我々は、DNAスクリーニングライブラリの調製のためのMGHのDNAコアのジョンDargaに感謝します。パーキンエルマーのクリストファーChigasは、私たちのワラック1420ルミノメーターのための貴重な支援を提供した。スティーブンCiaccoとAgilentのマーティン·トーメはブラボーロボットのためのサポートを提供した。我々は寛大に自分のデュアルグロールシフェラーゼアッセイプロトコルを提供するためのNIHのロン·ジョンソンとスティーブタイタスに感謝します。

実験概要については、 図1を参照してください。 1。α-シヌクレインプロモーターを含むレポータープラスミドを準備 α-シヌクレイン遺伝子（ 図2）の調節要素は、上流NACP（アミロイドペプチドの非ベータ成分）ジヌクレオチド反復配列1,2からのイントロン2〜3を、約10キロバイトに及ぶ。私たちは、この地域の一部を含む私たちのレポーター構築。私たちは、成長のために必要な特別な手順2イントロンを含むプラスミドは、下記のとおりことがわかった。ルシフェラーゼプラスミド、pGL4.10およびpGL4.75（ 図3）は 、Promega社から市販されており、従来の分子生物学プロトコルを用いて増殖させることができる。 <ol><li> 表1の配合表および表2のプライマーを用いて別々のPCRにおけるα-シヌクレインプロモーターの2成分を増幅する。 </li><li>ベリTE（トリス-EDTA）50μlに溶離をQiaquick PCR精製キット（Qiagen）を用いてアガロースゲル上できれいなfyのPCR産物。将来の使用のために-20℃で溶出した0.9kbのフラグメントを格納します。 </li><li> SacIとXhoIで、全体の3.4キロバイトPCR断片の量だけでなく、pGL4.105μgのダイジェスト。子牛腸アルカリホスファターゼ（Roche）を、ベクターを治療し、ゲルがPureLinkクイックゲル抽出キット（Invitrogen）を用いて浄化する。 </li><li> T4 DNAリガーゼ（NEB）を用いて断片とベクターを連結する。 10μlのTE緩衝液に溶出して、PureLink PCRのマイクロキット（Invitrogen）を用いて完了した反応を清掃してください。 </li><li> ELECTROMAX Stbl4テント​​セル（Invitrogen）を20μLに洗浄、ライゲーション反応の2液を変換し、メーカーの指示に従って、エレクトロポレーション。 90分間、225 rpmで30℃のインキュベーター中で振盪する。 100 mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上で2ボリュームを広げ、2日間30℃でインキュベートする。 </li><li>つまようじを使用して、結核の2ミリリットル（テリフィックブロス）への接種のための4-6の小さなコロニーを選択します。 30℃で振とうのO / Nでこれらのミニプレップの文化を育てる</li><li> PureLink HiPureプラスミドミニプレップキット（Invitrogen）を用いて、各ミニプレップ培養物を1.5mlからプラスミドDNAを精製する。 </li><li> BamHIでミニプレップを消化し、アガロースゲル上で電気泳動。正しいクローンは2.8キロバイトと4.9 KBのフラグメントを生成する必要があります。 </li><li>新しいLB（ルリアブロス）プレート上の正しいクローンから、残りのミニプレップ文化をRestreakし、2日間30℃で成長する。 </li><li>小さなコロニーを選択し、1.5ミリリットルのTBスターター培養を接種する。 30℃でO / Nを振るスターター文化が飽和状態に成長させてください。 </li><li>温めておいた結核の150ミリリットルに全体のスターターカルチャーを希釈し、2日間、30℃で振る。次のステップに進む前に、クローンはreplicati中に変異していないことを確認するために、追加のミニプレップおよび消化のために、この文化の1.5ミリリットルを使用<html>上。 </li><li> PureLink HiPureプラスミドマキシプレップキット（Invitrogen）を用いて、残りの培養物からプラスミドDNAを精製する。この中間体プラスミドの期待利回りは、文化の150ミリリットルあたり50〜150μgのです。 </li><li>ステップ1.2で凍結し0.9kbのフラグメントを解凍する。 1.3〜1.12のKpnIおよびSacIで消化する代わりに、中間プラスミドに0.9kbの断片をクローン化するための手順を繰り返します。ライゲーション、形質転換、選択、および上記のように大量調製（Maxiprep）のために成長する。 BamHIで消化は5.8キロバイトと2.8 KBのフラグメントが得られるはずです。これは、スクリーンに使用されるプラスミドである。 </li></ol> 2。スクリーニングのための293T細胞、レポータープラスミド、およびライブラリーDNAを準備 293T細胞は、最初の96ウェルプレートに播種し、翌日、トランスフェクトされる。レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを96ウェルプレートに希釈する。私たちは、マサチューセッツ総合病院（でDNAコアからトランスフェクショングレードのライブラリーDNAのプレートを得た= &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu）を取得します。