이 연구는 리타 알렌 재단 보조금에서 Seena 아지트에 기금에 의해 지원되었다. 저자는 장비 사용, 과학 및 기술 지원을위한 사우스 캐롤라이나 전자 현미경 센터의 대학에서 에리카 Balogh 다음과 박사 Soumitra Ghoshroy을 인정하고 싶습니다.

인간과 설치류의 혈액 샘플을 사용하여 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 사람을 대상으로이 약 기관 검토위원회의 드렉 셀 대학과 동물을 사용하여 수행 연구에 대한 모든 절차 드렉의 기관 동물 관리에 의해 승인 및위원회를 사용했다가 승인 한 동의서를 제공 한 후 등록되었습니다. 1. 혈액에서 Exosome 정화 (~ 5.5 시간) 팁 <ul><li class="jove_content"> 우리는 mirVana의 miRNA의 절연 키트에서 300 μL RNA 용해 버퍼의 혈액 튜브 1 (~ 10 ㎖ 인간의 혈액과 1 ~ 2 ML 마우스 혈액)에서 exosomes를 resuspend을. </li><li class="jove_content"> 세포 배양 매체에서 exosomes을 정화, 미디어 세포를 제거하기 위해 10 분 500 XG에 스핀도 12,000 X g에서 원심 분리 한 후 필터 0.22 μm의를 통해 필터링됩니다. 세포 배양 매체에서 exosome 정화PBS, PBS 세척 또는 제 원심 단계에서 희석이 필요하지 않습니다. </li><li class="jove_content"> 정제 exosomes는 원심 단계 이후 자당 기울기 원심 분리 단계를 추가, 프로테오믹스 연구에 사용되는 경우 단백질 집계 및 오염 물질 (15)의 양을 감소합니다. </li><li class="jove_content"> exosomes의 관찰 형태는 소스와 TEM에 대한 처리 단계 모두에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 이전에 샘플 처리 9,15의 차이에 기인 한 exosomes의 컵 모양의 형태를 관찰하지 않았다. immunogold 라벨 등 우리의 TEM 이미지 exosomes 9,16,17 파생 된 담즙과 대뇌 피질의 문화 혈액 등 서로 다른 소스에서 이전의보고와 비슷합니다. </li></ul><ol><li> 10-60 분 동안 실온에서 수직 배와 장소 혈액을 포함 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 코팅 튜브를 반전. </li><li> 4 ℃에서 15 분 2,000 XG에 원심 분리기 </리&gt; <li> 15 ML 튜브에 꼭대기 층, 플라즈마를 수집하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> PBS의 동일한 볼륨 액을 희석. 4에서 2,000 XG에서 30 분 원심 분리기 ° C. </li><li> 4 ° C.에서 튜브를 원심 분리기 24 ML의 총 볼륨 1X PBS를 추가하고, 12,000 XG에서 45 분 원심 분리로 전송 </li><li> 4 ° C.에 튜브를 원심 분리기와 110,000 XG에서 2 시간을 원심 분리로 전송 </li><li> 을 Resuspend PBS의 펠렛과 4 ℃에서 100,000 XG에서 1 시간 원심 분리 </li><li> 적절한 버퍼를 Resuspend 펠렛 (RNA 용해 버퍼). </li><li> 전자 현미경과 서양 얼룩 분석 각각에 대한 PBS 또는 RIPA 버퍼에 resuspend을. </li></ol> 2. 수정 mirVana의 miRNA의 절연 키트 (~ 1 시간)를 사용하여 RNA 정화 팁 <ul><li class="jove_content"> 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하여 RNA를 분리 RNase의 기력과 표면과 피펫을 닦아, 그리고 살균 필터 팁과 튜브를 사용하기위한 영역을 준비합니다. </li><li클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 공급 업체의 프로토콜은 miRNA의 정화의 옵션을 제공하지만, 우리는 항상 우리가 모두 동일한 시료에서 공부할 수 있도록 mRNA를 포함하여 총 RNA를 분리하고 miRNA의. </li><li class="jove_content"> 에 열 DNase의 처리 단계를 추가하는 것은있을 수있는 DNA의 흔적을 제거합니다. exosomes의 소스에 따라 DNA는 마우스와 인간 비만 세포 라인 8 만 염색체 DNA 서열은 배양 심근 18 미디어에서 정제 exosomes에서 발견 된 등 일부 소스에서 정제 exosomes에없는 것으로보고되었다. </li><li class="jove_content"> 공급 업체는 충분 하나의 700 μl를 추가하기 위해 솔루션 1을 씻으 제공하기 때문에 우리는 세척 용액 1-350 μL (아래 단계 2.4)의 양을 감소. 볼륨이 감소되지 않으면 전체 키트 내용물을 사용하기 위해 남겨 충분한 해결책은 없습니다. 나머지 단계는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행 하였다. </li></ul><ol><li> 1 / 10 VO 추가10 분 동안 얼음에 miRNA의 균질 첨가제 (30 μL)와 부화의 LUME. </li><li> 산성 페놀의 볼륨 추출 초기 해물 양에 해당 클로로포름. 원심과 신선한 튜브 상단 위상을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 1.25 볼륨을 100 % 에탄올 (375 μL)를 추가합니다. 소용돌이. 카트리지를 필터링하고 10,000 X g에서 15 초 원심 분리에 적용됩니다. </li><li> 권장 볼륨 miRNA의 세척 방법 1 (350 μL)의 절반을 추가하고 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기. </li><li> 각 샘플에 대해 10 μL DNase의 1-70 μL 버퍼 RDD (Qiagen의)를 추가합니다. 열을 80 μl를 추가하고 실온에서 15 분 알을 품다. </li><li> 해결 방법 1을 세척 (350 μL) 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기 추가합니다. </li><li> 솔루션을 씻으 추가 2 / 3 (500 μL) 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기. 반복합니다. </li><li> 40 ㎕의 95 용출 ° C nuclease가없는 H 2 O </li><li> RNA의 농도를 결정하고 100 NG / μL로 RNA를 희석. </li></ol> 3. Bloo에서 Exosomes의 miRNA의 프로파일D는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드 (~ 6.5 시간) 사용 팁 <ul><li class="jove_content"> , PPE를 착용하여 RNA를 분리 RNase의 기력과 표면과 피펫을 닦아, 그리고 살균 필터 팁과 튜브를 사용하기위한 영역을 준비합니다. </li><li class="jove_content"> 프리 앰프 (프리 앰프) 단계는 1-350 NG RNA (350-1,000 NG 샘플의 cDNA 합성 후 프리 앰프 단계가 필요하지 않음)을 권장합니다. 