Diese Studie wurde durch Mittel aus Rita Allen Foundation Zuschuss für Seena Ajit unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Erika Balogh und Dr. Soumitra Ghoshroy von der University of South Carolina Electron Microscopy Center for Instrument Gebrauch, wissenschaftliche und technische Unterstützung zu bestätigen.

Alle Experimente mit Blutproben von Menschen und Nagetiere wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Menschliche Probanden wurden nach der Einwilligung durch den Drexel University College of Medicine Institutional Review Board und allen Verfahren durchgeführten Studien an Tieren wurden von Institutional Animal Care Drexel und benutzen gebilligten eingeschrieben. 1. Exosome Reinigung von Blut (~ 5,5 h) TIPPS <ul><li class="jove_content"> Wir suspendieren exosomes von einem Röhrchen Blut (~ 10 ml menschlichem Blut und ~ 2 ml Blut der Maus) in 300 ul RNA Lysepuffer vom mirVana miRNA Isolation Kit. </li><li class="jove_content"> Um exosomes von Zellkulturmedien zu reinigen, wird das Medium bei 500 × g für 10 min zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und durch einen 0,22 um Filter nach Zentrifugation mit 12.000 x g filtriert. Die exosome Reinigung aus Zellkulturmedienerfordert keine Verdünnung in PBS, das PBS waschen oder die zweite Ultrazentrifugation. </li><li class="jove_content"> Wenn die gereinigten exosomes für Proteomstudien verwendet wird, das Hinzufügen eines Saccharosegradientenzentrifugation Schritt nach der Ultrazentrifugation wird der Anteil der Proteinaggregate und Verunreinigungen 15. </li><li class="jove_content"> Die beobachtete Morphologie exosomes kann sich je nach der Quelle und der Verarbeitungsschritte für TEM. Konnten wir nicht beobachten die schalenförmigen Morphologie für Exosomen, die zuvor auf Unterschiede in Probenaufbereitung 9,15 zugeschrieben. Unsere TEM-Bilder einschließlich der Immunogoldmarkierung sind ähnlich zu früheren Berichten aus verschiedenen Quellen, einschließlich Blut, Galle und kortikalen Kultur abgeleitet exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Umkehren EDTA beschichtete Röhrchen mit dem Blut und 5x Platz stehend bei Raumtemperatur für 10-60 min. </li><li> Zentrifuge bei 2.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li&gt; <li> Sammeln Sie die obere Schicht, das Plasma, in 15 ml-Röhrchen und halten auf dem Eis. </li><li> Verdünnte Flüssigkeit mit einem gleichen Volumen von PBS. Zentrifuge 30 min bei 2.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Übertragen in Zentrifugenröhrchen, fügen 1X PBS für ein Gesamtvolumen von 24 ml und zentrifugiert 45 min bei 12.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Transfer zum Röhren Ultrazentrifuge zentrifugiert 2 h bei 110.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Pellet in PBS und zentrifugieren 1 Stunde bei 100.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Pellet in geeigneten Puffer (RNA Lysepuffer). </li><li> Resuspendieren in PBS oder RIPA Puffer für Elektronenmikroskopie und Western-Blot-Analyse sind. </li></ol> 2. RNA Aufreinigung mithilfe eines modifizierten mirVana miRNA Isolation Kit (~ 1 Stunde) TIPPS <ul><li class="jove_content"> Bereiten Sie den Bereich für die Isolierung von RNA durch das Tragen der persönlichen Schutzausrüstung (PSA), Wischflächen und Pipetten mit RNase Zap und mit sterilen Spitzen mit Filter und Rohre. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Obwohl das Protokoll vom Verkäufer bietet die Möglichkeit der Reinigung nur miRNA, die wir immer isolieren Gesamt-RNA einschließlich mRNA und miRNA, so dass wir beide aus der gleichen Probe zu studieren. </li><li class="jove_content"> Hinzufügen eines On-Column-DNase Behandlungsschritt entfernt Spuren von DNA, die vorliegen können. Je nach Quelle der exosomes hat DNA wurde berichtet, dass in exosomes von einigen Quellen einschließlich Maus und Mensch Mastzelllinien 8 aber chromosomale DNA-Sequenzen in exosomes von Medien von kultivierten Kardiomyozyten 18 gereinigt erkannt gereinigt fehlen. </li><li class="jove_content"> Wir reduziert das Volumen der Waschlösung 1 bis 350 ul (Schritt 2.4 unten), weil der Verkäufer liefert nur genug Waschlösung 1 für eine 700 ul hinaus. Wenn das Volumen nicht reduziert wird, gibt es nicht genügend Lösung für die Verwendung der gesamten Inhalte der links. Verbleibenden Schritte wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. </li></ul><ol><li> In 1/10 volumen von miRNA Homogenat Additive (30 ul) und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Auszug mit einem Volumen von Säure-Phenol: Chloroform gleich dem anfänglichen Lysat Volumen. Zentrifuge und wieder das obere Phase in ein frisches Röhrchen. </li><li> In 1,25 Vol. 100% Ethanol (375 ul). Vortex. Übernehmen, um Patrone filtern und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. </li><li> Fügen Sie die Hälfte der empfohlenen Menge miRNA Waschlösung 1 (350 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. </li><li> In 10 ul DNase 1 bis 70 ul Puffer RDD (Qiagen) für jede Probe. In 80 ul bis Spalte und Inkubation 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> In Wash Solution 1 (350 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. </li><li> In Wash Solution 2/3 (500 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. Zu wiederholen. </li><li> Eluieren mit 40 ul 95 ° C Nuklease-freiem H 2 O. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der RNA und RNA verdünnen bis 100 ng / ul. </li></ol> 3. miRNA Profiling von Exosomen von Blood TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten (~ 6,5 h) TIPPS <ul><li class="jove_content"> Bereiten Sie den Bereich für die Isolierung von RNA durch das Tragen von PSA, Wischflächen und Pipetten mit RNase Zap und mit sterilen Spitzen mit Filter und Rohre. </li><li class="jove_content"> Vorverstärkung (Pre-Amp) Schritt für 1-350 ng RNA (350-1,000 ng Proben erfordern keine Pre-Amp Schritt nach cDNA-Synthese) empfohlen. Es ist wichtig, um festzustellen, ob Pre-Amp, die für Ihre Probe ist, weil man alle Proben unter gleichen Bedingungen behandeln müssen. Pre-Amp-Schritt erhöht die Kosten und die Ct-Werte haben eine geringere akzeptabel abgeschnitten (32 statt 40). </li><li class="jove_content"> Es ist zweckmäßig, die Reaktion in cDNA Streifen Rohre anstelle Vorbereitung einer Platte abhängig von der Anzahl der Karten, die in einem einzigen Tag ausgeführt werden kann. Dies minimiert Gefrier-Tau von cDNA-Proben, die nicht am selben Tag verarbeitet wird. </li><li class="jove_content"> Exosomen aus verschiedenen Quellen gesammelt haben unterschiedmieten RNA-Mengen. Dieses Protokoll ermöglicht ein Maximum von 3 ul RNA-Matrize für die cDNA-Synthese-Reaktion. Je nach Quelle, die Höhe der exosomalen RNA, isoliert werden können vielleicht beschränkt. Während eine typische Gewebe genug wäre, dass RNA-Ausbeute von 100 ng cDNA RNA in 3 ul Volumen Exosomen aus menschlichem Blut oder Zellkulturmedien gemacht werden würde enthalten oft weniger RNA und cDNA müssen aus weniger Ausgangsmaterial hergestellt werden. Maus Blut exosomes einen höheren Gehalt an RNA und mindestens 100 ng in 3 ul erhalten werden kann. </li></ul><ol><li> Zur Herstellung von cDNA aus RNA gereinigt mit Megaplex Pools Reverse-Transkriptase-Primer (Pool A und Pool B enthalten Primer für die miRNAs auf mikrofluidischen Karten Array A und B), tauen die Reaktionskomponenten auf Eis. </li><li> Label zwei RNase-freies 1,5 ml Röhrchen für RT-Reaktion mit Pool A Primer oder Pool B Primer und Komponenten hinzufügen, um in der Tabelle. Fügen Sie mindestens ein zusätzliches Volumen von Komponenten für 2 oder mehr Reaktionen oder machen einen Master-Mix durch t empfohlener Anbieter. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT-Reaktion Bauteile </td><td> Komponente Konzentration </td><td> Volume 1 Probe (insgesamt V / Probe = 4,5 ul) </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td></td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT-Puffer (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 ul </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 4.4 mM </td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 5 mM </td><td> 0,90 ul </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0,10 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer A oder B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 ul </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transkriptase </td><td> 75 U </td><td> 1.50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Umkehren Rohre 6 mal und Centrifuge kurz. Dann Pipette 4,5 ul RT-Reaktion Mischung in MicroAmp 8er Strips oder eine 96-Well-Platte MicroAmp optische Reaktion. </li><li> In 100 ng RNA und die Lautstärke zu 3 ul mit DEPC behandeltem Wasser oder fügen Sie 3 ul Gesamt-RNA, rühren mit der Pipettenspitze und dichten die Gefäße oder Teller. Spin kurz und Inkubation auf Eis für 5 min. </li><li> Legen Sie die Reaktion in der PCR-Maschine und führen Sie es unter den folgenden Bedingungen (wie von der Applied Biosystems Megaplex Pools Protokoll empfohlen): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bühne </td><td> Temp </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Zyklus (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 Sek. </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Bewahren cDNA bei -20 ° C (gut für mindestens eine Woche) oder weiterhin pre-Amp Schritt, der für eine Woche gespeichert werden können. </li><li> Auftauen PreAmp Primer für Pool A und Pool B auf Eis und invertieren zu mischen. Swirl Taqman Pre-Amp Master mischen und halten auf dem Eis auch. </li><li> Folgen Sie dem Chart Zugabe von mindestens einem zusätzlichen Volumen von Komponenten für 2 oder mehr Reaktionen oder machen einen Master-Mix als vom Hersteller empfohlen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Pre-Amp Reaction Bauteile </td><td> Volume 1 Probe </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7,5 ul </td></tr><tr><td> Taqman PreAmp Master Mix (2X) </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primer A oder B (10X) </td><td> 2,5 ul </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipette 2,5 ul RT product in MicroAmp 8er Strips oder eine 96-Well-Platte MicroAmp optische Reaktion und verzichtet 22,5 ul PreAmp Reaktionsmix in jede Vertiefung. </li><li> Verschließen Sie die Platte, auf Eis 5 min inkubieren und laden Sie dann die Probe in der PCR-Maschine. Führen Sie unter den folgenden Bedingungen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bühne </td><td> Temp </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Zyklus (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sec </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 99,9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Nachdem die Reaktion beendet Preamp, kurz zentrifugieren oder Platte und fügen Sie dann 75 ul 0,1 X TE pH 8,0 in jede Vertiefung oder Rohr. </li><li> Seal und mischen und kurz drehen. Bewahren Sie das verdünnte Produkt für eine Woche bei -20 ° C oder weiter auf die Platte laden. </li><li> Kombinieren Sie die folgenden in einem RNase-freies 1,5 ml Röhrchen auf Eis. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bauteile </td><td> Volume 1 Karte </td></tr><tr><td> Taqman Universal-PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> Das verwässerte Preamp Produkt </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 441 ul </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Kehren Sie die Röhre zu mischen und kurz zentrifugieren. Je 100 ul PCR-Reaktionsmischung in jedem Hafen der TaqMan MicroRNA Array Karte. </li><li> Zentrifuge die Karte 2 x 1.000 g für 1 min. Verschließen Sie die Karte und führen Sie es mit der Vorlage mit den Primer in der Applied Biosystems Handbuches und der 384er Taqman Low Density Array-Einstellungen werden zur Verfügung gestellt. Wir verwenden Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time-PCR-System. </li></ol> 4. mRNA-Analyse von TaqMan (~ 1,5 h) <ol><li> Um qPCR Reaktion vorzubereiten, mischen Sie die Reaktions-Komponenten in der Reihenfolge in der Tabelle. Alle Proben werden mit Primer-Sonden für das Gen von Interesse sowie 18S rRNA-Gen als normalizer analysiert werden. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Taqman Reaction Bauteile </td><td> Volume 1 Probe </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7 ul (Anpassung auf der Grundlage individueller Probe) </td></tr><tr><td> Taqman Schnelle Master Mix (2X) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Taqman Primer-Sonden (20x) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> cDNA von 100 ng RNA </td><td> 2 &amp; mu; L (Anpassung auf der Grundlage individueller Probe) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Führen Sie die 96-Well-Platte mit der Fast-96-Well-Block, wie vom Hersteller (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System) empfohlen. </li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll, zeigen wir die Quantifizierung von miRNAs und mRNAs von Exosomen durch differentielle Zentrifugation von Blut-und Kulturmedien gereinigt. Exosomen haben diverse Komponenten abhängig von ihren Ursprungs sind und in einer Reihe von biologischen Funktionen, wie Immunreaktion, Antigenpräsentation, intrazelluläre Kommunikation und die Übertragung von RNA und Proteinen 9,11,12,19,20 beteiligt. Während Größe und Form ist eine Determinante der exosome Reinheit, zeigen eine Reihe von Papier...