このプロトコルは、293T細胞の2の同一のプレート（ 図1）に単一のライブラリ版をトランスフェクトし、細胞のこのよう2プレートは、スクリーニングされる各ライブラリのプレートのために播種する必要があります。 注：これらは、ルシフェラーゼアッセイに干渉し、それぞれ、トランスフェクションの際に毒性を高めるように、フェノールレッドや抗生物質を含まない培地中の細胞を成長させる。 <ol><li>各ライブラリープレートは、14％FBSを含有するDMEM中1.5×10 5細胞/ mlの濃度まで再懸濁し、トリプシン処理293T細胞をスクリーニングするために。無菌貯水池（アキシジェン）に注ぐ。 </li><li>貯水池、2透明底、96ウェルプレート（Corning）、ロボットデッキ上のフィルターピペットチップ（アジレント）のボックスを配置します。ウェル当たり1.5×10 4細胞の密度のため、両プレートの各ウェルに細胞100μlを分注する。 </li><li>等しい確実にするために低いランプ速度を用いて、2分間50×gで細胞プレートを遠心分離する各ウェルを通して細胞密度。 37℃でインキュベートし、10％CO 2 O / N. </li><li>無血清培地中で5 NG /μlにホタルおよびウミシイタケレポータープラスミドを希釈する。 15ミリリットルコニカルチューブに（容量）ホタルウミプラスミドを5:3の割合で希釈液を兼ね備えています。 </li><li>ピペットで各ウェルに、ライブラリプレートあたり17μLに加え、2月10日μL過剰を分配する96ウェルプレートの各ウェルに結合したプラスミドは、。 </li><li>上記のようにトランスフェクショングレードのDNAライブラリープレートを取得し、エンドトキシンフリー水で13.3 NG /μlに希釈する。ウェルあたり最小容積は28μLである必要があります。 </li></ol> 3。トランスフェクションを行います画面の2日目に、レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを293T細胞にトランスフェクトする。 <ol><li>各ライブラリのプレートには、ポリスチレンチューブに4.3ミリリットルの無血清培地（午前1時40希釈）を用いてRT Optifect（Invitrogen）を107.5μLをミックス。 RTで5分間インキュベートし、そしてN 96ウェル、ポリスチレンV底プレート（グライナー）の各ウェルに（ライブラリープレートあたり）44μLを分注する。 </li><li>希釈Optifectのプレート、レポータープラスミド（ステップ2.5）、ライブラリのDNA（ステップ2.6）、およびロボットデッキにピペットチップの箱を置きます。 </li><li>各吸引の間に5μlのエアギャップを挿入して吸引除去するレポータープラスミドの17μlの希釈Optifectの43μL、およびライブラリーDNAの26μL、。ライブラリーDNAは、交差汚染を防止するために、最後に吸引されるべきである。新しいポリスチレンV底プレートにヒントの内容を分配する、ミックス、カバー、および脂質/ DNA複合体を形成することができるように、20分のために確保さ。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、ピペットチップとライブラリプレートを交換し、繰り返してください。 </li><li> Optifect / DNA混合プレートを明らかにし、293T細胞の2プレートをロボットデッキの上に置きます。 DNA混合物を、ゆっくりと、細胞の各プレートに40μLを分注：Optifectの80μlを、ピペットチップの単一のボックスを吸引使用。トランスの場合複数のライブラリ版をfecting、すべてOptifectためリピート：DNAプレート。セルをカバー。 </li><li> 30分間1200×gで細胞プレートを遠心分離する。カバーし、インキュベーターに戻す。 </li><li> 4-6時間のために細胞をインキュベートします。このインキュベーションの間、各トランスフェクトライブラリ版のため、10％FBSおよび10μg/ mlのシプロフロキサシン（CELLGRO）を含む12ミリリットルのDMEMを混合することにより、新鮮な培地を準備。無菌リザーバに新鮮な培地を注ぐ。 </li><li>ロボットデッキに2ロボット先端の箱、細胞の単板、新鮮な培地を含む容器、および廃棄物容器を置きます。細胞から培地を吸引し、100μlのおよび部分的に70％エタノールで充填された廃棄物容器内に分注する。新鮮な培地100μlを、新鮮なヒントを吸引し使用して、徐々に細胞上に分注する。セルのすべてのプレートについて繰り返します。 </li><li> 48時間インキュベーターにプレートを返します。 </li></ol> 4。二重ルシフェラーゼアッセイを行う画面の4日目に、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイが行われる。 注：デュアルルシフェラーゼアッセイを、表3で説明したように、2アッセイバッファ、3Xホタルアッセイバッファと3X ウミアッセイ緩衝液の連続添加を必要とするホタルおよびウミルシフェラーゼが分泌されない、このように細胞が前にルシフェラーゼ活性を測定するために溶解されなければならない。 。