Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da Premio Numero R21AA017735 (YS) dagli Istituti nazionale su abuso di alcool e l&#39;alcolismo. Il contenuto è di esclusiva responsabilità dell&#39;autore e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dell&#39;Istituto nazionale su abuso di alcool e l&#39;alcolismo o la National Institutes of Health. L&#39;autore desidera inoltre ringraziare Charisse Montgomery per la modifica di questo manoscritto.

1. L&#39;allevamento e la trofico trattamento con il peptide <ol><li> Razza C57BL/mice mettendo i topi di sesso femminile (~ 6 settimane di età, peso medio 20 g) in gabbie a casa maschi per 2 ore. </li><li> Verificare la presenza di un tappo di spermatozoi e / o striscio vaginale subito dopo. </li><li> In caso positivo, indicare questo punto di tempo come embrionale giorno 0 (E0). </li><li> Su E7, peso-match femmine gravide di controllo e di trattamento (3 gruppi) sono assegnati come descritto di recente 4: 1) (etanolo) gruppo alcolico liquido dieta (ALC), 2) pair-fed gruppo di controllo (PF); 3) gruppo di trattamento con il peptide, che dovrebbe ricevere intraperitoneale (ip) iniezione di ADNF-9 peptide accanto alcool esposizione dieta liquida (ALC/ADNF-9). I dettagli della preparazione di ALC e diete PF e la procedura di iniezioni ip possono essere trovati nel nostro recente lavoro 4. </li><li> Misurare dieta liquida alcol quotidiana che può essere fornito come accesso libero come unica fonte di nutrienti. Dieta liquida PF aggiogato individualmente tO una diga di ALC può essere misurata ogni giorno pure. </li><li> Il volume di dieta liquida consumata durante il precedente 24 ore può essere registrato da 30 ml graduato provette con tappo a vite e la dieta preparata deve essere fornito ogni giorno da E7 a E13. </li></ol> 2. Dissezione dei feti e microdissezione dei cervelli fetali <ol><li> Sacrifica topo gravide su E13 da profondamente eutanasia i topi con una procedura di CO 2 seguito da una dislocazione cervicale. </li><li> Pulire il sito di incisione addominale con il 70% di etanolo. </li><li> Praticare un&#39;incisione addominale con forbici e pinze sterili. </li><li> Una volta che l&#39;addome è aperto, sezionare l&#39;utero tenendola con una pinza e con le altre pinze per strappare la mesometrio via dall&#39;utero. Assicurati di fare questa procedura lentamente per evitare la puntura degli embrioni. </li><li> Rimuovere gli embrioni dall&#39;utero e trasferirli in un piatto di coltura cellulare (60 mm x 15 mm) contenente una soluzione salina bilanciata Hanks &#39;<html> (HBSS) in acqua ghiacciata. </li><li> Sezionare cervelli fetali da tutto embrioni sotto stereomicroscopio per microdissezione. </li><li> Utilizzando ultra-pinza sottile per microdissezione, tirare fuori la pelle degli embrioni nella parte superiore della testa per esporre il cranio. </li><li> Una volta che il cranio è esposto e chiaramente visualizzato con lo stereomicroscopio microdissezione, poi staccare il cranio partendo dalla parte posteriore del cervello al midollo spinale e aree del tronco cerebrale. </li><li> Assicurarsi di staccare il pezzo di cranio per pezzo da posteriore a parte anteriore della testa. </li><li> Una volta che il cervello fetale sono esposti visivamente, procedere alla loro estrazione. </li><li> Sezionare i cervelli fetali dalla base del bulbo olfattivo primordium alla base del metencephalon. </li><li> Postfix tutto sezionato il cervello fetale in paraformaldeide al 4% per 2-3 giorni. È inoltre possibile bloccare altri cervelli fetali da ogni diga se li sta testando per Western Blot o saggi enzimatici. </li></ol>nt &quot;&gt; Nota: Le procedure per gli usi di animali sono stati approvati dalla cura degli animali Istituzionale e Usa Comitato delle Università di Toledo, che sono in conformità con le linee guida del Animal Care and Utilizzare Comitato presso il National Institutes of Health e la Guida per l&#39; cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 3. Incorporare Brains fetali in gelatina per il sezionamento <ol><li> Preparare il 10% di gelatina di grado A. </li><li> Riempire uno stampo peel-away incorporamento a metà strada e attendere finché le solidifica gelatina. </li><li> Controllo e posto prenatally trattata fetale cervelli side-by-side in cima alla gelatina solidificata. Questo per mantenere condizioni coerenti di immunorivelazione di morte cellulare sia tra gruppi di controllo e sperimentali. </li><li> Aggiungere liquido gelatina sulla parte superiore dei cervelli fetali per fare uno stampo completo (assicurarsi che la gelatina non è troppo caldo). </li><li> Mettete in frigo lo stampo gelatina preparata che contiene il cervello fetale per 15 min. </li><li> Staccarel&#39;embedding muffa di plastica e quindi trasferire il pre-fatte di gelatina contenenti cervello fetale in paraformaldeide al 4% per due giorni. </li><li> Luogo e sezione fissa cervelli fetali in gelatina per mezzo della macchina