그것은 당신이 동등한 조건 하에서 모든 샘플을 처리해야하기 때문에 프리 앰프는 샘플 필요 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 프리 앰프 단계에서 비용을 추가하고의 CT 값은 낮은 허용 컷 오프 (32 대신 40)가있다. </li><li class="jove_content"> 그것은 하루에 실행할 수있는 카드의 수에 따라 접시 대신 스트립 튜브의 cDNA 반응을 준비하는 데 유용합니다. 이 같은 날에 처리되지 않습니다 cDNA를 샘플의 동결 - 해동을 최소화 할 수 있습니다. </li><li class="jove_content"> 서로 다른 소스에서 수집 Exosomes는 diffe가RNA의 양을 임대. 이 프로토콜은 cDNA를 합성 반응에 대한 3 μL RNA 템플릿의 최대 수 있습니다. 소스에 따라 분리 될 수 exosomal RNA의 양이 아마 제한됩니다. 일반적으로 조직의 cDNA은 3 μL 볼륨 100 겨 RNA, 인간의 혈액이나 인간의 세포 배양 매체에서 exosomes 만든 것이라고 충분히 RNA를 얻을 것이지만 종종 작은 RNA를 포함하고 cDNA를이 적은 원료로 만든되어야합니다. 마우스의 혈액 exosomes는 RNA의 높은 수준을 포함​​, 3 μL에서 적어도 100 NG를 얻을 수 있습니다. </li></ul><ol><li> Megaplex 풀을 사용하여 RNA를 정제에서 cDNA를 준비하는 것은 효소의 프라이머 (풀과 풀 B 미세 카드에 miRNA에 대한 프라이머를 포함하는 배열 A와 B) 반대로 얼음에 반응 구성 요소를 녹여. </li><li> 라벨 RT 풀 프라이머 또는 풀 B 프라이머와 반응 차트 순서로 구성 요소를 추가 두 RNase가없는 1.5 ML 튜브. 2 개 이상의 반응에 대한 구성 요소 중 하나 이상 추가 볼륨을 추가 또는 t가 추천하는 마스터 믹스를 만들그는 공급 업체. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT 반응 구성 요소 </td><td> 성분 농도 </td><td> 1 샘플 볼륨 (총 V / 샘플 = 4.5 μL) </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td></td><td> 0.20 μL </td></tr><tr><td> Megaplex RT 버퍼 (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 μL </td></tr><tr><td> dNTPs (100 밀리미터) </td><td> 4.4 mM의 </td><td> 0.20 μL </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 MM) </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 0.90 μL </td></tr><tr><td> RNA 분해 효소 억제제 (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0.10 μL </td></tr><tr><td> Megaplex RT 프라이머 또는 B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 μL </td></tr><tr><td> 역전사 효소를 MultiScribe </td><td> 75 U </td><td> 1.50 μL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 튜브 반전 6 배 센트간단히 rifuge. 그런 다음, 피펫 4.5 마이크로 암페어에 μL RT 반응 혼합 8 튜브 스트립 또는 96 - 웰 마이크로 암페어 광 반응 플레이트. </li><li> RNA 100 NG를 추가하고 DEPC 처리 된 물 3 μL 볼륨을 조절하거나 3 μL 총 RNA를 추가, 피펫 팁 저어, 그리고 튜브 또는 플레이트를 밀봉하십시오. 간단히 스핀, 5 분 동안 얼음에 품어. </li><li> PCR 기계에 반응을로드하고 (같은 적용되는 생물계 Megaplex 풀 프로토콜에 의해 권장) 다음과 같은 조건 하에서 실행 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 사이클 (40X) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 분 </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 초 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 85 ° C </td><td> 5 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> -20 ° C (1 주일 이상 좋은)에서 cDNA를 저장하거나 일주일 동안 저장할 수있는 프리 앰프 단계를 계속합니다. </li><li> 얼음에 풀 및 풀 B를위한 전치 증폭기 프라이머를 해동 및 혼합하는 반전. 소용돌이 TAQMAN 프리 앰프 마스터 믹스도 얼음에 보관하십시오. </li><li> 2 개 이상의 반응에 대한 구성 요소 중 하나 이상 추가 볼륨을 추가 차트를 수행 또는 공급 업체가 추천하는 마스터 믹스를 확인하십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 프리 앰프 반응 구성 요소 </td><td> 1 샘플 볼륨 </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td> 7.5 μL </td></tr><tr><td> TAQMAN 전치 증폭기 마스터 믹스 (2X) </td><td> 12.5 μL </td></tr><tr><td> Megaplex 전치 증폭기 프라이머 또는 B (10X) </td><td> 2.5 μL </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> 피펫 2.5 μL RT produ의CT 마이크로 암페어에 8 튜브 스트립 또는 96 - 웰 마이크로 암페어 광 반응 플레이트와 각 우물에 22.5 μL 전치 증폭기 반응 믹스를 분배. </li><li> 얼음 5 분에 배양 플레이트를 밀봉 한 후 PCR 기계로 샘플을로드합니다. 