1。テロメアの長さプロトコル19 <ol><li> DNA単離法</li></ol>ほとんどのDNAの単離方法を用いることができる。私たちの研究室は、血液ソースのキアゲンDNeasyキット（＃69506）を好む。例えば口腔または他のソースとして、DNAの供給源に応じて、異なる分離法を用いることができる。 <ol start="2"><li>プライマー： </li></ol>必要になるまで全てのプライマーは、PCRグレード水に100pmoles/μlのストック濃度に希釈し、-20℃で保存されています。プライマーのワーキング株式は新鮮な作られており、20℃で保存する短期間（数ヶ月）のためのCの標準的なプライマーは、キャラハンらで説明したように、SCG、テロメアとβ-グロビンのために使用された20は、 。 プライマー配列： Telo 1：5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2：5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1：5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2：5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; 注：プライマーは10pmoles/μlの作業濃度、反応前のミックスに追加するに希釈されています。 <ol start="3"><li>ゲノムDNAの段階希釈： </li></ol> TeloためのゲノムDNAおよびシングルコピー遺伝子（SCG）の連続希釈アッセイのための標準的なCT値曲線を生成するために作成されます。使用されるゲノムDNAは、血液サンプル由来のリンパ球から抽出した。これらの希釈物を同じゲノムDNAを用いた段階希釈の二組を生成するために1.68の係数で各濃度にPCRグレードH 2 0でDNAを希釈することによって作成される。出発濃度は、試行錯誤に基づいて最適化されており、異なる試薬、器具、他の種由来のDNA、細胞タイプ、および使用さSCGを使用するときに調整する必要があるかもしれません。 注：ゲノムDNAを用いて連続希釈を穏やかに混合し、1時間のbefoに少なくとも15分間待つことによって作られている次の希釈にDNAを取って再。各希釈は解離するゲノムDNAのための時間を必要とします。長期保存、-80℃で保管するためのPCRストリップにアリコート段階希釈℃で各PCRストリップを解凍し、DNAを損傷する恐れがあり、凍結融解サイクルを避けるために、一度使用されている。 <ol start="4"><li> RT-PCRの反応セットアップ</li></ol>使用楽器：Roche480ライトサイクラー試薬：ロシュライトサイクラーSYBRグリーン 10 ng /μLの最終濃度を試験DNAサンプルを希釈する。私たちは、ナノドロップまたは量子ビットを用いた濃度をテストします。我々はさらに10ng/μlから最終5ng/μlにDNAを希釈。我々は再び集中をテストしていない。 反応成分： <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ TD&gt; <td> 6μL </td><td> H20 </td><td> 6μL </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0.2μL </td><td> SCG 1 </td><td> 0.6μL </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8μL </td><td> SCG 2 </td><td> 1.4μL </td></tr><tr><td> RXNミックス</td><td> 10μlの</td><td> RXNミックス</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> DNAまたはシリアル希釈</td><td> 2μlの</td><td> DNAまたはシリアル希釈</td><td> 2μlの</td></tr></tbody></table> 注：マスターミックスは、DNAなしで、5％〜10％を超えるとなる。 TeloとSCGの両方が次のプログラムを使用して、同じプレート上で同時に実行されています。精度をテストするには、少なくとも3つの各サンプルの複製および制御が実行されるべきである。使用したプライマーのばらつきが結果に影響を与えることができる。 Roche480ライトサイクラーと私たちのプライマーで、次のように我々のプロトコルが動作するように最適化されています。 でitial変性 10分間変性95℃ サイクリング 95℃で10秒保持 60°C 5秒間ホールド 72℃11秒のホールドとシングル買収 必要に応じて45から55回繰り返します 2。定量テロメラーゼ検出（QTD）プロトコル（アライドバイオ社カタログ番号MT3012によってQTDキットに基づく） 準備を抽出<ol><li>ペレットは、細胞または組織。 </li><li> 1×PBSで1回洗浄します。 </li><li> Repelletと削除1X PBS。* </li><li>ごとに10 5〜10 6細胞または組織の40-100 mgのための1つのxの溶解緩衝液200μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間12,000 xgでサンプルをスピンダウン</li><li>新鮮なチューブに上清160μlのを転送し、タンパク質濃度を決定する。 </li><li>アリコートとクイック·フリーズドライアイス/エタノールの残りのエキス、-80℃で保存</li></ol> T中*彼の状態は、凍結細胞または組織におけるテロメラーゼは、少なくとも1年間は安定です。使用するために解凍すると、1×溶解緩衝液中、直ちに細胞を再懸濁します。 2.1。アッセイコントロール熱不活性化制御：各サンプルについて、事前のテロメラーゼ活性アッセイに10分間85℃でインキュベートすることにより、追加の制御エキスを扱う加熱。 TSRコントロールテンプレートの標準曲線：標準の曲線を生成するキットに含まれているテロメアプライマーと同様に配列にTSR、オリゴヌクレオチドの希釈液を用いた定量的リアルタイムPCRを行います。 <ol><li>溶解緩衝液で在庫TSR濃度の1時05分の段階希釈（0.5 amoles /μL）を準備</li><li>ストック濃度を含​​め、各TSR希釈液1μlを用いたテロメラーゼ検出標準アッセイを行う。これらの希釈物を、少なくとも2週間、4℃で保存することができる。 </li></ol> 2.2。テロメラーゼ活性アッセイQTDリアルタイムPCR使用<ol><li>各サンプルについて、PCRチューブまたは薄肉PCRプレート（総量25.0μL）に以下を追加します。 <ul><li> 2×QTDプレミックスの12.5μlの</li><li>細胞または組織抽出物の1.0μL </li><li> PCR修飾水11.5μL </li></ul></li><li>徹底的にミックス</li><li>次のプログラムに係るプログラムのリアルタイムPCR検出システム。 - 25℃で20分（テロメラーゼ反応）のための - 10分（PCR初期活性化ステップ）、95°C の35〜40サイクル： - 95℃で30秒間（変性） - 60℃で30秒間（アニーリング） - 72℃で30秒間（拡張子） </li><li>サーマルサイクラーでPCRチューブをセットし、サイクリングプログラムをスタートする。 </li><li>サイクル終了後の閾値サイクルまたはC T値を収集します。閾値サイクルは、ΔRnが統計的に有意な増加が最初に検出されるサイクルである。 </li></ol> 2.3。データ解析<ol><li> GeneratEA標準曲線はC Tの測定値を使用し、テロメラーゼ活性を比較します。 </li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

