私は、この原稿の重要な読書のための博士ジェシカドミンゲスRiegに感謝します。この作品は、米国心臓協会（サイエンティスト開発グラント10SDG2610034）、米国腎臓学会のカールW.ゴットシャルク研究助成、糖尿病の国立研究所と急性腎傷害の研究のための消化器腎臓病オブライエンセンター（によってサポートされていましたP30DK079337）、および退役軍人局。

1。ソリューション<ol><li> 0.85％塩化ナトリウム：8.5グラムのNaCl / 1リットルのddH 2 O（8.5グラム/ L）。 </li><li> 0.5モル/ L pH7.4のHEPES（のddH 2 Oを0.5 LのHEPESの59.6グラムを溶解し、10 N NaOHを用いてpHを7.4に調整）。 </li></ol> 2。 FITC-イヌリン注射液の調製<ol><li>完全に溶解するまで90℃に加熱して0.85％のNaCl（通常100ミリグラム/ 2ミリリットル0.85％のNaCl）中の5％溶液を調製し、溶解するためFITC-イヌリンを量る。 </li><li>溶解したFITC-イヌリンソリューションとノートの重量を量る。 </li><li>透析膜の20センチ部分（分子量カットオフ：1,000）をカットし、30分間膜から残留のNaN 3を削除し、その後数回フラッシュするのddH 2 Oに置く。 </li><li>透析膜にFITC-イヌリンを溶解埋めるとクロージャで適切にシールします。 </li><li>全体の透析膜重量を量る。 </li><li> 1 L 0.85％NaCl溶液で透析膜を入れて、ROで24時間光保護ゆっくりかき混ぜるomの温度。 </li><li>再び全体の透析膜を秤量し、（水が浸透膜と結合していないFITCに移動する、または結合FITC-イヌリン&lt;1,000分子量は、膜の外に移動します、したがって、FITC-イヌリンの濃度が大幅に低下します）新しい濃度​​を計算。 </li><li>新しいFITC-イヌリン濃度（c）は、以下の式を用いて計算される：C = N / V、ここで、n =初期FITC-イヌリン量、V =新しいボリューム（透析プラス初期の体積前と後の透析チューブの重量差FITC-イヌリンは、ソリューション）。 </li><li> 0.22μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌透析FITC-イヌリン溶液を使用前に。 </li><li> FITC-イヌリン4で光（アルミ箔）から保護しておく℃まで透析とFITC-イヌリン滅菌は、最大2週間使用することができます。 FITC-イヌリンを数分間、90℃で再加熱することにより溶解させることができる参加した。 </li></ol> 注：使用している場合透析を必要としないFITC-sinistrin 16-18、透析に必要なすべてのステップをスキップすることができます。 3。注射や採血<ol><li>実験の前にマウスの体重（BW）を取る。 </li><li>イソフルランで簡単にマウスを麻酔。 </li><li> 6マウスの高スループットについては、図3に示すプロトコルに従ってください。 </li><li>針でG30½を用いて、後眼窩叢24に透析FITC-イヌリンを2μl/ gの体重を注入する（ための針でG30½に切り替え、最初の針でG26½を用いて、100μlのハミルトンシリンジから気泡を除去し、注射）。 </li><li>のNa-ヘパリンminicapillariesで注入後56〜75分、35、15、10、一度はさみでマウスの尾の1ミリメートルをカットし、3時に血を集める、5、7。チャアムシール付採血後にシールminicapillaries。 </li><li>サンプルは光から保護しておく。 </li><li>密封されたminicapillaries内部造血を入れクリティカル毛細血管と5分間遠心する。 </li><li> 0.2ミリリットルチューブにピペッティングによりダイヤモンドカッター、転送全体のプラズマを用いてminicapillariesを破る。 </li><li>新しい0.2ミリリットルチューブ（サンプルは4℃で一晩保存することができ℃の蛍光測定のために）でプラズマの2μLと18μlの0.5 mol / LのHEPES液（pH7.4）を用いて10倍希釈してください。 </li><li>重複での光度3300で希釈された試料の2μLを測定します。楽器の説明と使用法は5ここで説明されています。 </li></ol> 4。規格の調製<ol><li>ヘパリンコーティングされたヘマトクリット毛細管で同じ背景系統のマウスから血液を集め、スピンダウン、0.5 mol / LのHEPES（pH7.4）で1:10に希釈し、通常80μlの血漿+ 720μlのHEPES。 </li><li>次の標準希釈液を得るために希釈マウスプラズマでFITC-イヌリン注射液を希釈： 午前1時10分：10μlの希釈していないFITC-イヌリンソリューション+90μlの希釈マウス血漿 1:100：10＆ムー、L（1:10）ソリューション+90μlの希釈マウス血漿 1:1,000：10μlの（1:100）ソリューション+90μlの希釈マウス血漿 1:2,000：30μlの（1:1）ソリューション+30μlの希釈マウス血漿 1:10,000：10μlの（1:5）ソリューション+40μlの希釈マウス血漿 1:20,000：20μlの（1:1）水溶液+20μlの希釈マウス血漿 1:100,000：10μlの（1:5）ソリューション+40μlの希釈マウス血漿 基準の濃度は、透析に依存しており、常にFITC-イヌリンの各調製のために異なるであろう。これは、新しい標準曲線毎回濃度を入力する必要がある。 </li><li>ここ15,20に記載した代表的な結果の節に示すように、二相指数関数的減衰関数を使用して、適切なソフトウェア（ 例えばグラフパッドプリズム）でGFRを計算するためにデータを分析する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

著者は、サーモフィッシャーサイエンティフィックによって、この出版物のコストをカバーするために資金を受け取った。

本研究では、二相指数関数的減衰によって8血液サンプル中の蛍光の単一ボーラス注入および分析によって意識のあるマウスでGFRを測定するための技術が記載されている。 1マウスにおけるGFR測定は75分かかります。特別なフローチャートを用いて、それが130分で6匹のマウスのGFRを測定することができる。これは、1日4回まで、このフローチャートプロトコルを繰り返し、24マウスにおいてGFRを測定することが可能である。それは小さな尾スニップではなく尾静脈穿刺に比べて研究者が実行するための迅速かつ容易である尾静脈穿刺から血液を収集することが可能であるように、我々はこの方法を変更しました。 10μlのヘマトクリット毛細管と10倍希釈を用いて、それが&lt;100μlに必要とされる血液の総量を低減することができる。最後に、蛍光を希釈試料の1-2μlの蛍光を決定することができる光度計3300 fluorospectrometerを用いて測定される。この方法では、関心のあるinvestigatoを与えるRA真のGFR値。これとは対照的に、マウスでのクレアチニンの測定値は &quot;クレアチニンブラインド範囲&quot;と具体的かつ敏感な決定に関わる難しさなど、いくつかの弱点がある。腎機能の50％が19失われるまで、血清クレアチニンが正常範囲に留まるので、 &quot;クレアチニンブラインド範囲は、&quot; GFRのためのマーカーとしての機能を制限する。遺伝子Xのノックアウトマウスを仮定すると、野生型マウスに比べて有意に低いGFR（40％）、持つことになりますいくつかの研究者は腎臓の生理学と病態生理学を研究するために彼らの研究における遺伝子改変マウスを利用するので、これは次のような問題を負担血漿クレアチニンを比較することにより、簡単なスクリーニングは、この差を検出しません。 GFR測定の良い​​正確な方法の必要性が小さく、より重要になってGFRの違いがなる。 マウスは、市販と干渉し、その血漿および尿中クレアチニン非chromagensの高濃度を有する利用クレアチニンアッセイ。