我々は彼の実りのコメントや提案のために博士イヴ·L·ジャニンに感謝します。私たちは彼女の技術的なサポートのために、CHIK /漣とC CombredetためHHガドに感謝したいと思います。パスツールの病気Infectieuses（POVへのプログラムのSTINGとHM- - この作品は、パスツール研究所、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）、研究所国立·デ·ラ·サンテエトデ·ラ·ルシェルシュMédicale（INSERM）、研究所カルノーによってサポートされていましたL）を、通信社国立）がPOVにLAルシェルシュ（ANR-RPIB、プログラムSTING 2.0を注ぎ、そして「Conseilの地域D&#39;イルドフランス」（ケミカルライブラリプロジェクト、助成N°06から222のI / RとI HM-Lに対して09から1739 / R）。 CHIKV /漣上の作業は、プロジェクトArbOAS（ANR助成金2010-INTB-1601-02）によってサポートされていました。

化合物を用いた96ウェル娘プレートの1。準備<ol><li>室温-20℃からDMSO中の化学化合物の10mMストック溶液を含む96ウェルの母プレートを移動させる。 2mMの中間の96ウェル希釈プレートを得るためにDMSO中の化合物5倍に希釈する。希釈のDMSO 20μLに5μlのピペットで混合することによって達成される。 </li><li>ピペットホワイト、バーコード化された組織培養96ウェルプレートのドライウェルに希釈プレートから1μL。娘プレート（D1）のこの最初のセットは、20μMの最終濃度で化合物の毒性を評価するために使用される。使用するまで-20℃で娘プレートを保管してください。 </li><li> DMSOおよび混合の36μLに希釈プレートから4μLをピペットで再び1:10に化合物を希釈する。ホワイト、平底、バーコード化された組織培養96ウェルプレートのドライウェルにピペット1μL。娘プレート（D2）は、この第2のセットは、MV replicatioの阻害を評価するために使用される2μmの最終濃度での化合物によるN。使用するまで-20℃で娘プレートを保管してください。 </li></ol> 2。細胞培養の調製化合物の毒性を調べる方法<ol><li> 37℃で、HEK-293T細胞を成長させ、5％CO 2ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で安定化されたL-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）、ストレプトマイシン（100μg/ ml）を、およびペニシリン（100でIU / ml）を。細胞は、4〜5日毎にトリプシン処理により継代し、新鮮なフラスコに1:10に希釈されています。細胞は実験のために対数期にあるべきである。 </li><li>実験の日に、トリプシン処理により細胞を回収し、細胞計数を行う。ペレットを遠心分離により細胞を、培養培地中に3×10 5細胞/ mlで再懸濁。細胞懸濁液を12.5ミリリットルを各スクリーニングプレートに必要であることを考慮してください。 </li><li>転送トラフに細胞、およびスパイク化学部品を含むD1のプレートに細胞懸濁液100μlを分注unds。トラフ内の細胞懸濁液を定期的に沈降を避けるために攪拌される。 </li><li> DMSOを1μlの対照ウェルA1、C1、E1、G1、A12、C12、E12とし、G12スパイク。対応するウェルは、生細胞のための基準（非毒性）として使用される。細胞を殺すために、DMSOの1μL及び0.5％IGEPAL溶液を2.5μlの対照ウェルB1は、D1、F1、H1、B12、D12、F12キーおよびH12スパイク。対応するウェルを、死細胞（高毒性）のための基準として使用される。 </li><li> 37℃で24時間、細胞をインキュベートし、5％CO 2。 </li></ol> rMV2/Lucによって感染細胞培養の3。準備<ol><li>成長し、2.1と2.2で説明したように細胞を回収する。再度、培養培地中の3×10 5細胞/ mlで再懸濁細胞。細胞懸濁液を12.5ミリリットルを各スクリーニングプレートに必要であることを考慮してください。 </li><li>オプション：20μg/ mlのでウリジンとサプリメントの培地。 注意：ウイルスreplicatioための化学ライブラリーをスクリーニングする場合N阻害剤は、ピリミジン生合成経路の初期段階を対象とした化合物が頻繁に13,16,27,28が隔離されているようです。