我々は、パラフィン切片を調製するための細胞分析とヘレン·ジョンソン（ワズワースセンター動物組織病理コア）を支援するためのRenjie·ソング（ウォッズワースセンターのフローサイトメトリーコア）に感謝。我々は、共焦点顕微鏡と画像収集の支援については博士リチャードA·コール（ウォッズワースセンター光顕微鏡コア）に感謝。我々は、アニメーションの支援についてはアンディベントレー（ウォッズワースセンターの写真とイラスト）承認したいと思います。 MDJは、ライフサイエンス研究財団、ハワードヒューズ医学研究所（HHMI）フェローシップでサポートされています。 SAはワズワースセンター·ヘルスリサーチ株式会社学内ポスドクでサポートされています。この作品は、NIHの助成HD061916とGM082978によって部分的にサポートされていました。

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会（動物実験委員会）のガイドラインに完全に準拠して処理した。 1。経口胃管栄養法<ol><li> 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択（任意）強制経口マウス系統。平滑末端給餌針（Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州）。配達ボリュームはマウス当たり400μlを超えないようにしてください。 </li></ol> 2。フローサイトメトリー用のPP細胞の単離<ol><li>制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）のガイドラインによると、CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールまたは手術前ベタジンで腹部を清める。胸郭の底から1.5cm約正中線に沿って始まり外科グレードのはさみを使用して、単一の（1cm）に切開を伴う標準的な開腹手術を行います。当たりを公開itoneal空洞と盲腸を識別します。回腸、盲腸の接合部に端子小腸を切り取ると優しくその全体が腸を削除します。それは腹膜腔から除去されるように腸組織を過度に伸ばすないように注意してください。 </li><li>湿ったペーパータオルやキムワイプのベッドの上で小腸を築く。組織の脱水を防ぐために、生理食塩水で軽く小腸を濡らす。視覚的に腸の抗腸間膜側（ 図1）の、其々のPPを識別します。一般的に、単一のマウスは均等に回腸（遠位）に十二指腸（近位）から配布される5から10目に見えるPPを持っています。平均して、4匹は23 PPをもたらすでしょう。 </li><li>湾曲した手術用のハサミ、優しく物品個々のPPを使用していて、冷たいハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中に置いてください。 注 、はさみだけでPPの上にカーブ側を上に配置する必要があり、その後穏やかに組織に適用される。消費税​​PPのみ（ないsurroundingの組織）と冷HBSSに転送されます。 注：前方に第2節では、この点から全てのインキュベーション及び遠心操作は°Cの細胞の生存を維持するために4で行われる必要があります。 </li><li> 37℃で15〜20分間、5 mlの脾臓解離ミディアムとインキュベートにPPを転送℃で精力的に250rpmで振とうしながら。長いインキュベーション時間がマイナスに細胞の生存に影響を与えます。 </li><li>滅菌（オートクレーブ）を70μmナイロンメッシュセルストレーナー上の単一の細胞懸濁液を、場所のPPを生成して、強制的に1ccの注射器からプランジャーのベースを使用してメッシュに組織を粉砕する。あるいは、サンドイッチ2すりガラス滅菌ガラス顕微鏡スライドの間にPPS（封筒でオートクレーブ）、穏やかに前後に運動と組織を挽く。 5ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を転送するために滅菌ピペットを使用しています。 </li><li>細胞懸濁液に最終濃度1mMとなるようにEDTAを追加します。用ロッカーでインキュベート室温で5分間。 </li><li>残りの細胞凝集塊または組織片を除去するための第270μmのセルストレーナーを通してデカント細胞懸濁液。 15または50 mlコニカルチューブに細胞を回収する。 </li><li>穏やかに遠心（500×gで5分）の対象セル。 1％ウシ胎児血清（FCS）を含む生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝化されているフロー·バッファ内の上清をデカントして細胞を懸濁。 </li><li>細胞数と生存率を決定するために、トリパンブルーに1時10細胞を希釈し、視覚的に光学顕微鏡と血球計数器を用いて細胞を検査します。代わりに、伯爵セルカウンター（Invitrogen社）または類似の測定器を自動的に細胞数と生存率を列挙するために使用することができます。 PPは20から25で始まる、このプロトコルは&gt; 2.5×10 6総細胞が得られるはずです。これは、マウスあたり約0.8から1.2×10 6個の細胞に相当します。 </li></ol>フローサイトメトリー用の細胞の抗体ラベリング &lt;オールスタート= &quot;11&quot;&gt; <li> 96ウェル丸底プレートのウェルに細胞（ウェル当たり10 5）を分注します。 </li><li>穏やかな遠心分離（1,000×gで5分）、ゆっくりと反転板で上清をデカントの対象とプレート。 </li><li>のFcブロックバッファーに細胞を再懸濁し、氷上で15分間インキュベートする。市販のFcブロックバッファの数（ 例えばラット抗マウスCD16/CD32、BD Biosciences社）がありますが、我々は、単にマウスに対するモノクローナルIgG 1を分泌ラットB細胞ハイブリドーマ（ATCC 2.4.G2）から使用済み培地を使用このステップのためのFcγ受容体。 </li><li>静かに転倒板で上記のように穏やかに遠心（1,000×gで5分間）、上清をデカントの対象とプレート。 </li><li>所望の希釈で細胞懸濁液に直接蛍光色素標識抗体を追加して、連続的な揺らしながら氷上で30分間インキュベートする。 </li><li>件名穏やかに遠心（1,000×gで5分間）にプレートし、デカント静かに転倒板による上澄み。 </li><li>フローバッファー100μlで細胞を洗浄します。 </li><li>静かに転倒プレートで5分、そして上清をデカントし、1,000×gでプレートを遠心分離する。 </li><li>フローバッファー300μlとPHEM緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド（60mMのPIPES、25mMのHEPES、10mMのEGTA、pH6で4mMのMgCl 2）を100μlから成り再懸濁し、細胞を400μl固定バッファ、。 </li><li> FACSキャリバーまたは同等品を使用したフローサイトメトリーの対象となる細胞。セルクエストプロソフトウェアバージョン5.2を使用して結果を分析します。 </li></ol> 3。 PPの凍結切片の作製<ol><li>組織採取に先立ち、7x7x5ミリメートルプラスチック基金型に最適切断温度（OCT）の化合物を追加します。また、デュワーや氷のバケット内の液体窒素（&gt; 750ミリリットル）のプールを用意しております。 </li><li>マウスを安楽死させると上記のように、laparotamyを実行します。湿ったペーパータオルの上で腸と場所を削除します。 </li><li>へcyrosectioning用のPPを分離し、PBSを含むペトリ皿に単一PPと伝達組織を含む小腸の0.5センチメートル横セグメントをカットします。優しく不要な糞破片を除去するためにPBSでこれらのセグメントの内腔を洗浄してください。 </li><li>垂直に10月を含むベース金型内腸組織セグメントを配置します。液体窒素中で金型を浸し、組織を完全に止めることができるように（1〜2分）。組織が完全に凍結しているときに10月の色は透明から白色に変わります。 。より緩やかな冷却（ 例えば 10月の割れ低減する）ために、液体窒素で冷却したイソペンタンの蒸気槽に浸す型注意：液体窒素を扱うときに、適切な安全ゴーグルを着用する。 </li><li>ピンセットを用いて液体窒素から凍結ベース金型を外し、金型は10月ブロックのエッジが柔らかくできるようにするために必要な時間だけ、室温（約10から15秒）で温めることができます。その時から10月の冷凍ブロックを削除するには金型は、金型を反転させ、アルミ箔のきれいな4×4cmの部分にブロックを取り出すときに背中を軽く押してください。直ちに液体窒素やドライアイス上に格納されているラベルの付いた標本袋に箔と場所にティッシュを包む。あるいは、（&lt;-20℃）の冷凍庫に組織を移す。週間以内に、組織を使用、それ以外のブロックは、年齢とともにもろく​​なります。 </li></ol>凍結セクショニング<ol start="6"><li>凍結切片ライカCM3050S cryomicrotomeまたは同等品を使用して組織を。クライオスタット上のチャンバー温度-21に設定する必要があり℃に</li><li>厚さが12から14ミクロンであるセクションに努めています。 </li><li>フィッシャーSuperFrostプラス（または同等品）ガラス顕微鏡スライド上のセクションを収集し、標準的な低消費電力の光顕微鏡を用いて視覚的に検査する。複数のセクションをスライド上に収集されている場合は、それらが下流染色アプリケーションのために一緒にクラスタ化されていることを確認してください。 </li><li>ストアトン彼は理想的には、スライドボックスに室温でスライドして、数日以内にそれらを使用しています。 </li></ol>凍結切片および共焦点顕微鏡分析の抗体標識<ol start="10"><li> 2分間組織染色jarまたはラック内のアセトンに浸しスライド（またはメタノール）。長時間のインキュベーションは、スライドからデタッチする組織を引き起こす可能性があります。 </li><li>新しい染色瓶にスライドを移し、3分間ずつ、PBS-T（0.05％Tween-20を含む1×PBS）で3回洗浄する。 </li><li> ImmEdge疎水性ペンでセクションを取り囲んでいます。これは、試薬および抗体はインキュベーションの間にその区域に限定されたままであることが保証されます。 </li><li>光から保護加湿チャンバー内で37℃で30分間ブロックバッファのスライド（PBS中2％ヤギ血清）をインキュベートする。 </li><li> 37℃で10分に対するFcブロックバッファ（上記参照）を使用してスライドをインキュベート</li><li> PBS-Tとキムワイプまたは他の吸収性組織を使用してセクションの周りの乾燥した場所にスライドを浸します。実際の組織切片を触れないように注意してください。 </li><li> 37℃で30分間加湿チャンバー内のCのための一次抗体溶液とインキュベートするオーバーレイ組織切片。一次抗体は、典型的には、20μg/ mlの最終濃度になるようにブロックバッファー中に希釈されています。最大3つの抗体は、この段階で直接結合することができるため、直接標識一次抗体の使用は、望ましいです。直接標識された抗体はまた、追加の抗体インキュベーション工程の必要性を排除します。 </li><li>洗浄はPBS中に浸漬することにより3回（各5分間）をスライドします。 </li><li>もし水分チャンバー内で37℃で30分間、関連する二次抗体を用いて、必要に応じて、インキュベートスライド。 </li><li>洗浄はPBS中に浸漬することにより3回（各5分間）をスライドします。 </li><li>上記のようにPHEMの緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド中で4分間スライドをインキュベートする。 </li><li> 1分間PBSでスライドを洗浄します。 </li><li>キムワイプまたは吸収する他のを使用してセクションの周りにドライエリア耳鼻咽喉科組織。実際の組織切片を触れないように注意してください。ピペットやスポイトを使って、優しくセクションに直接メディアをマウント延長ゴールドのドロップを置きます。気泡がないように注意しながら取り付け媒体上にカバーガラスを適用します。余分な封入剤を吸収するあぶらとり紙を使用しています。 </li><li>商業マニキュアと顕微鏡スライドにカバースリップを密封し、空気乾燥することができます。 </li><li>ライカTCS SP5または同等の共焦点顕微鏡を用いてスライドを表示します。 </li></ol>

