産子数が10よりも大きい場合、CO 2による過剰な子犬を安楽死させます。 </li></ol></li></ol> 9.オプション：MIA後急性炎症反応を調べ<ol><li>金融機関の動物管理委員会が承認したプロトコルに記載された方法を用いて射出：生理食塩水またはポリ（C I）の後に妊娠マウス3時間を生け贄に捧げます。 注：頸椎脱臼は、しばしば、それがダムと胚のCO 2 /安楽死薬の効果を最小化するように好ましいです。 </li><li>大人の妊娠マウスから脾臓を収集し、胎盤と胎児のブラジャーを隔離実体顕微鏡下インチ<ol><li>脾臓収集のため、解剖のプレート上にマウスを置くと妊娠マウスの腹部に70％エタノールを噴霧します。皮膚を通して胸郭下の腹部領域の中央に縦のカットを作るために滅菌ハサミを使用してください。 </li><li>脾臓は、左上腹部の象限に位置しています。脾臓を分離するために鉗子を使用してください。臓器の周りの脂肪組織を除去するために、繊細なタスクワイパーに脾臓をロールバックします。脾臓組織の約50ミリグラムを収集し、500μlのRNAとエッペンドルフチュー​​ブに個別にそれらを配置する核酸の分解を防ぐためにバッファまたはのTRIzolを安定させます。使用するまで-80℃の冷凍庫でサンプルを保管してください。 </li><li>胎盤の収集のために、優しく身体から子宮角を引き出します。オートクレーブ滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされたペトリ皿に子宮角を置き、氷上で料理を残します。子宮壁を開き、羊膜を露出させる引き裂くために、2つの鉗子を使用してください。 <ol><li>慎重に胎盤と胎児を損傷することなく、羊膜嚢を開くために鉗子を使用しています。胎児から胎盤を分離し、可能な限り胎盤に近いへその緒を切りました。胎盤から羊膜片を除去。個別バッファまたはのTRIzolを安定さ500μlのRNAを用いてエッペンドルフチュー​​ブに胎盤を置きます。使用するまで-80℃の冷凍庫でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li>胎児の脳の収集のために、解剖まで、ステップ9.2.2からバッファを安定化RNAで胎児を格納します。実体顕微鏡下で繊細な＃5ピンセットを用いて脳の心室から軟膜オフ膜をいじめます。慎重に胎児の脳からすべての膜を除去します。バッファまたはのTRIzolを安定さ500μlのRNAを用いてエッペンドルフチュー​​ブに個別に胎児の脳を置きます。使用するまで-80℃の冷凍庫でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li>組織からRNAを抽出し、RNAをcDNAに変換します。実TによりcDNAにおけるIL6遺伝子発現を分析しますIME PCR。 </li><li> TRIzolの製造プロトコルに従うことによって、組織からRNAを抽出します。組織は、RNA安定化緩衝液中に保存されている場合。サンプルを解凍し、バッファをスピンダウン。 500μlのトリゾールで別のエッペンドルフに先端によって組織を転送し、RNA抽出を続けます。 </li><li>濃度、260/280およびRNAの260/230比を測定するために、分光光度計を使用してください。比が2.0以上であることを確認します。 </li><li> 10μlの最終体積にDNアーゼIをミックス1μgのRNAを、1μlの10×反応緩衝液、1μlのRNaseフリーのDNase、およびヌクレアーゼフリー水でRNAを処理したことにより、DNAの混入を排除。 30分間37℃でマスターミックスをインキュベートします。反応を終了させるために1μlのDNaseを停止液を追加します。 65℃で10分間混合物をインキュベートします。 </li><li> cDNAとRNAを逆転写。 20μlの反応を使用し、反応あたりの全RNAのμgの1まで。転写（RT）反応ミックスバッファーを逆5X 4μLを混ぜ、1μlの回転ERSE転写酵素は、DNアーゼIおよび4μlのヌクレアーゼフリーH 2 Oで処理した後の11μlのRNA鋳型は、最終的な20μlの溶液を作製します。 RT用サーマルサイクラー条件をプログラムします。一般的な条件は次のとおりです。ステップ1：5分間25℃。ステップ2：30分42℃。ステップ3：5分間85℃。ステップ4：4℃で保持します。 cDNAの5倍に希釈します。短期保存の場合、4℃でのcDNAを保存します。長期保存の場合、-20℃でのcDNAを凍結します。 </li><li>リアルタイムPCRによりcDNAにおけるIL6遺伝子の発現を分析し、βアクチン遺伝子発現に対してIL6遺伝子発現を正規化します。 <ol><li> IL6およびβアクチンを検出するためのマスターミックスを行います。 