培養培地へのウリジンの添加は、そのような抗ウイルス分子を除去するために使用される。確かに、これは効率的に、ピリミジン生合成経路の上流の酵素がブロックされているウイルスの複製を復元します。 </li><li>非感染細胞と対照ウェルのために細胞懸濁液の1:10に保存し、残りの容量の感染に進みます。 </li><li> rMV2/Luc原液の適切なボリュームを解凍する。 MVストック溶液、1mlあたり10 6〜10 8感染粒子で、通常です。文化は、感染の0.1多重度（MOI）に対応して、標的細胞あたりのrMV2/Lucの0.​​1感染性粒子に感染している必要があります。注：rMV2/LucはMVワクチン（Schwarz株）に由来し、BSL2環境で操作される。 </li><li>細胞懸濁液にウイルスを追加し、穏やかに混合する。トラフに感染した細胞を移し、そして100を分配スパイクされた化学化合物を含有D2プレートの列2〜11中の感染細胞懸濁液の液。トラフ内の細胞懸濁液を定期的に穏やかに混合する。 </li><li>列1および12では、100の非感染細胞の液Aよく上の2を分配する。感染した細胞は、他のウェル中に分配される。 </li><li> 37℃で24時間、細胞をインキュベートし、5％CO 2。 </li></ol> 4。ル​​シフェラーゼ活性を測定し、データ解析<ol><li>インキュベーターからD1プレートを外し、直接培養ウェルにルシフェラーゼに基づく生存能力試薬50μLを追加することによって、細胞の生存率を決定。混合し、室温で10分間インキュベートする。ルミノメーターでプレートを読んでください。積分時間は、ウェルあたり100ミリ秒に設定されている。 </li><li>インキュベーターからD2のプレートを外し、直接培養ウェルにルシフェラーゼ基質50μlのを追加して、ルシフェラーゼ活性を測定。室温で6分間インキュベートし、descriなどのルミノメーターでプレートを読む上記ベッド。 </li><li>画面29の品質を保証するために、毒性アッセイの各D1のプレートのためのZ &#39;因子を計算します。 Z &#39;= 1-3 *（σ+σ-）/（μ+ - μ-）、μ+とσ+がDMSO単独（無毒性）で発光する手段およびHEK-293T細胞の標準偏差に対応している場合、およびμ-と発光して細胞を殺すためにIGEPALで処理された培養ウェルの標準偏差を用いてσ-です。 Z &#39;は0.5以上であることが期待される、または対応するプレートは廃棄される。 </li><li> μ+ / 2で毒性閾値を設定します。このカットオフ（ 図3A）以下の発光値を有する化合物を捨てる。 </li><li>抗ウイルスアッセイの各D2のプレートのためのZ &#39;因子を計算します。ここで、μ+とσ+発光とDMSOのみとともに培養し、感染した細胞のための標準偏差の手段に相当し、μ-、発光と非感染細胞の標準偏差を用いてσ-です。 Z＆＃で再度、プレート39; 0.5未満の値は破棄されます。 </li><li> - /（μ+ - μ-）* 100 =（化合物Xのためのルシフェラーゼ活性μ+）阻害の割合：以下のようにウイルス複製の阻害を計算します。 75パーセントの阻害のしきい値を設定し、両方がこのカットオフ以下の発光値（ 図3B）を低減し、4.4で説明した基準に従って毒性ではない化合物を選択。 </li></ol>毒性および広域スペクトル抗ウイルス活性5。二次スクリーニング<ol><li>それぞれに1:2連続希釈を500〜4μmで（8希釈液）から開始し、DMSOに化合物を打っていることを確認します。培養液50μlと白、バーコード化された組織培養プレートを埋める。培養ウェル中の各化合物希釈液1を添加する。各ヒット化合物の重複連続希釈物と3培養プレートを持っている二回繰り返します。 </li><li>上記のように2.1及び2で（培養培地中6×10 5細胞/ mlのHEK-293T細胞懸濁液を37.5mlの調製0.2）。ファルコンチューブに2X 12.5ミリリットルを分配し、MOI = 0.2でのウミシイタケルシフェラーゼ（CHIKV /レン）を発現し、MOI = 0.1または組換えCHIKVでrMV2/Lucのいずれかで細胞に感染。転倒混和する。 注：CHIKV /漣はCHIKVの野生型株に由来するため、BSL3環境で操作する必要があります。ウミシイタケ基質が培養ウェルに添加された後、プレートを（下記参照）BSL1にBSL3から移動させることができる。 </li><li> 50感染していない、rMV2/Luc-infectedμlの、又は、ヒット化合物の連続希釈液を含有する培養プレート中CHIKV /レン感染細胞を分注する。 37℃で24時間インキュベートする</li><li> rMV2/Luc-infectedウェル中のホタルルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ基質50μlを加える。 CHIKV /漣感染ウェル内のウミシイタケルシフェラーゼ活性を決定するために、ウミシイタケルシフェラーゼ基質50μlを加える。最後に、細胞の生存率を決定するために非感染細胞にルシフェラーゼに基づく生存率アッセイ試薬50μlを加える。 </li><li>プロットデータ（FIグレ4）および50％MVとCHIKV複製を阻害ヒット化合物の濃度を決定する。このアッセイにおいて、いくつかの毒性を示す化合物は無視してください。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここに記載のスクリーニングパイプラインは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤として適切なプロファイルを有する化合物を選択することを目的とする。万化合物のライブラリーは、このプロトコルでスクリーニングし、前述のフィルタリング基準が適用された場合には、75パーセントよりも優れたMV複製の阻害、 すなわち 40の化合物（0.4％）が陽性と。加えて、それらの約半分は?...

RNAウイルスはヒト感染の多種多様のために責任があり、両方の公衆衛生および経済的なコストの面で世界的に個体数に大きな影響を与える。効率的なワクチンは、いくつかのヒトRNAウイルスに対して開発され、広く予防的処置として使用される。しかしながら、RNAウイルス感染症に対する治療薬の重大な欠如が依然として存在する。確かに、効率的なワクチンは、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスやヒトRSウイルス（はhRSV）などの主要なヒト病原体に対して使用できません。また、RNAウイルスは世界的な取引所や生態系に対する人間の影響の頻度が増加している新興疾患の大部分を担当している。 RNAウイルスを表し、この脅威に対して、我々の治療の武器は非常に限られており、1月3日は比較的非効率的である。現在の治療法は、基本的に、自然免疫を刺激するため、組換えI型インターフェロン（IFN-α/β）に基づいていますまたはリバビリンを投与する。このリボアナログの作用機序は、議論の余地がある、おそらくさまざまなメカニズムに依存していますが、細胞内のGTPプールを枯渇携帯IMPDH（イノシン一リン酸脱水素酵素）の阻害は、4明らかに必要不可欠である。リバビリンは、ペグ化IFN-αと組み合わせて、C型肝炎ウイルスに対する主な治療法である。彼らは効率的に鈍い、IFN-α/βは5因子の毒性の発現を介したシグナル伝達と、多くの場合、リバビリン3をエスケープしかし、IFN-α/βとリバビリンの治療は、ほとんどのRNAウイルスに対する生体内で比較的乏しい有効性のある。それが最近、論争のメリット6で重度のはhRSVの疾患に対して承認されたが、これは、リバビリン治療が重要な毒性の問題を発生させているという事実に追加しました。より最近では、いくつかのウイルス特異的治療が開発oでインフルエンザウイルスに対して特に市販されているFノイラミニダーゼ阻害薬3。しかしながら、大きな多様性RNAウイルスの永続的な出現は、比較的近い将来、それらの各々に対する特異的治療の開発を妨げる。全体として、これは近い将来に強力な抗ウイルス分子を同定し、開発するための効率的な戦略の必要性を強調している。 これは、RNAウイルスの大きなパネルに対して活性広域スペクトル阻害剤は、この問題を解決するだろうと言うことは自明である。このような分子は、まだウイルス学者の夢ではあるが、細胞防御メカニズムと自然免疫系の我々のより良い理解は、いくつかの可能性が7,8存在することを示唆している。いくつかの学術および産業の研究室は現在、ウイルスの複製を鈍らせる細胞防御メカニズムや代謝経路の特定の側面を刺激する分子を求めている。このような化合物は、おそらく重大な副作用が表示されますが、急性ウイルス感染に対する治療はの管理となります長期的にいくつかの潜在的な毒性にもかかわらず、それらを許容すること、比較的短時間のED。様々な戦略は、例えば、広域スペクトル抗ウイルス分子を同定するために開発されてきた。