ホタルアッセイ緩衝液は、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼの基質を提供し、 ウミシイタケアッセイ緩衝液は、ホタルシグナルを消光し、 ウミシイタケルシフェラーゼの基質を提供する。 <ol><li> 表3に記載したように、各ライブラリープレートについては、ストック溶液から3Xホタルアッセイバッファを8mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに82μlずつ分注する。 </li><li>各ライブラリープレートについて、また3× ウミシイタケアッセイ緩衝液を12mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに122μlずつ分注する。両方を脇に置きますホタルおよびウミアッセイ緩衝。 </li><li>ロボットデッキで（同じライブラリのプレートからトランスフェクト）ピペットチップの箱、廃液容器、およびセルの2枚を配置します。 </li><li>各プレートからの培地の吸引物60μLと部分的に70％エタノールで満たされた廃棄物容器に廃棄します。プレートをカバーし、脇に置きます。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、プレートのすべてのセットのために繰り返します。 </li><li> 2ピペットチップの箱、3Xホタルアッセイバッファのプレートと、ロボットデッキに細胞プレートのセットを配置します。 </li><li> 3Xホタルアッセイバッファの吸引物40μLと十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。新しいピペットチップへの切り替え、第二のセルプレートのために繰り返します。溶解が完了するまで室温で10分間細胞を置く。複数のライブラリ版をトランスフェクションする場合は、ヒントと細胞プレートのボックスを交換して、繰り返します。 </li><li>ウェルあたり1秒間記録ルミノメーター上の各細胞プレートの各ウェルからの記録発光、。ロボットにプレートを返すデッキ。 </li><li> 2ピペットチップの箱、3X シイタケアッセイバッファープレート、ロボットデッキ上の細胞プレートのセットを配置します。 </li><li>吸引物60 3X ウミアッセイバッファーのμL、および十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。ピペットチップの新しいボックスに切り替えて、第二のセルプレートのために繰り返します。複数のライブラリプレートをトランスフェクトした場合、細胞プレートのすべてのセットのために繰り返します。 </li><li>上記のように1秒間各ウェルを記録するルミノメーター上のすべてのプレートからの記録発光、。プレートを捨てる。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li> ウミ信号のカウントによってホタル信号のカウント数で除して各ウェルについて： ウミ発光比（「R比F： &quot;）ホタルを計算します。 </li><li>井戸の最高と最低の25％を除いた、プレートのR比：各R比を十分に平均Fで、Fを分割することにより誘導値を計算します。 </li><li>複製物全体に誘導値を平均シングルトランスフェクトライブラリプレート用。 α-シヌクレインを誘導または抑制遺伝子以上の3倍量この画面で「ヒット」とみなされ、さらに検証および二次スクリーニングの対象とされています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+&#945;-synuclein+gene+(SNCA)+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system.">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the &#945;-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li><li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene.">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li><li>Scherzer, C. 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Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li><li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays.">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression.">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li><li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells.">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li></ol>