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	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱で?...

パイエル板（PPS）は、ヒトおよびマウスの小腸（ 図1）を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮（FAE）によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム（SED）の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 + T細胞は5月9日と混ざり樹状細胞（DC）のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞（FDCS）とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 +エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。 PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部を構成することを考えると、大変な作業です。この環境における細胞の in vitro での特性評価で支援するために、我々は、フローサイトメトリーおよび機能解析だけでなく、免疫蛍光顕微鏡および免疫組織学のための凍結切片を調製するためのPPのプロトコルのために全マウスのPP細胞を調製するためのプロトコルを提供する。覚書の分離、特性評価、および免疫染色のために、我々のプロトコル電子PPの細胞は、これらの技術を5,6,9-11を引用し 、25年以上さかのぼる多くの参照があるという事実によって証明されるように、 それ自体は小説ではありません。むしろ、我々のプロトコルは、初めてPPを集める研究者のための合理化された（とビジュアル）メソッドを提供します。私たちが説明する技術を容易に習得し、容易に&gt; 90％の細胞の生存率を持つ細胞を大量に産出されています。凍結セクショニングプロトコルは、理想的には、免疫蛍光染色し、共焦点イメージングに適した再現性の高い連続切片が得られます。さらに、我々のプロトコルは、2つの他の最近のJoveの記事を補完します。最初は、福田らは、12のPP M細胞による病原細菌の取り込みを評価するためにライゲート回腸ループアッセイの使用について説明します。もう一つは、Geemらによる、マウスの腸粘膜からの樹状細胞やマクロファージの単離および特性を説明していますが、明示的に分析13からPPを除外。

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 会社 </td><td> 猫。 ＃ </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> OCTコンパウンド</td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mmベース金型</td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdgeペン</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrostプラススラ​​イド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td>エッジ儀式ブレイド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスのCD11c-PE </td><td> eBioscience社</td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD19-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><tD&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td>脾臓解離ミディアム</td><td>電池技術を食い止める</td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FCブロック</td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td>細胞株から得られた2.4.G2 Supes </td></tr><tr><td>湾曲したシザー</td><td> FST </td><td> 14061から09 </td><td></td></tr><tr><td>低温保持装置</td><td>ライカ</td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACSソウルキャリバー</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td>伯爵セルカウンター</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td&gt; <td>リチャード·アラン</td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>リチャード·アラン</td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td> Starplex科学</td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1本研究で使用した試薬および装置。 </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

パイエル板（PPS）は腸管関連リンパ組織（GALT）の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング（FAE）と樹状細胞（DC）、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、（i）単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、（ii）の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS（4匹から）以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、&gt; 90％の細胞生存率&gt; 2.5×10 6細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度（OCT）培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片（5-12μm）は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80％以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱（FSC）、高細胞容積の指標、および低側方散乱（SSC）が、低い細胞粒度（ 図2A）のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に（代わりPHEMのPBSプラス1％FCSを含?...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K ビュー.  New York State Department of Health. パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

ビデオ: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

免疫・感染学

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...