di sezionamento vibratome (Leica VT 1000S) a 50 micron di spessore per il sezionamento coronale. Questo spessore è testato nei nostri studi perché fornisce migliori caratteristiche anatomiche. Inoltre, spessori di 25 micron e superiori possono essere testati con questa tecnica che coinvolge integrata di cervelli fetali nel 10% di gelatina. Si noti che le sezioni coronali sono state tagliate utilizzando vibratome a livello eminenza gangli basali sul prosencefalo </li><li> Raccogliere le sezioni del cervello fetale in tamponata con fosfato soluzione salina (PBS). </li><li> Montare le sezioni del cervello fetale in Superfrost Plus. vetrini in acqua. </li><li> Asciugare le sezioni montate per 15 min. </li><li> Porre i vetrini (montata con le sezioni del cervello del feto) in PBS per il prossimo test giorno di reazione TUNEL. </li></ol> 4. TUNEL reazione per Deprotezione della morte cellulare o apoptosi (TUNEL: TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminale deoxynucleotidyl transferasi). Questo dosaggio è finalizzata a determinare la morte cellulare. <ol><li> Trattare sezioni di cervello fetale montate in Superfrost Plus. vetrini con proteinasi K (20 pg / ml) per 5 min a 37 ° C (300 ml di proteinasi K misto in 20 ml di PBS). I vetrini sono assemblati in 5 Plend aperto Maile). </li><li> Sciacquare sezioni del cervello fetale (montato in diapositive) con PBS per tre volte per 5 min sotto Agitatore orbitale. </li><li> Incubare le sezioni con 3% H 2 O 2 in metanolo per 10 min a temperatura ambiente (3 ml 30% H 2 O 2 in 27 ml di metanolo 100%) (vetrini non dovrebbero essere in una manetta). </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS per tre volte per 5 min in agitatore orbitale. </li><li> Incubare le sezioni in soluzione di permeabilizzazione (0,1% TritonX-100 in 0,1% di citrato di sodio) per 2 min in ghiaccio (4 ° C) (100 TritonX microlitri + 0,1 g di sodio citrato + 99,9 ml distilled acqua). </li><li> Lavare le sezioni in PBS due volte per 5 minuti in agitatore orbitale. </li><li> Zona secca intorno sezioni nelle diapositive. </li><li> Disegnare barriera su Superfrost Plus. diapositive utilizzando penna PAP. Questo ha lo scopo di impedire qualsiasi fuoriuscita di soluzione che viene utilizzato per trattare le sezioni per la rilevazione di cellule TUNEL-positive. </li><li> Incubare le sezioni con miscela di reazione TUNEL (50 microlitri dal flacone 1 e 450 microlitri da bottiglia 2) per 1 ora a 37 ° C, il controllo sarà utilizzato da incubazione in soluzione dalla bottiglia 2. </li><li> Risciacquare con PBS tre volte 5 min sotto Orbit shaker. </li><li> Zona secca intorno tessuto. </li><li> Incubare le sezioni con convertitore-POD per 30 min a 37 ° C. </li><li> Risciacquare le sezioni tre volte per 5 min con Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M). </li><li> Incubare le sezioni per 7 min a 0,05% tetraidrocloride 3&#39;-3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e 0,003% H 2 O 2 (25 ml Tris HCl, pH7.5, 0,05 M + 25 pl 3% H 2 0 2 + 500 DAB microlitri) Sotto Oribtal shaker a 4 ° C (nel ghiaccio) e scuro (assicurarsi di fare questa procedura nel nuovo 5 Plend aperto mailer). </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS tre volte 5 min sotto Agitatore orbitale. </li><li> Tenere le sezioni diapositive in PBS per non più di 24 ore in PBS, poi elaborarli per la colorazione di Nissl come dettagliato nel protocollo sezione successiva. </li></ol> Nota: DAB è una sostanza cancerogena. Utilizzare guanti e pulire tutti i piatti utilizzati con la candeggina, una volta finito con tutti gli esperimenti. 5. Colorazione di Nissl per la preparazione di sezioni di cervello fetale per l&#39;osservazione microscopica <ol><li> Procedura di colorazione Nissl dovrebbe essere fatto in una cappa di sicurezza biologica. </li><li> Sciacquare le sezioni di diapositive con acqua deionizzata per 2 min. </li><li> Incubare le sezioni in etanolo al 70% per 2 min. </li><li> Incubare le sezioni in etanolo al 95% per 6 min. </li><li> Incubare le sezioni in etanolo al 70% per 2 min. </li><li> Lavare le sezioni in deionizzata water per 2 min. </li><li> Incubare le sezioni in violetto cresolo Stain per 3 min. </li><li> Lavare le sezioni in acqua deionizzata per 2 min. </li><li> Incubare le sezioni in etanolo al 70% per 2 min. </li><li> Incubare le sezioni in etanolo al 95% + 3 ml di acido acetico glaciale per 3 min. </li><li> Incubare le sezioni in etanolo al 95% per 2 min. </li><li> Incubare le sezioni in 100% di etanolo per 2 min tre volte. </li><li> Incubare le sezioni in xilene per 10 minuti tre volte. </li><li> Slides possesso sezioni cerebrali fetali possono essere montati utilizzando Permount e copertura antiscivolo vetrini. </li><li> Lascia il diapositive montate durante la notte prima di osservazione microscopica e analisi. </li><li> Osservazione microscopica e microfotografie possono essere eseguite sotto Leica microscopio verticale. </li></ol>