テロメアの長さはストレスや老化細胞を研究するためのユニークな細胞のマーカーを提供し、老化のメカニズムについての洞察を提供しています。高齢化におけるその役割が最初に示唆されていたので、研究の多くは、年齢にテロメアの長さ、長寿、加齢に伴う疾患、癌、ストレスに関連行われている。何十年もの間、テロメアの長さ測定のゴールドスタンダードは、サザンハイブリダイゼ?...

テロメアは染色体の末端にあり、DNA量体（TTAGGG）のシーケンスを繰り返している。各セルの複製では、これらの染色体の端部が短くなる。彼らはあまりにも短くなった場合、染色体テロメア末端融合、異常再結合、および劣化を受けることができる。したがって、十分なテロメア長の維持は、染色体の安定性および細胞保護38において主要な役割を果たしている。 DNA複製が染色体1-2の非常に最後まで続けることができないため、テロメアの長さのメンテナンスは、染色体の末端の近くで見つけた遺伝子のためにも重要です。これにより、テロメアの短縮の防止は、細胞の安定性を改善することができる。 多くの研究では、テロメアの長さは、このような3-4癌、糖尿病5、および心血管疾患6,7のように、生物の寿命や病気の状態と相関していることを報告している。さらに、短縮テロメアは過度のストレスやと関連しているおそらく時期尚早細胞老化と死9を促進することにより不健康なライフスタイル8、。一方、いくつかの研究は、疾患39、40、41に関連テロメアの長さと寿命と年齢との間に有意差がないことを見出した。 テロメアの短縮からの保護の細胞の生来のメカニズムの一つは、独自の酵素テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）を活性化することによるものである。この酵素とそのサブユニット、テロメラーゼRNA（TERC）、非コードRNA、染色体へのテロメア反復を追加するためのテンプレートとしてテロメアを使うには、10を終了します。テロメラーゼ活性は、細胞やその他のメカニズムのいくつかのタイプには存在しないが、テロメア長の維持に関与している、テロメラーゼ活性の増加は、テロメアの長さの増加と相関している。テロメラーゼ活性化は、細胞が損傷やストレスに応答し、早期老化および死を回避するメカニズムの一つとして確立されている。例えば、長いテlomeresは例外的な寿命11とアシュケナジユダヤ人集団において実証された、TERCまたはTERTにおける突然変異は、加齢に伴う疾患13に影響を及ぼすことが示されている致命的な疾患12、及びテロメラーゼのエピジェネティック制御に寄与することが示されている。その発見以来、テロメアの長さは、様々な動物モデルで同様にヒトの健康状態のためのバイオマーカーとして提案されているが、使用方法は、退屈な長いと高価だったので、これらの初期の研究は広く再現することは困難であったされています。 2002年と、さらに2009年にはチューニングでは、Cawthonが提案とテロメアの長さを評価し、さらに老化や病気19、細胞生物学の様々な側面での役割を調査するための新しい、正確、迅速かつ簡単PCRベースのプロトコルを示した。 研究のために正しいテロメア測定方法を選択することが不可欠です。現在、テロメアの長さを測定するために使用される様々な方法が、それぞれに独自のがあります長所と短所。 ：伝統的に、テロメアの長さを含む末端制限断片（TRFs）のサザンブロット分析を用いて測定される。 B、​​TRFsを得るためにテロメア繰り返しでカットしない制限酵素でDNAを消化。これらTRFsのサザンブロットは、テロメアプローブ14、37を使用して、平均TRFの長さを決定することによって行われます。この方法は、変動係数が小さいと非常に正確であるが、直接の尺度であり、長さ分布を測定するために有利であり得る、TRF分析は、高価で労働集約的であり、DNAの少なくとも3μgのを必要とする。この方法は、短いテロメアと長さの決定に鈍感であること（TTAGGG）nは、彼らは15、42が含まれているシーケンスのような原因で、プローブにより検出することができサブテロメアDNAによって混乱することができます。 テロメアの長さを測定する際、別の非常に正確な方法は、シングルテロメア伸長の長さの分析（STELA）、SINGLですDNAのみの少量を必要とする電子分子PCRに基づく方法。この方法では、プライマーは、染色体の末端にG-リッチオーバーハングを認識し、特定の染色体のテロメアを増幅1染色体上に独特なテロメア配列に結合するようになされる。得られた増幅は、その後、サザンブロットによって可視化される。この方法は、非常に正確であるという利点を有しており、短いテロメア16外れ値を検出することができる。すべてではない染色体がG-豊富な端を持っていると使用可能なサブテロメアシーケンス以来、残念ながら、テロメアの長さは、特定の染色体上に測定することができ、これらの測定は、セル15内のすべてのテロメアの長さを表していない可能性があります。 