いくつかの研究プログラムは、特定の防御または代謝経路を標的とする分子を発見することを目的としている。これには、は、例えば、ウイルス遺伝子発現9を誘発し、そのようなRNASEL 10、ウィルス分解11を促進するためにオートファジー機械などの抗ウイルス因子を活性化する病原体認識受容体は、ヌクレオシドの合成は、ウイルス感染細胞の死を沈殿させ12,13、またはアポトーシスカスケードをパスウェイ14。他のグループは、ターゲットベースではない13,15-17表現型スクリーンを開発しました。その場合には、抗ウイルス分子は、単に所与の細胞系においてウイルス複製をブロックするそれらの能力によって同定される。一般的な仮定は2-3無関係のRNAウイルスを阻害する化合物は、広い種に適したプロファイルを有するであろうということである抗ウイルス分子をectrum。そのような経験的アプローチを選択したヒット化合物の作用のモードは、第即座に決定され、最終的には、抗ウイルス剤のための新規細胞標的の同定につながる可能性がある。興味深いことに、1999年から2008年の間に米国食品医薬品局（FDA）によって承認された新薬のレトロスペクティブ分析では、一般的に、このような表現型の上映は、ファースト·イン·クラスの低分子薬18を発見するために、ターゲットベースのアプローチよりも良いを実行する傾向があることが示されている。 ハイスループット細胞ベースのアッセイでのウイルス複製は、通常、ウイルス細胞変性効果から決定される。試験化合物の存在下で、または384ウェルプレート - 細胞を96で感染させ、培養する。数日後、細胞層は、例えば、クリスタルバイオレットなどの染料で固定し、染色する。最後に、吸光度をプレートリーダーで測定すると、ウイルス複製を阻害する化合物は、あちこちに細胞層を維持する能力によって同定されるm個のウイルス誘導細胞変性効果。あるいは、ウイルス媒介性細胞変性効果は、MTS還元などの標準的な生存率アッセイを用いて評価される。このようなアッセイは、非常に扱いやすく、コスト効果的であるが、3つの主要な制限を受ける。第一に、彼らはこのように19に近づくの代替を求めて、ウイルス複製がわずか数日で細胞変性であるが、これは必ずしも可能ではないウイルス-細胞の組み合わせを必要とする。第二に、それらは、ウイルス複製の間接的な測定に基づいているため難定量的である。最後に、毒性化合物は、陽性ヒットとしてスコアすることができるので、細胞生存率を測定するカウンタースクリーンで除去されなければならない。これらの障害のいくつかを克服するために、組換えウイルス又はレプリコンは、追加の転写単位から、またはウイルスタンパク質遺伝子（いくつかの例は20〜23である）とインフレームで、例えば、EGFP又はルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を発現するために逆遺伝学によって操作されている。これらのウイルスは複製し、レポーターPRoteinsは、ウイルスタンパク質自体と一緒に生産されています。これは、ウイルス複製を測定し、候補分子の阻害活性を評価するための非常に定量的なアッセイを提供する。これは、このレポーターシステムは、高感度、事実上の背景を持つ広いダイナミックレンジを発揮するため、ルシフェラーゼ（または生物発光が可能な他の酵素）を発現する組換えウイルスに特に当てはまります。また、全く励起光源は、このように、化合物24の蛍光の干渉を防止する、存在しない。 ここでは、詳細なハイスループットプロトコルは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤の化学ライブラリーをスクリーニングする。化合物は、ホタルルシフェラーゼ25（rMV2/Luc、 図1、一次スクリーニング）を発現する組換え麻疹ウイルス（MV）に感染したヒト細胞で最初にテストされています。 MVは、注文をモノネガウイルス目に属する、多くの場合、マイナス鎖RNAウイルスの原型メンバーとして考えられているES。このように、MVゲノムはウイルスタンパク質をコードするmRNA分子を合成するために、ウイルスポリメラーゼにより鋳型として使用する。 rMV2/Luc呼ばれる組換えMV株におけるルシフェラーゼ発現は、PとM遺伝子（ 図2A）との間に挿入された追加の転写単位から発現される。並行して、化合物は、ATPの定量によって、培養物中の代謝活性のある細胞（ 図1、一次スクリーニング）の数を評価する商業ルシフェラーゼベースの試薬 ​​を用いてヒト細胞に対するそれらの毒性について試験する。