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

Non ci sono informazioni da fornire.

La metodologia e la tecnologia presentata in questo studio dimostrano gli effetti dell&#39;esposizione prenatale ad alcol nel cervello fetale e il ruolo dei peptidi trofici nella prevenzione di questi effetti. Questi possono fornire informazioni sul modo di studiare altre sostanze d&#39;abuso o di altre sostanze chimiche tossiche nel cervello del feto durante le diverse fasi della gravidanza. Riguardo il paradigma allevamento, in alcuni casi la rilevazione della spina spermatozoi potrebbe no...

L&#39;obiettivo dei metodi sperimentali descritti qui è quello di valutare gli effetti neuroprotettivi di peptidi trofiche in un modello di esposizione alcolica fetale utilizzando diverse tecniche che comportano l&#39;allevamento, l&#39;alimentazione, microdissecting, e rilevando la morte cellulare. Lavora dal nostro laboratorio ha coinvolto una dieta liquida mescolata con alcol come un modello di consumo di alcol moderato, che potrebbe essere simile a un bere paradigma umano in termini di quantità di alcol consumato 1-5. Noi e altri abbiamo identificato tre derivati ​​peptidici che sono neuroprotettivo contro gli effetti deleteri di esposizione alcolica fetale. Studi che hanno valutato l&#39;esposizione di alcol durante le fasi embrionali utilizzando modelli animali possono portare all&#39;identificazione di potenziali meccanismi di neuroprotezione e consentire lo sviluppo di procedure di intervento. Questo può fornire ampie informazioni sugli effetti neuroprotettivi e di attenuazione degli effetti deleteri di esposizione alcol durante la gravidanza. Possibile prevenzione degli effetti dell&#39;esposizione prenatale può comportare il trattamento di topi in gravidanza con peptidi che hanno dimostrato di essere coinvolti in neuroprotezione in vitro e in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Tra questi peptidi, SALLRSIPA, noto come ADNF-9 o SAL, è derivato da attività dipendente fattore neurotrofico (ADNF) 7,10. Un altro peptide con la sequenza NAPVSIPQ peptide, PNA definito, derivato dalla proteina neuroprotettiva attività-dipendente (ADNP) 6,11, dimostrato un potente effetto protettivo contro lo stress ossidativo associato con l&#39;esposizione di alcol 12,13. Inoltre, abbiamo recentemente identificato un nuovo peptide sintetizzato, colivelin che sembra giocare un ruolo chiave nel neuroprotettivo alcool modello esposizione fetale 2. Colivelin è composto ADNF-9 e-AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L&#39;importanza dell&#39;uso di questi peptidi è che hanno la capacità diattraversare la barriera sangue-cervello per evitare che gli effetti di apoptosi indotta da alcol e deficit di crescita del cervello. I metodi sperimentali utilizzati C57BL / 6 topi per testare gli effetti neuroprotettivi contro l&#39;apoptosi indotta da alcol. Abbiamo adottato una finestra 2-ore anziché overnight allevamento al fine di stimare con precisione il giorno embrionale 0 (E0), come può essere rivelato dal rilevamento di una spina sperma e striscio vaginale 1-5. Abbiamo usato una dieta liquida con tubi di alimentazione, in quanto questo è considerato libero accesso al posto di consegna di alcol attraverso la via sonda gastrica, che può indurre stress a topi in gravidanza. D&#39;altra parte, microdissezione può essere difficile a causa della morbidezza del tessuto cerebrale fetale, che si possono verificare durante la dissezione cervelli fetali in primi stadi