25μlの反応を使用し、各遺伝子のマスターミックスを12.5μlのSYBRグリーンミックス、10μMのフォワードプライマー0.5μlの、10μMのリバースプライマーと6.5μlのヌクレアーゼフリーH 2 O0.5μlのは、 </li><li> 5μlの5倍に希釈したcDNA aを置きます光学96ウェル反応プレートのウェルの底部T。最終的な25μlのPCRミックスを作るために、各ウェルにマスターミックスのピペットを20μl。各サンプルの各遺伝子を三連。光学接着フィルムを用いてプレートをシール。 4°Cを使用したリアルタイムPCRの標準プログラムで3分間800×gでプレートをスピンダウン：ステップ1：50℃で2分間;ステップ2：10分95°C;ステップ3：1分15秒、温度60℃、95℃の40サイクル。解離曲線のための追加のステップを追加します。 </li></ol></li></ol> 10. MIAアダルト子孫（オプション）で行動異常を調べます。 <ol><li> 8-12週間の年齢で動作テストを実行します。少なくとも3日間のテストの前にケージの寝具を変更します。少なくとも30分の試験前の行動試験室にマウスを順応させます。 </li><li>プレパルス抑制（PPI）については、その下に圧電センサーとプレキシガラス筒内でマウスを抑えます。 PPIにマウスを順応させます5分間のチャンバ。 120デシベルホワイトノイズ（驚愕）の6試験でマウスを公開します。 </li><li>次に無作為バックグラウンドノイズの14試行の混合物、驚愕の14試行、プレパルス5 DB（背景雑音が5 dBの高い）+驚愕（PPI5）の14の試験、及びプレパルス15 DB（15 dBの以上の14の試験をマウスにさらしますバックグラウンドノイズ+驚愕（PPI15）より。 </li><li> 120デシベルの試験の最初の6試験のための驚愕反応を平均します。他の個々の刺激のための驚愕反応を平均します。 /驚愕 - （PPI5またはPPI15驚愕）によりプレパルス抑制に値をひそか。 </li><li>オープンフィールドテストでは、オープン平方 ​​アリーナ（50×50×50 cm 3）での隅にマウスを置きます。天井取り付けられたカメラを通して10分間マウスの軌跡を記録します。中央ゾーン（17×17 cm 2）でのように舞台の中心を定義します。手動または画像ベースの自動解析ソフトによって中心ゾーンで過ごした走行距離、中心ゾーンエントリ、及び時間を定量化します。 </李&gt; <li>大理石の埋設試験では、10分間圧縮5センチメートル深い、きれいな、アスペン松寝具テストケージにマウスを順応させます。そのホームケージにマウスを返します。静かに4×5の配置の仕方で20紺1.5センチメートル直径のガラス玉を配置します。 10分間のビー玉でバックテストケージにマウスを置きます。 10分の試験時間内に埋設されたビー玉をカウントします。 </li></ol> 11. MIAアダルト子孫（オプション）で小脳の神経病理を調べます。 <ol><li>麻酔薬によって生理食塩水とMIAの大人の子孫を安楽死させます。心臓血管系を通って50ミリリットルのPBS、続いて50ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドでマウスを灌流。 </li><li>慎重に脳を取り出して、4で一晩、4％パラホルムアルデヒドで脳を後置 °C。 PBSで3回脳を洗浄し、使用まで4℃の冷蔵庫で0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS中で脳を格納します。 注：後置脳を0.02％SODでPBS中に保存することができ月までのための冷蔵庫の中イウムアジ化。 </li><li>矢状ビブラトームを使用して、50μmの薄いスライスにセクションの脳を。柔らかい筆ペンを使用して、脳切片を収集します。室温で30分間、0.6％過酸化水素でセクションをインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性を終了します。 </li><li>室温で一晩ブロッキングバッファー（PBS中0.1％トリトンX-100及び0.02％アジ化ナトリウムを有する10％のヤギ血清）中に希釈した抗カルビンジン抗体で切片をインキュベートします。次いで、室温で2時間、ブロッキング緩衝液で希釈したビオチン化二次抗体を対応のセクションをインキュベートします。 </li><li>アビジンDHのセクションをインキュベートします - ビオチン化ペルオキシダーゼH複合体のバッファを室温で1時間ビオチンを検出します。抗原を可視化するためにペルオキシダーゼ基質を使用してセクションを開発します。ステップ間にPBSで3回のセクションを洗ってください。顕微鏡スライド上にセクションをマウントします。画像顕微鏡下でのセクション。 </li></オール&gt;

