本研究では、リタ·アレン財団助成金からシーナアジットへの資金によってサポートされていました。著者は、楽器の使用、科学的、技術的支援のためのサウスカロライナ州電子顕微鏡センターの大学からエリカバログ博士Soumitra Ghoshroyを確認したいと思います。

人間とげっ歯類からの血液サンプルを使用してすべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行された。ヒト被験者は医薬品治験審査委員会のドレクセル大学が承認したインフォームドコンセントを与えた後、在籍していたし、動物を使用して行う研究のためのすべての手続きは、ドレクセルのインスティテューショナルアニマルケアと使用委員会によって承認された。 1。血液からエキソソーム精製（〜5.5時間） TIPS <ul><li class="jove_content">我々はmirVanaのmiRNAの単離キットから300μlのRNA溶解緩衝液中の血液の1チューブ（〜10ミリリットルヒト血液と〜2 mlのマウス血液）からエキソソームを再懸濁します。 </li><li class="jove_content">細胞培養培地からエキソソームを精製するために、メディアは、細胞を除去し、また、12,000×gで遠心分離した後、0.22μmフィルターを通してろ過する10分間500 xgで回転させた。細胞培養培地からエキソソーム浄化PBSで希釈、PBS洗浄又は第二超​​遠心ステップを必要としません。 </li><li class="jove_content">精製エキソソームは、超遠心分離工程後のショ糖勾配遠心分離工程を追加して、プロテオミクス研究に使用する場合、タンパク質凝集体および汚染物質15の量が減少する。 </li><li class="jove_content">エキソソームの観察された形態は、ソースとTEMのための処理手順の両方に応じて異なる場合があります。私たちは以前にサンプル処理9,15の違いに起因しているエキソソーム用カップ形状の形態を観察しなかった。免疫金標識を含む当社のTEM像は、血液、エキソソーム9,16,17派生胆と皮質の文化など、さまざまなソースからの以前の報告と類似しています。 </li></ul><ol><li> 10-60分間室温で直立5xおよび場所の血を含むEDTAコーティングされたチューブを反転。 </li><li> 4℃で15分間、2,000×gで遠心</李&gt; <li>を15mlチューブに最上層、プラズマを収集し、氷の上に保つ。 </li><li> PBS等量の液体を希釈する。 4で2,000×gで30分間遠心℃に</li><li> 4℃で、チューブを遠心24ミリリットルの合計ボリュームに対して1X PBSを追加し、12,000×gで45分間遠心分離する転送</li><li> 4℃でチューブを超遠心機にかけると11万xgで2時間を遠心への転送</li><li>再懸PBSでペレットとは、4℃で10万xgで1時間遠心分離</li><li>適当な緩衝液に再懸濁したペレット（RNA溶解バッファー）。 </li><li>それぞれ電子顕微鏡およびウェスタンブロット分析のために、PBSまたはRIPA緩衝液中に再懸濁する。 </li></ol> 2。修正mirVanaのmiRNAのアイソレーションキット（〜1時間）を使用してRNA精製 TIPS <ul><li class="jove_content"> 、（PPE）個人用保護具を着用してのRNaseザップと表面やピペットを拭くし、滅菌フィルターのヒントやチューブを使用してRNAを単離するための領域を準備します。 </li><liベンダーからプロトコルだけのmiRNAを精製するオプションを提供しますが、クラス= &quot;jove_content&quot;&gt;、我々は常に我々は、同じサンプルから両方を勉強できるように、mRNAおよびmiRNAを含むトータルRNAを分離。 </li><li class="jove_content">カラム上でDNase処理工程を追加すること存在してもよいDNAの痕跡を除去する。エキソソームのソースに応じて、DNAは、マウスおよびヒト肥満細胞線8を含むいくつかの供給源から精製エキソソームに存在しないことが報告されているが、染色体DNA配列は、培養心筋細胞18の培地から精製されたエキソソームで検出されている。 </li><li class="jove_content">ベンダーが必要なだけ1 700μlの添加のために溶液1を洗って提供するので、私たちは、洗浄液1から350μL（下記ステップ2.4​​）の容積を減少させた。体積が減少されていない場合キット全体の内容を使用して放置十分な解決策は存在しない。残りの手順は、製造業者の推奨に従って行った。 </li></ul><ol><li> 1/10のVOを追加miRNAのホモジネート添加のLUME（30μL）と10分間、氷上でインキュベートする。 </li><li>初期ライセート量に等しいクロロホルム：酸 - フェノールの量で抽出。新しいチューブに上相を遠心分離して回収する。 </li><li> 1.25ボリューム100％エタノール（375μL）を追加します。渦。カートリッジをフィルタリングし、10,000×gで15秒遠心分離にも適用されます。 </li><li>推奨されるボリュームのmiRNA洗浄液1（350μL）の半分を追加し、10,000×gで15秒遠心します。 </li><li>各サンプルの10μlのDNアーゼ1〜70μlのBuffer RDD（キアゲン）を追加します。カラムに80μLを加え、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>ソリューション1（350μl）を洗浄し、10,000×gで15秒遠心追加。 </li><li>解決法2/3（500μL）を洗浄し、10,000×gで15秒遠心追加。 REPEAT。 </li><li> 40μlの95で溶出°CヌクレアーゼフリーH 2 O </li><li> RNAの濃度を決定し、100 ngの/μlにRNAを希釈。 </li></ol> 3。 BlooのエキソソームからのmiRNAプロファイリングDタックマン低密度アレイ（本件契約）カード（〜6.5時間）を使用 TIPS <ul><li class="jove_content"> 、PPEを身に着けていることによって、RNAを単離し、RNaseのザップと表面やピペットを拭くし、滅菌フィルターのヒントやチューブを使用するための領域を準備します。 </li><li class="jove_content">プリアンプ（プリアンプ）ステップは1から350 ngのRNA（350-1,000 ngのサンプルはcDNA合成後にプリアンプのステップを必要としない）をお勧めします。それはあなたが等しい条件の下ですべてのサンプルを扱う必要があるため、プリアンプがあなたのサンプルのために必要であるかどうかを判断することが重要です。プリアンプのステップは、コストを追加し、Ct値が低く許容カットオフ（32の代わりに40）を持っています。 </li><li class="jove_content">それは一日で実行できるカードの枚数に応じて、プレートの代わりにストリップチューブ中のcDNA反応を用意すると便利です。これは、同じ日に処理されませんcDNAサンプルの凍結融解を最小限に抑えることができます。 </li><li class="jove_content">さまざまなソースから収集エキソソームはdiffeの持っているRNAの量を借りる。このプロトコルは、cDNA合成反応に3μlのRNAテンプレートの最大を可能にします。限られた多分単離することができるエキソソームRNAの量、ソースに応じて。典型的な組織cDNAは3μlの容積で100ngのRNAを、ヒト血液またはヒト細胞培養培地からエキソソームから作られることを十分にRNA得ることができますが、多くの場合、より少ないRNAが含まれており、cDNAが少ない出発材料から作られている必要があります。マウスの血液エキソソームは、RNAの高いレベルを含み、3μlの内の少なくとも100ngを得ることができる。 </li></ul><ol><li> Megaplexはプールを使用して、RNAを精製からcDNAを準備するには転写プライマー（プールとプールBマイクロ流体カードでのmiRNAのためのプライマーを含む配列AとB）逆、氷の上で反応成分を解凍。 </li><li>ラベル2 RNaseフリープールのRT反応は1.5 mlチューブプライマーまたはプールBプライマーとチャートの順序でコンポーネントを追加します。 2つ以上の反応に成分の少なくとも1つの余分なボリュームを追加するかのようにTが推奨するマスターミックスを作る彼ベンダー。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT反応成分 </td><td> 成分濃度 </td><td> 1サンプルの容積（合計V /サンプル= 4.5μL） </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td></td><td> μlの0.20 </td></tr><tr><td> MegaplexはRTバッファー（10倍） </td><td> 1X </td><td> μlの0.80 </td></tr><tr><td>のdNTP（100 mM）を</td><td> 4.4 mMの</td><td> μlの0.20 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25mMの） </td><td> 5 mMの</td><td> μlの0.90 </td></tr><tr><td>アーゼ阻害剤（20U/μl） </td><td> 2 U </td><td> μlの0.10 </td></tr><tr><td> MegaplexはRTプライマーAまたはB（10倍） </td><td> 1X </td><td> μlの0.80 </td></tr><tr><td>逆転写酵素をMultiScribe </td><td> 75 U </td><td> μlの1.50 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li>チューブ反転6回セント簡潔rifuge。その後、ピペット4.5マイクロアンペア8チューブストリップ又は96ウェルマイクロアンペア光反応プレートに添加RT反応ミックス。 </li><li> RNA 100ngのを追加し、DEPC処理水で3μlに音量を調整したり、3μlの全RNAを加え、ピペットチップでかき混ぜると、チューブまたはプレートを密封。簡単にスピンし、氷上で5分間インキュベートする。 </li><li> PCRマシンに反応をロードし、（アプライドバイオシステムズ社Megaplexはプールプロトコルによって推奨されているように）、以下の条件の下でそれを実行します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> ステージ </td><td> 温度 </td><td> 時間 </td></tr><tr><td>サイクル（40倍） </td><td> 16°C </td><td> 2分</td></tr><tr><td></td><td> 42°C </td><td> 1分</td></tr><tr><td></td><td> 50°C </td><td> 1秒</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 85°C </td><td> 5分</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 4°C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> -20℃でのcDNAストア（少なくとも1週間のためによい）、または一週間のために保存することができ、プリアンプのステップに進みます。 </li><li>氷の上でプールとプールBのプリアンププライマーを解凍し、混ぜて反転。渦巻タックマンプリアンプマスターは混ぜても氷の上に保つ。 </li><li> 2つ以上の反応に成分の少なくとも1つの余分なボリュームを追加チャートに従うかのようにベンダが推奨マスターミックスを作る。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> プリアンプ反応成分 </td><td> 1サンプルのボリューム </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 7.5μL </td></tr><tr><td>タックマンプリアンプマスターミックス（2X） </td><td> 12.5μlの</td></tr><tr><td> MegaplexはプリアンププライマーまたはB（10倍） </td><td> 2.5μL </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li>ピペット2.5μlのRTのproduCTマイクロアンペアに8チューブストリップまたは96ウェルマイクロアンペア光学反応プレート各ウェルに22.5μlのプリアンプ反応ミックスを分注する。 </li><li>氷上で5分間のインキュベートプレートを密封した後、PCR装置にサンプルをロードします。以下の条件の下で実行されます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> ステージ </td><td> 温度 </td><td> 時間 </td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 95°C </td><td> 10分</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 55°C </td><td> 2分</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 72°C </td><td> 2分</td></tr><tr><td>サイクル（12X） </td><td> 95°C </td><td> 15秒</td></tr><tr><td></td><td> 60°C </td><td> 4分</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 99.9°C </td><td> 10分</td></tr><tr><td>ホールド</td><td> 4°C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li>プリアンプ反応が完了した後、短時間チューブまたはプレートを遠心分離し、各ウェルまたはチューブに75μlの0.1×TE液pH8.0を追加します。 </li><li>密封し、混ぜると簡単にスピン。 -20℃で1週間希釈製品を保管またはプレートをロードするために続けています。 </li><li>氷上でRNaseフリー1.5mlチューブに次のように結合します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 1カードのボリューム </td></tr><tr><td>タックマンユニバーサルPCRマスターミックス、ノーのAmpErase UNG（2X） </td><td> 450μlの</td></tr><tr><td>希薄化後PREAMP製品</td><td> 9μlの</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 441μlの</td></tr></tbody></table><ol start="14"><li>混ぜると簡単に遠心するチューブを反転。タックマンのマイクロRNAアレイカードの各ポートに100μlのPCR反応ミックスを分注する。 </li><li> 1分間カード2×1,000×gでの遠心。カードを密封し、アプライドバイオシステムズマニュアルと384ウェルタックマン低密度アレイ設定でプライマーを用いて提供されるテンプレートを使用してそれを実行する。私たちは、アプライドバイオシステムズ7900HT FastリアルタイムPCRシステムを使用しています。 </li></ol> 4。タックマンよるmRNA分析（〜1.5時間） <ol><li>定量PCR反応を準備するには、グラフ内の順序で反応成分を混ぜる。全てのサンプルを正規化遺伝子として、目的の遺伝子、並びに18S rRNAのためのプライマーのプローブを用いて分析する。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> タックマンの反応成分 </td><td> 1サンプルのボリューム </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 7液（個々のサンプルに基づいて調整します） </td></tr><tr><td>タックマンFASTマスターミックス（2X） </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>タックマンのプライマープローブ（20倍） </td><td> 1μlの</td></tr><tr><td> 100ngのRNAからのcDNA </td><td> 2＆ムー、L（個々のサンプルに基づいて調整します） </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li>メーカー（バイオシステムズ7900HT FastリアルタイムPCRシステムを適用）により推奨されているように速い96ウェルブロックを使用して96ウェルプレートを実行します。 </li></ol>