embrionali. Qui vi mostriamo le tecniche visualizzati per affrontare tutte le sfide che coinvolgono microdissezione. Inoltre, poiché il sezionamento cervello fetale può anche essere impegnativo, abbiamo adottatouna tecnica che prevede l&#39;incorporamento il cervello del feto in gelatina con pelabile incorporamento stampi. Abbiamo avuto successo nel ridurre i cervelli fetali nelle sezioni fluttuanti a 50 micron di spessore. Questo ci permette di indagare eventuali alterazioni delle proteine ​​contenuti in sezioni di cervello fetale, compresa l&#39;individuazione di morte cellulare.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

Disegni sperimentali per indagare gli effetti dell&#39;esposizione prenatale durante le prime fasi embrionali in crescita del cervello del feto sono impegnative. Ciò è dovuto principalmente alla difficoltà di microdissezione dei cervelli fetali e loro sezionamento per la determinazione delle cellule apoptotiche causate dall&#39;esposizione prenatale all&#39;alcol. Gli esperimenti qui descritti fornire tecniche visualizzati da topi allevamento all&#39;identificazione della morte cellulare nel tessuto cerebrale fetale. Questo studio ha utilizzato C57BL / 6 topi come modello animale per studiare l&#39;esposizione fetale alcol e ruolo trofico peptide contro l&#39;apoptosi indotta da alcol. L&#39;allevamento costituita da una finestra stuoia 2-ore per determinare lo stadio esatto di età embrionale. Un modello di esposizione fetale alcolico stabilito è stato utilizzato in questo studio per determinare gli effetti dell&#39;esposizione prenatale dell&#39;alcool nel cervello fetale. Questo comporta il libero accesso a alcol o pair-fed diete liquide come unica fonte di nutrimento per i topi in gravidanza. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Le tecniche che coinvolgono la dissezione dei feti e microdissezione dei cervelli fetali sono descritti con cura, in quanto quest&#39;ultimo può essere impegnativo. Microdissezione richiede uno stereomicroscopio e ultra-pinza sottile. Procedure passo-passo per sezionare il cervello del feto sono forniti visivamente. I cervelli fetali sono sezionati dalla base del bulbo olfattivo primordium alla base del metencephalon. Per indagare l&#39;apoptosi, cervelli fetali vengono prima inseriti in gelatina con una buccia-away stampo per facilitare il loro sezionamento con un apparato vibratome. Cervelli fetali incorporati e fissati in paraformaldeide sono facilmente sezionato, e le sezioni fluttuanti possono essere montati in SuperFrost più vetrini per la determinazione di apoptosi o morte cellulare. TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminale deoxynucleotidyl transferasi) test è stato utilizzato per identificare la morte delle cellule o di cellule apoptotiche. È interessante notare che apoptosis e citotossicità cellulo-mediata sono caratterizzati dalla frammentazione del DNA. Così, le cellule TUNEL-positive visualizzati sono indicativi di morte cellulare o cellule apoptotiche. I disegni sperimentali qui forniscono informazioni circa l&#39;uso di una dieta liquida stabilito per studiare gli effetti di alcool e il ruolo dei peptidi neurotrofici durante la gravidanza, nel cervello del feto. Ciò comporta allevamento e di alimentazione topi in gravidanza, microdissecting cervelli fetali, e determinando l&#39;apoptosi. Insieme, queste tecniche visive e testuali potrebbero essere una fonte per indagare l&#39;esposizione prenatale di agenti nocivi nel cervello del feto.