다음과 같은 조건에서 실행됩니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 95 ° C </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 55 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 72 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td> 사이클 (12 배) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 초 </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 99.9 ° C </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> 프리 앰프 반응이 완료된 후, 간단히 튜브 또는 플레이트를 원심 분리 한 후 각각의 well 또는 튜브에 75 μL 0.1X TE 산도 8.0을 추가합니다. </li><li> 밀봉 혼합하고 짧게 스핀. -20 ° C에서 일주일 동안 희석 된 제품을 저장하거나 접시를로드 할에 계속합니다. </li><li> 얼음 RNase가없는 1.5 ML 튜브에 다음을 결합합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 1 카드의 볼륨 </td></tr><tr><td> TAQMAN 범용 PCR 마스터 믹스, 아니 AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 μL </td></tr><tr><td> 희석 프리 앰프 제품 </td><td> 9 μL </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td> 441 μL </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> 혼합하고 간단히 원심 분리 튜브를 반전. 의 TaqMan 마이크로 RNA 배열 카드의 각 포트에 100 ㎕의 PCR 반응 믹스를 분배. </li><li> 1 분 카드 2 개 1,000 XG에 원심 분리기. 카드를 봉인하고 응용 Biosystems의 설명서와 384도 TAQMAN 저밀도 어레이 설정에서 프라이머와 함께 제공되는 템플릿을 사용하여 실행합니다. 우리는 적용되는 생물계 7900HT 빠른 실시간 PCR 시스템을 사용합니다. </li></ol> 4. TAQMAN (~ 1.5 시간)으로 분석 mRNA의 <ol><li> qPCR의 반응을 준비하려면 차트의 순서로 반응 구성 요소를 섞는다. 모든 샘플은 노말 유전자와 같은 관심뿐만 아니라, 18S rRNA의의의 유전자에 대한 프라이머 프로브로 분석됩니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 의 TaqMan 반응 구성 요소 </td><td> 1 샘플 볼륨 </td></tr><tr><td> 핵산이없는 물 </td><td> 7 μL (각 샘플에 따라 조정) </td></tr><tr><td> TAQMAN 빠른 마스터 믹스 (2X) </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 의 TaqMan 프라이머 프로브 (20X) </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 100 NG RNA로부터 cDNA를 </td><td> 2 &amp; 무, L (개별 샘플에 따라 조정) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> 제조 (바이오 시스템 7900HT 빠른 실시간 PCR 시스템을 적용)에서 권장하는대로 빠른 96도 블록을 사용하여 96 웰 플레이트를 실행합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease.">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148 (2008).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282 (2011).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+RNAs:+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication.">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li><li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors.">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li><li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication.">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 44, 11-15 (2012).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).</li><li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia.">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li><li>Faur&#233;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones.">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li><li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA/RNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells.">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653 (2012).</li><li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+proteomic+insights+and+diagnostic+potential.">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo.">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li><li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li><li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNA:+A+new+source+of+biomarkers.">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li><li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li><li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta+2012:+database+of+exosomal+proteins,+RNA+and+lipids.">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜에서는, 우리는 혈액과 문화 미디어 차등 원심 분리하여 정제 exosomes에서의 miRNAs과의 mRNA의 정량을 보여줍니다. Exosomes는 그들의 기원에 의존 다양한 구성 요소가 면역 반응, 항원 제시 세포 내 통신 및 RNA와 단백질 9,11,12,19,20의 전송을 포함한 생물학적 기능의 숫자에 참여하고 있습니다. 크기와 모양이 exosome 순도의 결정이지만, EM에게 exosomes의 데이터를 표시 논문의 숫자는이 ...