<ol>
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P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li><li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNA:+A+new+source+of+biomarkers.">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li><li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li><li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta+2012:+database+of+exosomal+proteins,+RNA+and+lipids.">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルでは、我々は、血液や文化メディアからの差動遠心分離により精製エキソソームからのmiRNAとmRNAの定量化を示しています。エキソソームは、その起源に依存して様々な構成要素を有し、免疫応答、抗原提示細胞内通信、RNAおよびタンパク質9,11,12,19,20の伝達を含む生物学的機能の数に関与している。大きさや形状はエキソソーム純度の行列ですが、EMのエキソソームの?...

短い非コードmiRNAは、標的mRNAに結合することによって遺伝子発現を調節する。 〜7塩基対の種子配列相補性は、標的タンパク質1の発現低下をもたらすことができ、どちらも翻訳の阻害またはmRNAの安定性の低下を生じる標的mRNAに結合したmiRNAを可能にする。過去10年間の研究では、明確に細胞機能を仲介におけるmiRNAのための基本的な役割を証明しています。また、様々な疾患2,3の根底に miRNAを媒介分子の変化を解剖に向けかなりの努力がなされている。さらに、体液4-6の安定したmiRNAの最近の識別は臨床診断に適した新規バイオマーカーとしての使用のために道を開いた。 体液におけるmiRNAトランスの一態様は、全身の血液circulat経由受容細胞にエキソソーム、mRNAを運ぶ小胞、タンパク質、脂質メディエーター、およびmiRNAを介して行われるイオン7月14日 。このレシピエント細胞における遺伝子発現の調節をもたらし、セルラー通信の新たなメカニズムを表す。例えば、細胞は、増殖因子-β5を（TGFβ5）変換、インターロイキン-1β（IL1β）、腫瘍壊死因子α（TNFα）などの炎症に関与する生体分子を含有する分泌および/または吸収するエキソソームによって免疫調節過程を調節することができると13これらの遺伝子を調節するmiRNA。異常なmiRNA発現は、ヒトの疾患の様々な共通の特徴であるように、これらの分子は、新規治療標的2の発見と検証のためのエキサイティングな新しい機会を提供しています。 循環miRNAは、すべての体液中に存在し、それはエキソソームの組成物は、それらが解放された元のソースセルに基づいて異なることが知られている。こうして彼らは、細胞の生理学的状態を研究するための道を提供し、どのように細胞があってもシグナリングALTER疾患を含むストレスに対する応答のTS。エキソソーム組成物中の変化を研究することは、シグナル伝達への洞察を提供し、バイオマーカーや治療的介入路線としての潜在的有用性を調べることができます。 ここでは、公開プロトコルに基づいて、複数のソースからのエキソソームの精製のデモンストレーションを行います。これらのエキソソームは、RNA単離のために使用されるエキソソーム中に存在するmiRNAのレベルを識別し、測定するために定量PCRを行った。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

安定したmiRNAは、すべての体液中に存在し、いくつかの循環miRNAはエキソソームと呼ばれる小さな小胞に隔離による分解から保護されています。エキソソームは、標的細胞にRNAおよびタンパク質の転写をもたらす形質膜と融合することができる。彼らの生物学的機能は、免疫応答、抗原提示、および細胞内の通信が含まれています。血液を介した受容細胞における遺伝子発現を調節することができるmiRNAの配信では、ターゲットの介入のための新たな道を開いた。薬物またはRNA治療剤の送達のための戦略を提供するだけでなく、エキソソーム内容は、治療の選択肢と予後を決定する、診断に役立つことができるバイオマーカーとして役立つことができる。 ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームはEXOSためウェスタンブロット分析を用いて特徴づけされます関心のmRNAのためのOMALマーカーとPCR。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。 これらのプロトコルは、薬理学的介入の前と後の患者、げっ歯類モデルおよび細胞培養培地中のエキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができる。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。当社の代表的なデータを示してVマウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製したエキソソームに存在するmiRNAでのariations。 ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームは、関心のあるmRNAのためのエキソソームマーカーおよびPCRのためのウェスタンブロット分析を用いて特徴付けられる。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。 これらのプロトコルは、エキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができるiの薬理学的介入の前と後のn個の患者、げっ歯類モデル及び細胞培養培地。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。我々の代表的なデータは、マウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製エキソソーム中に存在するmiRNAの変化を示す

血液や細胞培養培地からエキソソームを分離した後、エキソソームの純度は、電子顕微鏡（EM）とウェスタンブロット（ 図1Aおよび1B）によってテストすることができます。私たちは、EMと複数の抗体を用いてウェスタンブロットで、さまざまなソースからの私達のエキソソームの準備を確認した。 図1Aは、エキソソームは〜の直径30〜100ナノメートルで?...

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Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。

血と文化メディア由来エキソソームの精製およびマイクロRNAプロファイリング

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K ビュー.  Drexel University College of Medicine. エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA含有エキソソームの単離と解析

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Purification of Platelets from Mouse Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), and plasma proteins. We describe here purification of platelets from mouse blood using three-fold more iohexol gradient medium relative to blood sample volume and centrifugation in a swinging bucket rotor at 400 x g for 20 min at 20 &#176;C. The recovery/yield of the purified platelets were 18.2-38.5%, and the purified platelets were in a resting state, which did not contain any significant number of RBC and WBC. The purified platelets treated with thrombin showed up to 93% activation, indicating their viability. We confirmed that the purified platelets are sufficiently pure using flow cytometric and microscopic evaluation. These platelets can be used for gene expression, activation, granule release, aggregation, and adhesion assays. This method can be used for purification of platelets from the blood of other species as well.

Here, mouse blood was collected in the presence of an anti-coagulant. The platelets were purified by iohexol gradient medium using low speed centrifugation. The platelets were activated with thrombin to investigate if they were viable. The quality of the purified platelets was analyzed by flow cytometry and microscopy.

マウスの血液からの血小板の浄化

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...