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+transformations+of+neurodevelopmental+sequences+across+mammalian+species.">Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species.</a> J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).</li><li>Abazyan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+interaction+of+mutant+DISC1+and+immune+activation+produces+adult+psychopathology.">Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology.</a> Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).</li><li>Meyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+behavioral+and+pharmacological+dysfunctions+following+disruption+of+the+fetal+brain+balance+between+pro-inflammatory+and+IL-10-mediated+anti-inflammatory+signaling.">Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling.</a> Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).</li><li>Vuillermot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+immune+activation+interacts+with+genetic+Nurr1+deficiency+in+the+development+of+attentional+impairments.">Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments.</a> J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).</li><li>Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Litter+size+predicts+adult+stereotypic+behavior+in+female+laboratory+mice.">Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).</li><li>Harvey, L., Boksa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereological+comparison+of+GAD67+and+reelin+expression+in+the+hippocampal+stratum+oriens+of+offspring+from+two+mouse+models+of+maternal+inflammation+during+pregnancy.">A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

異なる時間窓でのMIAの誘導は、げっ歯類の異なる脳の発達のイベントを乱し、その結果、子孫に異なる行動異常と神経病理につながります。 E12.5で射出：ここでは、ポリ（C I）を有するマウスにMIAを誘導するためのプロトコルを説明しました。 MIA誘導のこの方法は、行動、神経学、免疫学、および子孫8,10,11,16に自閉症や統合失調症に関連した胃腸の異常をもたらします。 MIAは、環?...

