Este estudo foi apoiado por fundos de Rita Allen doação da Fundação para Seena Ajit. Os autores gostariam de agradecer Erika Balogh e Dr. Soumitra Ghoshroy da Universidade da Carolina do Sul Centro de Microscopia Eletrônica para o uso do instrumento, assistência técnica e científica.

Todos os experimentos com amostras de sangue de humanos e roedores foram executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Seres humanos foram registrados após o consentimento informado aprovado pela Drexel University College of Medicine Institutional Review Board e todos os procedimentos de estudos realizados com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Drexel. 1. Purificação exossomo de sangue (~ 5,5 h) DICAS <ul><li class="jove_content"> Nós ressuspender exossomos a partir de um tubo de sangue (~ 10 ml de sangue humano e ~ 2 ml de sangue mouse) em 300 mL de tampão de lise RNA a partir do kit de isolamento miRNA miRvana. </li><li class="jove_content"> Para purificar exosomes de meios de cultura de células, o meio é centrifugado a 500 xg durante 10 min para remover as células e também filtrada através de um filtro de 0,22 um, após centrifugação a 12.000 x g. A purificação exosome de meios de cultura celularnão necessita de diluição em PBS, PBS ou a solução de lavagem do segundo passo de ultracentrifugação. </li><li class="jove_content"> Se forem utilizados os exosomes purificadas para estudos de proteómica, a adição de um passo de centrifugação em gradiente de sacarose após o passo de ultracentrifugação vai diminuir a quantidade de agregados de proteína e contaminantes 15. </li><li class="jove_content"> A morfologia observada de exosomes pode variar de acordo com a fonte e as etapas de processamento para a ETM. Não observamos a morfologia em forma de copo para exossomos, que foi anteriormente atribuído a diferenças no processamento da amostra 9,15. Nossas imagens TEM, incluindo a rotulagem immunogold são semelhantes aos relatos anteriores de diferentes fontes, incluindo sangue, biliar e cultura cortical derivado exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Inverter EDTA tubo de revestimento que contém o sangue de 5x e coloque na posição vertical à temperatura ambiente por 10-60 min. </li><li> Centrifugar a 2.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Recolher a fase superior, o plasma, em tubos de 15 ml e guardar em gelo. </li><li> Dilui-se fluido com um volume igual de PBS. Centrifugar 30 min a 2000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transferir para tubos de centrífuga, adicionar 1X PBS, para um volume total de 24 ml e centrifugar 45 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transfira para os tubos de ultracentrifugação e centrifugar 2 horas a 110.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o pellet em PBS e centrifugar 1 hora a 100.000 x g a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em tampão apropriado (tampão de lise de ARN). </li><li> Ressuspender em PBS ou tampão RIPA para microscopia eletrônica e análise de western blot, respectivamente. </li></ol> 2. Purificação de RNA usando um kit de isolamento miRvana miRNA modificação (~ 1 hora) DICAS <ul><li class="jove_content"> Preparar a área para isolar RNA, usando equipamentos de proteção individual (EPI), limpando superfícies e pipetas com RNase Zap, e usando pontas com filtro estéreis e tubos. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora o protocolo do fornecedor dá a opção de purificação só miRNA, sempre isolar RNA totais, incluindo mRNA e miRNA para que possamos estudar tanto a partir da mesma amostra. </li><li class="jove_content"> Adicionando um passo de tratamento de DNase na coluna remove vestígios de ADN que podem estar presentes. Dependendo da fonte de exosomes, o DNA foi relatado que estavam ausentes em exosomes purificadas a partir de algumas fontes, incluindo o rato e as linhas de mastócitos humanos 8 mas as sequências de ADN cromossómico foram detectados em exosomes purificadas a partir de meios de cultura de cardiomiócitos 18. </li><li class="jove_content"> Nós reduziu o volume de solução de lavagem de 1-350 ul (Passo 2.4), porque o fornecedor disponibiliza apenas suficiente uma solução de lavagem para uma adição de 700 ul. Se o volume não seja reduzido, não há solução suficiente deixada para utilizar todo o conteúdo do kit. Demais etapas foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. </li></ul><ol><li> Adicione 1/10 volume de aditivo miRNA homogeneizado (30 uL) e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Extrai-se