行われている別の方法は、テロメアの長さを検出するペプチド核酸（PNA）プローブの使用である。 in situハイブリダイゼーションの定量蛍光（Q-FISH）は、私たちがST中期、時のテロメアを視覚化することができますその大きさに比例してPNAプローブとテロメアのaining、特定の染色体間のテロメアの比較を可能にします。この方法はまた間期における細胞のために使用することができるが、ここに明確な染色体のテロメアの長さのために、17老化又はまれに分裂細胞のテロメアの長さを測定する際の制限を導入し、これを検出することができない。フローFISHはなく、フローサイトメトリーを使用しており、現在は臨床の現場で血液細胞のテロメアの長さを測定するための最も感度の高い方法ですが、高度に熟練した技術者が18必要です。 現在、私たちの研究室で平均テロメアの長さを測定するための標準的な方法は、精度の感度を活用し、定量リアルタイムPCRやす。この方法は、他のように製造されたであろうプライマーダイマーに由来する生成物の合成を回避する新規なプライマーの開発によってテロメアの長さを測定するために可能になったテロメアの繰り返し性質に起因tandardアッセイ。このアッセイのために、テロメア長の測​​定は、単一コピー遺伝子数にT / S比は、テロメアリピートコピー数で表される。 PCRの開始段階でテロメアの長さとDNAに結合する標識されたテロメアプライマーの数との間の直接的な比例関係があるので、T / S比は、テロメアの長さに正比例する。 T / S比は、Ctは、試料を蛍光はテロメアプライマーおよびプライマーSCG 19と試料との間に、ベースライン蛍光上記のいくつかの標準偏差であるしきい値を超えて蓄積れる小数サイクル数の差を比較することによって測定される。この方法は、染色体の重複またはコピー数の変化15の場合には、不正確な測定につながる可能性テロメアの長さの、その間接的な測定は、例えばのために批判されている。また、研究間の比較では、多くの場合、ジですfficultが、標準的なオリゴマーは、絶対的なテロメアの長さ20を測定するために開発されてきた。この方法は、モノクロマルチプレックス定量PCRアッセイを用いて、Cawthonによって時改善進めたた。このアッセイでは、PCRは、プライマー二量体の結合を避けるために、最初の数サイクルの間、より低い温度で実行され、テロメア及び制御遺伝子がさらにエラーを回避するために同一のPCRチューブ中で分析した。得られたテロメア長の測定は非常TRFsのサザンブロット分析によって測定テロメアの長さと相関し、より高精度15、19、36であった。現時点では、定量RT-PCRは、大きなサンプルサイズをテストするために使用できる唯一の​​便利な方法であり、唯一の遂行するために少量のDNAを必要とします。この方法の重要な部分は、それが正しく行われている場合に、この方法は、テロメアの長さに関する貴重な比較情報を提供することができるように、包括的な品質管理対策である。さらに、この方法は、測定用白血球を超えての使用に適合された異なる組織の様々な42でテロメアの長さ。 さらに、さらにテロメア長の維持と対向する2つの効果（テロメラーゼ酵素による複製および伸長の間すなわちテロメア短縮）との間の相互作用の背後にある生物学を理解するために、私たちは、テロメラーゼ活性を測定し、追加のアッセイとテロメアの長さの方法を伴う。 この目的のために、我々は、テロメアリピート増幅プロトコールにおいて、in vitroアッセイを使用した。簡単に言えば、溶解、保存、酵素的に活性な細胞がテロメラーゼを用いたオリゴヌクレオチドを​​基板上にテロメア反復を合成し、製品はSYBRグリーンの存在下でPCRを用いて増幅した。結果は、試料および対照のCtのしきい値を比較することによって分析した。テロメラーゼは、熱に敏感な酵素であるため、追加の熱制御治療を各試料21と一緒に実行されます。 <p class=&quot;jove_content&quot;&gt;テロメアの長さを測定すると、老化や疾患の病態生理におけるテロメア長の可能な役割に貴重な洞察を提供することができますが、テロメアの長さは、静的プロパティではなく、多くの情報がテロメアの機能を理解するのに必要です。テロメラーゼ活性の研究は、テロメア長の調節機構に関する情報を追加することができる。例えば、テロメラーゼの活性化が制御されたテロメアの長さと細胞増殖を維持することができるが、テロメラーゼの制御されない活性化は、癌になる可能性があります。組み合わせたこれら二つの安価で、まっすぐ進む方法はテロメアの長さと細胞の安定性との関係に向けた強力な証拠はなく、テロメアの短縮と復旧の可能なメカニズムにさらなる洞察力だけではなく私たちを提供した。これらの方法で、私たちはさらに、中央mechanisのより良い理解の究極の目標で老化や細胞増殖のさまざまな状態への細胞の応答を解明したいと考えて細胞生物学のMS。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