짧은 비 암호화의 miRNAs는 대상의 mRNA에 결합하여 유전자 발현을 조절. ~ 7 기본 쌍의 씨앗 시퀀스 보완은 번역의 억제 또는 대상 단백질 1의 감소 표현 될 수 있습니다 둘 다의 mRNA의 안정성 감소의 결과로 대상의 mRNA에 결합하는 miRNA의 수 있습니다. 지난 10 년간 연구 명백하게 세포 기능을 중재에 miRNA에 대한 근본적인 역할을 입증했다. 또한 각종 질병에게 2,3 기본 miRNA의 매개 분자 변화를 해부쪽으로 이동 상당한 노력이 있었다. 또한, 체액 4-6에서 안정 miRNAs는 최근 식별 임상 진단 의무 새로운 바이오 마커 등의 사용에 대한 방법을 용이하게했다. 체액의 miRNA의 전송 모드 하나는 조직의 혈액 circulat를 통해받는 세포에 exosomes, mRNA를 운반 작은 소포, 단백질, 지질 매개체, 그리고 miRNA에 경유이온 7-14. 받는 사람 세포에서 유전자 발현의 변조,이 결과는 세포 통신의 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 예를 들어, 세포 성장 인자-β5 (TGFβ5)를 변환, 분비 및 / 또는 인터루킨-1β (IL1β), 종양 괴사 인자-α (TNFα)와 같은 염증과 관련된 생체 분자를 포함하는 흡수 exosomes가 면역 조절 과정을 조절하고 있습니다 이러한 유전자에게 13 조절하는 miRNA에. 탈선 miRNA의 발현은 인간의 질병의 다양한 일반적인 기능이기 때문에, 이러한 분자는 새로운 치료 표적 (2)의 발견과 검증을위한 새롭고 흥미로운 기회를 제공합니다. 순환의 miRNAs의 모든 체액에 존재하며 그것은 exosomes의 조성이 발매 된에서 원본 셀에 따라 다른 것으로 알려져있다. 따라서 그들은 세포의 생리적 상태를 연구하는 수단을 제공하는 방법과 세포도 신호 alter입니다질병 등 스트레스 님의 질문에 답변 TS. exosome 구성의 변화를 공부하는 것은 신호 전달에 대한 통찰력을 제공하고 생체 또는 치료 적 개입 경로로 자신의 잠재력 유틸리티를 조사 할 수 있습니다. 여기 게시 된 프로토콜에 따라 여러 소스에서 exosomes의 정화를 보여줍니다. 이러한 exosomes는 exosomes에 존재하는 miRNA에의 수준을 파악하고 측정하는 qPCR에 이어 RNA 분리에 사용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