com um volume de ácido-fenol: clorofórmio, igual ao volume de lisado inicial. Centrifugar e recuperar a fase superior num novo tubo. </li><li> Adicionar 1,25 volumes de etanol a 100% (375 ul). Vortex. Aplicar para filtro de cartucho e centrifugar 15 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adicione metade do volume de miRNA solução de lavagem recomendado 1 (350 mL) e centrifugar 15 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adicionar 10 ul de DNase 1 a 70 ul de tampão de RDD (Qiagen) para cada amostra. Adicionar 80 ul para a coluna e incubar 15 min temperatura ambiente. </li><li> Adicionar uma solução de lavagem (350 ul) e de centrifugação de 15 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adicionar solução de lavagem de 2/3 (500 mL) e centrifugar 15 s a 10.000 x g. REPEAT. </li><li> Eluir com 40 ul de 95 ° C sem nuclease H2O </li><li> Determinar a concentração de ARN e diluir o ARN a 100 ng / mL. </li></ol> 3. miRNA Profiling de Exosomes de Blood Usando Taqman Low Density Array (TLDA) Cartões (~ 6,5 hr) DICAS <ul><li class="jove_content"> Preparar a área para isolar RNA, vestindo PPE, limpando superfícies e pipetas com RNase Zap, e usando pontas com filtro estéreis e tubos. </li><li class="jove_content"> Pré-amplificação passo (pré-amplificador) é recomendado para 1-350 ng de RNA (350-1,000 amostras ng não requerem passo de pré-amplificador, após a síntese de cDNA). É importante determinar se o pré-amplificador é necessário para a sua amostra porque você deve tratar todas as amostras em condições de igualdade. Passo para pré-amplificador adiciona custo e os valores de Ct mais baixo tem um cut off aceitável (32 em vez de 40). </li><li class="jove_content"> É útil para preparar a reacção de cDNA em tubos em vez de uma tira de chapa de acordo com o número de cartas que pode ser executado num único dia. Isto irá minimizar a congelação-descongelação de amostras de cDNA que não serão processados ​​no mesmo dia. </li><li class="jove_content"> Exossomos provenientes de diferentes fontes têm difealugar quantidades de RNA. Este protocolo permite que um máximo de 3 ul de molde de ARN para a reacção de síntese de cDNA. Dependendo da fonte, a quantidade de RNA exosomal que pode ser isolado talvez limitada. Enquanto um tecido típico renderia o suficiente RNA que cDNA seria feito a partir de 100 ng de RNA em 3 mL de volume, exossomos de sangue humano ou de meios de cultura de células humanas, muitas vezes contêm menos RNA e cDNA deve ser feita a partir de material menos de partida. Rato exosomes sangue contêm níveis mais elevados de RNA e de pelo menos 100 ng em 3 ul pode ser obtida. </li></ul><ol><li> Para preparar cDNA a partir de RNA usando Pools Megaplex purificada primers da transcriptase reversa (Grupo A e Grupo B contêm primers para os miRNAs em cartões microfluídicos matriz A e B), descongelar os componentes de reação no gelo. </li><li> Rótulo dois tubos de 1,5 ml RNase para reação de RT com tanque primers ou Grupo B primários e adicionar componentes a fim gráfico. Adicionar pelo menos um volume adicional de componentes de dois ou mais reacções ou fazer uma mistura principal, tal como recomendado por tele fornecedor. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componentes da reacção RT </td><td> Concentração Componente </td><td> Volume de uma amostra (total V / amostra = 4,5 mL) </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td></td><td> 0,20 mL </td></tr><tr><td> Megaplex tampão RT (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 mL </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 4,4 mM </td><td> 0,20 mL </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 5mM </td><td> 0,90 mL </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0,10 mL </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers A ou B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 mL </td></tr><tr><td> MultiScribe transcriptase reversa </td><td> 75 U </td><td> 1,50 mL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Inverter tubos de 6 vezes e centorifuge brevemente. Em seguida, pipeta de 4,5 ul da mistura de reacção de RT em 8 MicroAmp Tiras de tubo ou uma placa de reacção óptica de 96 poços MicroAmp. </li><li> Adicionam-se 100 ng de RNA e ajustar o volume para 3 mL de água tratada com DEPC ou adicionar 3 ul de RNA total, misture com a ponta da pipeta, e fechar os tubos ou de placas. Girar rapidamente e incubar no gelo por 5 min. </li><li> Carregar a reacção para dentro da máquina de PCR e executá-la sob as seguintes