Kurze kodierenden miRNAs die Genexpression durch Bindung an die Ziel-mRNA. Seed Sequenzkomplementarität von ~ 7 Basenpaaren ermöglicht miRNA in die Ziel-mRNA, was zur Inhibierung der Translation oder Verringerung der Stabilität der mRNA, die beide in einer verminderten Expression des Zielproteins 1 Ergebnis binden können. Forschung in den letzten zehn Jahren hat eindeutig eine fundamentale Rolle für miRNAs bei der Vermittlung zellulärer Funktionen bewährt. Es hat auch erhebliche Anstrengungen zur Sezieren miRNA vermittelten molekularen Veränderungen zugrunde liegen verschiedene Krankheiten 2,3 gerichtet. Außerdem ebnete kürzliche Identifizierung von stabilen miRNAs in Körperflüssigkeiten 4-6 den Weg für ihre Verwendung als neue Biomarker zugänglich klinische Diagnose. Ein Modus von miRNA Transport in Körperflüssigkeiten ist via Exosomen, kleine Bläschen, die mRNAs tragen, Proteine, Lipidmediatoren und miRNAs an Empfänger Zellen über systemische Blut zirkulierendenion 7-14. Dies führt in der Modulation der Genexpression in Zellen des Empfängers und stellt einen neuen Mechanismus der zellulären Kommunikation. Zum Beispiel können Zellen modulieren immun-regulatorischen Prozesse durch Sekretion und / oder absorbierenden exosomes Biomoleküle enthaltenden in Entzündungen wie Interleukin-1β (IL1 &amp;bgr;), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) beteiligt, transformierender Wachstumsfaktor-β5 (TGFβ5) und die miRNAs, dass diese Gene regulieren 13. Wie aberrante miRNA Expression ist ein gemeinsames Merkmal in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, bieten diese Moleküle spannende neue Möglichkeiten für die Entdeckung und Validierung neuer therapeutischer Targets 2. Zirkulierende miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der verschiedenen exosomes ist, basierend auf den Source-Zellen, von denen sie gelöst. So bieten sie einen Weg, um den physiologischen Zustand der Zellen zu untersuchen und wie die Zellen zu verändern, auch Signalisierungts in Reaktion auf Stress einschließlich Krankheiten. Studieren Änderungen in exosome Zusammensetzung kann Einblick in die Signaltransduktion stellen und untersuchen ihr Potential als Biomarker Dienstprogramm oder therapeutische Intervention Routen. Hier zeigen wir Ihnen die Reinigung von Exosomen aus mehreren Quellen auf veröffentlichten Protokollen. Diese exosomes wird für RNA-Isolierung durch qPCR gefolgt zu identifizieren und zu messen, die von miRNAs in den Exosomen verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