안정되어있는 miRNA의 모든 체액에 존재하는 어떤 순환의 miRNAs는 exosomes라는 작은 소포에 격리에 의해 분해로부터 보호됩니다. Exosomes는 대상 세포에 RNA와 단백질의 이동의 결과 세포막과 융합 할 수 있습니다. 자신의 생물학적 기능은 면역 반응, 항원 프레 젠 테이션 및 세포 통신을 이용하실 수 있습니다. 혈액을 통해받는 사람 세포에서 유전자 발현을 조절할 수있는 miRNA의 배달 대상의 개입에 대한 새로운 길을 열었습니다. 약물이나 RNA 치료제의 전달을위한 전략을 제공 할뿐 아니라, exosomal 내용은 처리 옵션 및 예후를 결정하는 진단에 도움이 될 수 있습니다 생체 역할을 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes는 EXOS을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다관심의 mRNA에 대한 OMAL 마커와 PCR. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다. 이러한 프로토콜은 약물 개입 전후 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터는 V 표시miRNA에있는 ariations 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 제시한다. 여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes의 관심의 mRNA에 대한 exosomal 마커와 PCR을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다. 이러한 프로토콜은 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수있는 전약물 개입 전후 N 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터의 miRNAs의 변화 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 존재하는 표시

혈액이나 세포 배양 매체에서 exosomes를 분리 한 후, exosomes의 순도는 전자 현미경 (EM)와 서양 얼룩 (그림 1A와 1B)에서 테스트 할 수 있습니다. 우리는 EM 여러 항체를 사용하여 서양 얼룩으로 다양한 소스로부터 우리 exosome 준비를 확인했다. 그림 1A는 exosomes는 ~의 직경 30 ~ 100 m로 그대로이며, immunogold 라벨로 CD81를 포함하는 것을 확인 EM 이미지를 보여줍니다. 일반적으로 사?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media at JoVE.com

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K 조회수.  Drexel University College of Medicine. exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

비디오: Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Purification of Platelets from Mouse Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), and plasma proteins. We describe here purification of platelets from mouse blood using three-fold more iohexol gradient medium relative to blood sample volume and centrifugation in a swinging bucket rotor at 400 x g for 20 min at 20 &#176;C. The recovery/yield of the purified platelets were 18.2-38.5%, and the purified platelets were in a resting state, which did not contain any significant number of RBC and WBC. The purified platelets treated with thrombin showed up to 93% activation, indicating their viability. We confirmed that the purified platelets are sufficiently pure using flow cytometric and microscopic evaluation. These platelets can be used for gene expression, activation, granule release, aggregation, and adhesion assays. This method can be used for purification of platelets from the blood of other species as well.

Here, mouse blood was collected in the presence of an anti-coagulant. The platelets were purified by iohexol gradient medium using low speed centrifugation. The platelets were activated with thrombin to investigate if they were viable. The quality of the purified platelets was analyzed by flow cytometry and microscopy.

마우스 혈액에서 혈소판의 정제

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...