condições (como recomendado pelo protocolo da Applied Biosystems Megaplex Piscinas): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Etapa </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> Ciclo (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 seg </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 4 ° C, </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Armazenar de cDNA a -20 ° C (boa durante pelo menos uma semana), ou continuar a etapa de pré-amplificação que podem ser armazenadas durante uma semana. </li><li> Descongele primers pré-amplificador para o Grupo A e Grupo B no gelo e inverter para misturar. Swirl Taqman Pré-Amp mestre misturar e manter em gelo também. </li><li> Seguir o gráfico de adição de pelo menos um volume adicional de componentes de dois ou mais reacções ou fazer uma mistura principal, tal como recomendado pelo fornecedor. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente Reação Pré-Amp </td><td> Volume de uma amostra </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 7,5 mL </td></tr><tr><td> Taqman Mix Master PreAmp (2X) </td><td> 12,5 mL </td></tr><tr><td> Primers pré-amplificador Megaplex A ou B (10x) </td><td> 2,5 mL </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipetar 2,5 mL RT product MicroAmp em tiras de 8-tubo ou uma placa de reacção óptica de 96 poços e dispensar MicroAmp 22,5 ul da mistura de reacção PreAmp para cada poço. </li><li> Selar a placa, incubar no gelo 5 min e em seguida, coloque a amostra na máquina de PCR. Executar sob as seguintes condições. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Etapa </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Ciclo (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 seg </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 99,9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 4 ° C, </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Após a reacção do pré-amplificador é terminado, centrifugar brevemente os tubos ou as placas e, em seguida, adicionar 75 ul de 0,1 x TE pH 8,0 a cada poço ou tubo. </li><li> Seal e misture e girar rapidamente. Armazenar o produto diluído durante uma semana a -20 ° C, ou continuar a carregar a placa. </li><li> Combinar o seguinte num tubo de 1,5 ml RNase em gelo. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume de um cartão </td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 mL </td></tr><tr><td> Produto pré-amplificador diluído </td><td> 9 mL </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 441 mL </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Inverter o tubo de misturar e centrifugar brevemente. Pipetar 100 ul da mistura de reacção de PCR em cada porta do cartão de matriz MicroRNA Taqman. </li><li> Centrifugar o cartão de 2 x 1.000 xg por 1 min. Selar a placa e executá-lo usando o modelo fornecido com os primers no manual da Applied Biosystems e os Taqman configurações de matriz densidade 384 bem baixa. Usamos Applied Biosystems 7900HT Rápido Real-Time PCR System. </li></ol> 4. Análise por ARNm Taqman (~ 1,5 h) <ol><li> Para preparar a reacção de qPCR, misturar os componentes da reacção, no fim do gráfico. Todas as amostras serão analisados ​​com sondas de iniciadores para o gene de interesse, bem como rRNA 18S como normalizador do gene. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Reacção de componentes Taqman </td><td> Volume de uma amostra </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 7 ul (ajuste com base na amostra individual) </td></tr><tr><td> Taqman rápido Master Mix (2X) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Sondas Taqman iniciadores (20x) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> cDNA a partir de 100 ng de ARN </td><td> 2 &amp; mu, L (ajuste com base na amostra individual) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Executar a placa de 96 poços utilizando o bloco de 96 poços rápida, tal como recomendado pelo fabricante (Applied Biosystems 7900HT Rápido Real-Time PCR System). </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, vamos mostrar a quantificação dos miRNAs e mRNAs de exossomos purificados por centrifugação diferencial dos meios de sangue e cultura. Exosomes têm diversos componentes que dependem da sua origem e estão envolvidos em várias funções biológicas, incluindo a resposta imunológica, a apresentação de antigénio, a comunicação intracelular, bem como a transferência de RNA e proteínas 9,11,12,19,20. Embora a forma e tamanho é um determinante de pureza exossomo, uma série de artigo...