この作業は、ライセンスBacMamreagents（米国特許5731182）により得られた使用料によってサポートされていました。

α-シヌクレインはレビー小体4、疾患のための考えられる特徴的な細胞内封入体の成分としてのパーキンソン病（PD）に関与している。数々のゲノムワイド関連解析は、散発的なPDの5,6,7リスクの増加とα-シヌクレインに一塩基多型をリンクされています。散発PDよりも一般的であるが、家族性PDはまた、α-シヌクレイン8と同様に、α-シヌクレイン遺伝子座9,10,11、</s...

キー遺伝子調節要素とそれらに作用する因子を同定する能力は、非常に多くの生物学的プロセスの探査のための基本である。しかしながら、このような特定のニューロン集団のような希少細胞タイプにおいて遺伝子の発現を調節する因子を同定する、挑戦的であることができる。ここでは、α-シヌクレイン（SNCA）の新規な転写調節因子を同定するためのプロトコルを提示し、パーキンソン病に関連し、substantianigraでドーパミン作動性ニューロンに発現している遺伝子は、中脳の緻密領域様部。我々は、293T細胞におけるα-シヌクレイン発現を分解するための高スループット、デュアルルシフェラーゼレポーターインビトロスクリーンを用いてこれを達成する。 α-シヌクレインプロモーターは、第ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドにクローニングする。構成的に活性なプロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼを含む市販のプラスミドを内部対照として役立つ。テサロニケ電子レポーター構築物を、各ウェルが単一のライブラリープラスミドでトランスフェクトされるように、DNA発現ライブラリー由来のプラスミドでマイクロプレート中の293T細胞に同時トランスフェクトする。 48時間後、各レポーターのためのルシフェラーゼ活性は、デュアルグローアッセイを用いて順次測定される。プレートベースの正規化後：（R比F）各ウェルのウミシイタケルシフェラーゼ活性：各ライブラリ遺伝子に応じて、α-シヌクレインの相対発現は、ホタルの比によって推定される。 このプロトコルは、最小限の人員（1-2人）と最小のコスト（マイクロプレートアッセイあたり約3ドル試薬コスト）を使用して、レポーター遺伝子をトランスする能力について多数の遺伝子（週〜2500）をスクリーニングする機能を提供します。遺伝子操作に難治培養ニューロンで研究することが困難である神経細胞の遺伝子の転写調節因子（ 例えば 、α-シヌクレイン）は、この直接機能アッセイで並べて比較することができる。私達は私達の中に含まれるプロトコル我々は、従来の手順（説明を参照）で成長させたときに、この領域を含むプラスミドが不安定であることが見出さため、クローニングおよびα-シヌクレインプロモーターを含むプラスミドの増殖のための詳細な方法。また、ハイスループットアッセイ用の市販のデュアルルシフェラーゼ試薬に安価な代替品が挙げられる。このプロトコルは、容易に、または高スループット一過性トランスフェクションを必要とするあらゆるプロセスに関心のある他の調節エレメントを標的とするように適合させることができる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

我々は、α-シヌクレイン、パーキンソン病に関連する遺伝子の転写調節因子を同定するための迅速かつ安価なハイスループットスクリーニングプロトコルを提示する。 293T細胞を一過一遺伝子あたりウェルマイクロプレートフォーマットで、一緒にルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、配列されたORFの発現ライブラリー由来のプラスミドでトランスフェクトされる。ホタルルシフェラーゼ活性は、内部コントロール構築物（ ウミシイタケルシフェラーゼを導くhCMVプロモーター）から発現に対して正規化し、α-シヌクレインの転写時に各ライブラリー遺伝子の効果を決定するために48時間後にアッセイされる。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで無菌の液体処理を行うバイオセーフティキャビネット内に封入卓上型ロボットによって促進される。我々の自動化されたトランスフェクションプロトコールは、ハイスループットレンチウイルスライブラリーの産生又はコンジュユニークなライブラリープラスミドの多数の三重トランスフェクションを必要とする他の機能的スクリーニングプロトコルに容易に適用可能でヘルパープラスミドの共通セットでnction。また、市販の、デュアルルシフェラーゼPTC124を採用している試薬、EDTA、および以前のウミシイタケルシフェラーゼを測定し、ホタルルシフェラーゼ活性を抑制するために、ピロリン酸への安価で検証済みの代替を提示する。これらの方法を用いて、7,670のヒト遺伝子をスクリーニングし、α-シヌクレインの68調節因子を同定した。このプロトコルは、関心のある他の遺伝子を対象とする、容易に変更可能です。

典型的なルシフェラーゼ値、F：R比およびシングルハーフプレート用の誘導値は、図4に示されているだけでなく、H2、32倍誘導剤でヒットに注意してください。過剰な毒性（例えば、よくE3）、または不十分なトランスフェクションした井戸を引き起こす遺伝子は、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼが、平均誘導値の両方のために低い値を生成します。 pGL4骨格との...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K ビュー.  Massachusetts General Hospital. 我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。 ...

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

生物学

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...