I metodi sperimentali descritti mostrano che una finestra di riproduzione 2-HR è essenziale per stimare fase gestazionale accurata. Abbiamo dimostrato la dissezione degli embrioni, all&#39;età di E13. Abbiamo inoltre dimostrato microdissezione dei cervelli fetali a E13. La procedura comporta varie fasi (AC), come descritto in Figura 1. Cervelli fetali sono sezionati dalla base del bulbo olfattivo primordium alla base del metencephalon (Figura 1). Cervelli fetali vengono poi fissati in...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

I disegni sperimentali proposti qui concentrarsi sullo studio degli effetti dell&#39;esposizione alcol in apoptosi e l&#39;applicazione del peptide neurotrofico durante la gravidanza nel cervello del feto. Una descrizione dettagliata dall&#39;allevamento alla raccolta di cervelli fetali è descritto. Tecniche per la determinazione di apoptosi sono anche descritte in dettaglio.

Metodi sperimentali per testare gli effetti del peptide neurotrofico, ADNF-9, Contro L&#39;apoptosi indotta da alcol durante la gravidanza in topi C57BL / 6

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  University of Toledo. I disegni sperimentali proposti qui concentrarsi sullo studio degli effetti dell'esposizione alcol in apoptosi e l'applicazione del peptide neurotrofico durante la gravidanza nel cervello del feto. Una descrizione dettagliata dall'allevamento alla raccolta di cervelli fetali è descritto. Tecniche per la determinazione di apoptosi sono anche descritte in dettaglio.

Video: Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione del post-condizionamento acido contro l&#39;ischemia cerebrale

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

Piano sagittale cinematica Gait Analysis nei topi C57BL/6 sottoposti a MOG35-55 indotto encefalomielite Autoimmune Sperimentale

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasione del nervo corneale murino per l'induzione della cheratite neurotrofica

Paradigma dello stress sociale adolescenziale nei topi C57BL/6 per la ricerca comportamentale

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female rodents is needed to understand its effects on ongoing brain development and behavioral outcomes. The chronic social defeat stress paradigm (CSDS) has been widely used to model social stress in adult C57BL/6 male mice by leveraging on the aggressive behavior displayed by an adult male rodent to an intruder invading its territory. An advantage of this paradigm is that it allows to categorize defeated mice into resilient and susceptible groups based on their individual differences in social behavior 24 h after the last defeat session. Implementing this model in adolescent C57BL/6 mice has been challenging because adult or adolescent mice do not typically attack early adolescent male or female mice and because adolescence is a short period of life, encompassing discreet temporal windows of vulnerability. This limitation was overcome by adapting an accelerated version of the CSDS to be used for adolescent male and female mice. This 4-day stress paradigm with 2 physical attack sessions per day uses a C57BL/6 male adult to prime the CD-1 mouse for aggressiveness such that it readily attacks the male or female adolescent mouse. This model was termed accelerated social defeat stress (AcSD) for adolescent mice. Adolescent exposure to AcSD induces social avoidance 24 h later in both males and females, but only in a subset of defeated mice. This vulnerability occurs despite the number of attacks being consistent across sessions between resilient and susceptible groups. The AcSD model is short enough to allow exposure during discrete periods within adolescence, allows the segregation of mice according to the presence or absence of social avoidance behavior, and is the first model available to study social defeat stress in adolescent C57BL/6 female mice.

Autore in primo piano: Comprendere gli effetti delle avversità sociali degli adolescenti sullo sviluppo neurologico nei topi

We developed an accelerated social defeat stress model for adolescent C57BL/6 mice, which works in both males and females and allows exposure during discrete adolescent periods. Exposure to this model induces social avoidance, but only in a subset of defeated male and female mice.

Modello di stress di sconfitta sociale per topi maschi e femmine adolescenti C57BL / 6

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...