MiRNAs noncoding Curtas modular a expressão do gene por ligação ao ARNm alvo. Semente sequência complementaridade de pares de bases ~ 7 permite miRNA se liguem ao ARNm alvo, resultando na inibição da tradução ou na redução na estabilidade do mRNA, o que pode resultar na diminuição da expressão da proteína alvo 1. Pesquisas na última década tem se mostrado inequivocamente um papel fundamental para miRNAs em mediar funções celulares. Também tem havido considerável esforço dirigido para dissecar miRNA alterações moleculares subjacentes a diversas doenças mediadas por 2,3. Além disso, a recente identificação de miRNAs estáveis ​​em fluidos corporais 4-6 pavimentou o caminho para a sua utilização como novos biomarcadores passíveis de diagnóstico clínico. Um modo de transporte miRNA em fluidos corporais é via exossomos, pequenas vesículas que transportam mRNAs, proteínas, mediadores lipídicos e miRNAs em células receptoras via cir arterial sistêmicaion 7-14. Isto resulta na modulação da expressão de genes em células do receptor e representa um novo mecanismo de comunicação celular. Por exemplo, as células são capazes de modular processos de imuno-regulação através da secreção e / ou absorventes exosomes contendo biomoléculas envolvidas na inflamação, tais como a interleucina-1β (IL1β), factor de necrose tumoral α (TNF), factor de crescimento transformante-β5 (TGFβ5) e os miRNAs que regulam estes genes 13. Como expressão de miRNA aberrante é uma característica comum em uma variedade de doenças humanas, estas moléculas oferecem novas oportunidades para a descoberta e validação de novos alvos terapêuticos 2. Circulating miRNAs estão presentes em todos os fluidos corporais e é sabido que a composição do exosomes é diferente baseada nas células de origem a partir do qual eles foram libertados. Assim, eles oferecem um caminho para estudar o estado fisiológico das células e como as células alteram a sinalização atéts em resposta ao estresse, incluindo doenças. Estudar as alterações na composição exosome pode fornecer insights sobre a transdução de sinal e investigar a sua utilidade potencial como biomarcadores ou rotas de intervenção terapêutica. Aqui vamos demonstrar a purificação de exossomos a partir de várias fontes baseadas em protocolos publicados. Estes exosomes será usado para o isolamento de ARN seguida por qPCR para identificar e medir os níveis de miRNAs presentes nas exosomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

MiRNAs estáveis ​​estão presentes em todos os fluidos do corpo e em alguns miRNAs circulantes são protegidos da degradação por sequestração em pequenas vesículas chamadas exosomes. Exosomes podem fundir com a membrana plasmática que resulta na transferência de RNA e proteínas da célula-alvo. As suas funções biológicas incluem resposta imune, a apresentação de antigénio, e a comunicação intracelular. Entrega de miRNAs que podem regular a expressão do gene em células receptoras através do sangue, abriu novas possibilidades para intervenção alvo. Além de oferecer uma estratégia para a entrega de medicamentos ou agentes terapêuticos RNA, o conteúdo exosomal podem servir como biomarcadores que podem ajudar no diagnóstico, determinar as opções de tratamento e prognóstico. Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para exosmarcadores Omal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse. Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal em pacientes, modelos de roedor e meios de cultura de células antes e após a intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostrar variations em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas. Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para marcadores exosomal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse. Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal in pacientes, modelos de roedores e meios de cultura de células antes e depois da intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostram variações em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas

Após o isolamento exosomes de meios de cultura de sangue ou de células, a pureza das exosomes pode ser testado por microscopia electrónica (ME) e Western blot (Figuras 1A e 1B). Confirmámos a nossa preparação exosome partir de várias fontes com EM e western blot utilizando anticorpos múltiplos. Figura 1A mostra imagens EM confirmando que exosomes estão intactas com um diâmetro de 30 ~ -100 nm e contêm CD81 por imuno rotulagem. Marcadores exosomal comumente ut...

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Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K visualizações.  Drexel University College of Medicine. A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.