全体の化学ライブラリーを容易に有毒ではなく、効率的にMV複製を遮断する化合物を選択するために、これら2つのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。その後、ヒットはチクングニヤウイルス（CHIKV）の複製（ 図1、二次スクリーニング）を損なうする能力についての用量反応MV複製の阻害、毒性がないだけでなく、について再試験されています。 CHIKVはトガウイルス科のメンバーであり、そのゲノムは、APであるositive一本鎖RNA分子。このように、それははしかとMVとCHIKVの両方がRNAウイルスの大きなパネルを阻害する大きなチャンスが阻害化合物とは全く無関係である。構造タンパク質は、サブゲノムmRNA分子の転写および翻訳によってコードされているのに対し、CHIKV非構造タンパク質を直接、ウイルスゲノムから翻訳されています。 CHIKVのための私たちのin vitroでの複製アッセイは、NSP3とのnsP4シーケンス26（ 図2B）との間にレポーター遺伝子を挿入することによって非構造ポリタンパク質の切断された部分としてウミシイタケルシフェラーゼ酵素を発現CHIKV /漣と呼ばれる組換え株に基づいています。ウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定は、CHIKVのライフサイクルの初期段階においてウイルス複製の監視を可能にする。 このハイスループットプロトコルを迅速万molecの市販のライブラリーにおいて、広域スペクトル抗ウイルス剤に適したプロファイルを有する化合物を同定するために使用された化学的多様性について濃縮ULES。化合物は、基本的には250〜600ダルトンの範囲の分子量で、5のリピンスキーのルールを次の、そして5以下のD値を記録した。これらの分子のほとんどは、他の商用ライブラリで利用可能な新しい化学物質ではなかった。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNAウイルスは、インフルエンザ、気管支炎、デング熱、C型肝炎やはしかなどの主要なヒト疾患の原因である。彼らはまたので、より多くの自然の生態系を貫く増加世界的な交流や人間集団の新たな脅威を表しています。このような新興状況の良い例は、インド洋での2005から2006のチクングニヤウイルスの流行である。ウイルス複製を制御する細胞経路についての我々の理解における最近の進歩は、宿主細胞の機能を標的とする化合物ではなく、ウイルス自体は、RNAウイルスの大きなパネルを阻害し得ることを示唆している。いくつかの広域スペクトル抗ウイルス化合物は、宿主標的指向アッセイで同定されている。読み出しは依然として最も重要スクリーニング戦略を表すしかしながら、細胞変性効果の低減を用いて細胞培養物におけるウイルス複製の阻害を測定する。このような機能の画面が大幅にレポーターを発現する組換えウイルスの開発によって改善されているCA酵素ルシフェラーゼなどの生物発光のpable。本報告では、我々の詳細を広域スペクトル抗ウイルス性プロファイルを有する化合物を同定するために、組換え麻疹および細胞生存率アッセイとチクングニアウイルスを組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプラインを、。

このスクリーニングパイプラインは、MV複製を阻害する化合物の選択に依存しており、最初の重大な細胞毒性（ 図1、一次スクリーニング）を示していない。それは、細胞毒性およびウイルス複製の阻害を決定するために、ルシフェラーゼに基づくアッセイを利用する。全てのピペッティング工程およびデータ取得は、ロボットプラットフォームでハイスループット設定で行うこ?...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプライン。

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K ビュー.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569. ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイ?...

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

免疫・感染学

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...