Stabile miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und einige zirkulierenden miRNAs sind vor dem Abbau durch Sequestrierung in kleine Bläschen genannt exosomes geschützt. Exosomen mit der Plasmamembran, die zur Übertragung von RNA und Proteine ​​an die Zielzelle fusionieren. Ihre biologische Funktionen umfassen Immunantwort Antigenpräsentation und intrazelluläre Kommunikation. Versand von miRNAs die Genexpression in den Empfänger-Zellen über das Blut regulieren kann hat neuartige Wege für die Ziel-Intervention eröffnet. Neben dem Angebot einer Strategie für die Verabreichung von Medikamenten oder RNA Therapeutika können exosomalen Inhalt als Biomarker, die bei der Diagnose helfen, Bestimmung Behandlungsmöglichkeiten und Prognose dienen können. Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exos werdenomal Marker und PCR für mRNAs von Interesse. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren. Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs in Patienten, Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention zu quantifizieren. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen variations in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt. Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exosomalen Marker und PCR für mRNAs von Interesse sein. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren. Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs quantifizieren in Patienten Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen Variationen in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt

Nach der Trennung von Exosomen aus Blut oder Zellkulturmedien, kann die Reinheit der Exosomen durch Elektronenmikroskopie (EM) und Western-Blot (1A und 1B) getestet werden. Wir bestätigten unsere exosome Präparate aus verschiedenen Quellen mit EM und Western-Blot unter Verwendung mehrerer Antikörper. 1A zeigt EM-Aufnahmen bestätigen, dass exosomes intakt mit einem Durchmesser von ~ 30 -100 nm und enthalten von CD81 Immungoldmarkierung. Häufig verwendete exosomalen ...

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Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K Aufrufe.  Drexel University College of Medicine. Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Serie: Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Purification of Platelets from Mouse Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), and plasma proteins. We describe here purification of platelets from mouse blood using three-fold more iohexol gradient medium relative to blood sample volume and centrifugation in a swinging bucket rotor at 400 x g for 20 min at 20 &#176;C. The recovery/yield of the purified platelets were 18.2-38.5%, and the purified platelets were in a resting state, which did not contain any significant number of RBC and WBC. The purified platelets treated with thrombin showed up to 93% activation, indicating their viability. We confirmed that the purified platelets are sufficiently pure using flow cytometric and microscopic evaluation. These platelets can be used for gene expression, activation, granule release, aggregation, and adhesion assays. This method can be used for purification of platelets from the blood of other species as well.

Here, mouse blood was collected in the presence of an anti-coagulant. The platelets were purified by iohexol gradient medium using low speed centrifugation. The platelets were activated with thrombin to investigate if they were viable. The quality of the purified platelets was analyzed by flow cytometry and microscopy.

Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...