テロメアは、先端にDNA配列を繰り返している長さおよび人間が15,000塩基対の長さに達することができるで多様である染色体終了する。テロメアは、それぞれの細胞分裂における染色体の消耗のbioprotectiveメカニズムとして機能します。一定の長さでは、テロメアは、染色体の不安定性や細胞死につながる可能性があり、プロセスの複製を可能にするには余りにも短くなる。摩滅および伸び：テロメアの長さは、2つの対向する機構によって調節される。それぞれの細胞が分裂するように消耗が発生します。対照的に、伸びは染色体の末端に繰り返し配列を付加する酵素テロメラーゼによって部分的に変調される。この方法では、テロメラーゼは、おそらくエージングメカニズムを逆転し、細胞生存率を活性化させることができる。これらは、電池寿命を維持する上で不可欠な要素であり、細胞の老化を評価するために使用される。本稿で我々は、複数の組織ではテロメアの長さを評価するため、正確な短い、洗練された安価な方法を説明するsと種。この方法は、2つの主要な要素、テロメア配列のタンデムリピート及び試験した試料の差コピー数を検出する定量RT-PCRの感度を利用しています。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単​​なアッセイについて説明する。

テロメアの長さ定量RT-PCRアッセイの例を図1に示されている。左上のパネルで、赤と緑でラベルサンプルは、96ウェルプレート上でテストされた被写体の位置を表しています。右上のパネルでは、増幅曲線が示されています。各被験者は、三重で行われる2つのアッセイ（テロメアとシングルコピー遺伝子）によってテストされています。選択された個体の2つのアッセイで製造異な...

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Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

、正確な短い、洗練された安価な方法は、定量RT-PCRを使用して、複数の組織や種のテロメアの長さを評価することが記載されている。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単​​なアッセイについて説明する。

テロメア長とテロメラーゼ活性、細胞の老化の陰陽

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

生物学

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

ECIS /タクシーと細胞走化性の測定

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

プロトタイプ小型化フローサイトメーターおよびコンパニオンマイクロ流体混合技術の縮小重力環境ハードウェアデモンストレーション

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関<em&gt; KCNJ10</em&gt;（Kir4.1）

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

シングルプローブの応用：周囲条件下での質量分析イメージングと単一細胞解析

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

解剖やイトヨ鰓スケルトンのフラットマウント

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

誘導および定量化細胞老化するテクニック

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...