母体の免疫活性化（MIA）の概念は、自閉症や統合失調症1と母体感染との関連について疫学研究に由来します。胎盤や母体のウイルス感染2,3-後の胎児の脳で検出可能な複製ウイルス病原体が存在しないために、子孫に感染の影響は、母体の免疫系の活性化ではなく、病原体そのものに起因すると仮定されています。 MIAと精神障害との間の因果関係を解明するために、化学的に合成され、ウイルスを模倣する二本鎖RNAポリイノシンの注入：ポリシチジル酸：妊娠げっ歯類に（ポリ（I C））が広くMIAの動物モデルとして使用されています4,5。ポリ（I：C）は、Toll様受容体3（TLR3）によって認識され、そしてポリ全身投与（I：C）は、ウイルスのような急性炎症反応を誘発します。メカニズムの一つはポリによって（I：C）の広報子孫に行動異常と神経病理をoduces母体の胎盤胎児軸6にプロおよび抗炎症性サイトカインの不均衡を引き起こすことによってです。いくつかのグループは、精神障害7の病因を理解するためにMIAモデルを採用している、と原因の研究グループ間の多様な関心に、免疫活性化の種々の時点では、脳の発達や行動7上の異なる摂動を達成するために使用されてきました。 胚12.5日目に妊娠マウスに正常MIAは、行動、神経学的に誘導することが可能であることを実証した（E12.5）を、（C I）、カリフォルニア工科大学のPaul H.パターソン研究所は、ポリ注入の戦​​略を採用しています自閉症や統合失調症8-11に関連付けられている子孫および免疫学的変化。私たちの前の作品はMIAの子孫が行動異常（ 例えば、社会impairmenを表示することを示していますトン、通信赤字、反復的な行動、不安様行動、および潜在的阻害赤字8,10,12）、免疫調節不全およびサイトカイン不均衡8,13,14、胎児の脳の遺伝子発現15の変化、小葉VIIにおけるプルキンエ細胞の損失小脳11、海馬9におけるシナプスの性質の変化、遺伝子X環境の相互作用13、腸の透過性の変化、および腸内細菌叢の組成物16の。さらに、治療および予防戦略は、このモデルシステム13,16,17から開発されています。 E12.5でMIAを誘導することにより、他の人がMIAは、脳の脳シナプトソーム超微細構造の異常、脳ミトコンドリア呼吸鎖機能亢進abnormalties、脳シナプトソーム分子のダウンレギュレーション17を胎児ミクログリア活性化および前脳基底部18、株特異的な相互作用19におけるコリン作動性発達変化を生み出すことが示されています、抑うつ様行動、認知および海馬の長期増強（LTP）における障害、および成体の海馬の神経新生20の赤字。 だけでなく、自閉症や統合失調症の病因を研究するためにこのモデルを適用する方法のパラダイム：ここでは、ポリ（C I）によりE12.5でMIAを誘導する方法の詳細な方法を提供します。 MIAが障害4の様々な危険因子であることに注意することが重要であり、その成果は、時間と誘導の方法だけでなく、妊娠中のダムの飼育に非常に敏感です。このように、研究室間の些細な矛盾は、多くの場合、低い再現性および/または子孫で異なる表現型をもたらします。我々の方法は、特に自閉症や統合失調症のための環境リスク因子としてMIAの研究に興味のある人のために設計されており、詳細な説明は、研究者がデータの再現性を向上させるのに役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="711">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Polyinosinic&#8211;polycytidylic acid potassium salt</td>
			<td style="width:129px;">SIGMA</td>
			<td style="width:167px;">P9582</td>
			<td style="width:133px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.9% sodium chloride INJ. USP</td>
			<td>HOSPIRA</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MONOJECT insuline syrinage 3/10 mL 29G x 1/2&#34;</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>8881600145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical screw cap tubes</td>
			<td>USA SCIENTIFIC</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>1000</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>M5A</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAlater RNA stabilization reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596-026&#160;</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RQ1 Rnase-free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8891</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastStart universal SYBR green master mix with ROX&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4913922001</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Real-time PCR</td>
			<td>ABI</td>
			<td>7300</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer: Il6 forward</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer: Il6 Reverse</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer: beta-actin forward</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer: beta-actin Reverse</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4306737</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp optical adhesive film&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EthoVision</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>EthoVision</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SR-LAB apparatus (PPI)</td>
			<td>San Diego Instruments&#160;</td>
			<td>SR-LAB</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marbles</td>
			<td>PENN-PLAX</td>
			<td>Blue gem stones marbles</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21600-069</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>MACRON</td>
			<td>2621-59</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton x-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18312</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-calbindin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11426</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td>Optionl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(i:c)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

<html>注射20 mgの/ kgのポリ：E12.5における（I C）は、母体の胎盤胎児軸に急性炎症反応を惹起し、脳の発達や行動の表現型12,13への慢性効果を沈殿させることができます。炎症性サイトカインのレベルの上昇は、インターロイキン（IL）-6は、MIA後の急性炎症反応の信頼できる指標です。注射12,13：IL6遺伝子胎盤における発現および胎児脳のピーク?...

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Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

18.1K ビュー.  California Institute of Technology. Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

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Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

免疫・感染学

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

細胞星状に7つのステップ

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...