結果として、アルカリピクリン酸ヤッフェ反応に基づいているアッセイは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）測定6,13に比べて血漿中クレアチニン濃度を過大評価。別の制限は、血清クレアチニン値はHPLC測定に比べて、以下のいくつかの市販のアッセイの検出限界です。しかしながら、酵素反応を用いて研究者は、マウス10、22に血漿クレアチニンを決定することができた。 類似の範囲のGFRは匹敵するシングルボーラス注入法と同様、尿FITC-イヌリンクリアランス14を使用して意識したマウスで発見された。彼らのプロトコルとは対照的に、尾スニップを使用して我々のプロトコルには、特別な注意が尾静脈または伏在静脈穿刺に比べて血管の整合性を維持する必要はありません。 FITC-イヌリン基づく尿/血漿クリアランスのためには、外科的に2浸透マイルを注入する必要がありますnipumps。二つのポンプが背景とは明確に区別される定常状態の十分に高いプラズマFITC-イヌリン濃度を達成するために必要である。これはまた、完全なタイミング尿収集のために代謝ケージの使用を必要とする。ケージは、特にすすぎなしで発生したFITC-イヌリンの25から37パーセントの損失を考慮してリンスする必要がある。 このFITC-イヌリン方法を使用しての落とし穴は限られている。調べでは、次の点に注意する必要があります：（i）が注入された量が計算されたGFRを決定し、（ので、（ii）の完全な球後注射が達成しなければならない、FITC-液の注入に使用シリンジ内に気泡がないことを保証ⅲ）マウスが75分GFRの実験中の可能性が最も高い排尿するので、腎臓濃度能力の結果として非常に高いFITC-イヌリン濃度を持つことになり、尿と血液サンプルを汚染しないようにしてください。 一般的な利点OfこのFITC-イヌリンメソッドは次のようなものがあります（I）は（ⅱ）は（iii）のアッセイは、意識的なマウスで行うことができます（同じマウスで測定を複数回繰り返すことが可能であり、非放射性手法ですiv）の無尿採集は、高スループットオプションを利用することができる（v）で必要とされる。単一のボーラス注入の欠点は、現在利用可能な特別な小型化装置18を用いて経皮的に測定することができる優れたFITC-標識、FITC-sinistrinを使用することによって克服することができるFITC-イヌリンの透析の必要性を含む。 GFRを測定しているにもかかわらず、この方法では、流体またはイオンの分別排泄物を測定することは不可能である。 まとめると、この方法は、意識的なマウスでGFRを測定するためのハイスループットな方法の実現可能性を提供します。したがって、この技術はマウスで腎機能を決定する上で興味を持っている他の研究者のために興味があるかもしれません。

糸球体のプラズマ限外濾過の生成速度は、腎機能（糸球体濾過率、GFR）を評価するための基礎となっている。 GFRを決定するための理想的なマーカーは自由にも分泌されないか、再吸収と代謝されない、フィルタリングされるべきである。このような挙動は、イヌリンのために真であることが判明した、とイヌリンクリアランスはGFR 3の決定のためのゴールドスタンダードとなっている。クレアチニンのクリアランスを広くヒトおよび動物におけるGFRの尺度として使用されるのに対して、クレアチニン、理想的なGFRマーカーの要件を満たしていない。 10まわり-ヒトにおけるクレアチニンクリアランスの40％が尿細管分泌活性1,11の結果である、およびクレアチニンの腎分泌はまた、マウスおよびラット4、図7、図9、図22において顕著である。腎機能障害はGFR 1,2のマーカーとして、その値を制限するクレアチニンの尿細管分泌を増加させることが知られている。我々は以前に、有機アニオントランスアイソフォームを示している3（OAT3）ネズミ腎クレアチニン分泌22に貢献しています。しかし、イヌリンクリアランスは通常、放射性ラベルされたイヌリン（3 Hまたは14 C）を使用する必要があります。イヌリンの放射能測定は、麻酔と意識の両方のマウスで使用されますが、数多くの安全規制、放射性同位元素の使用に固有の厳格な取り扱いの問題の欠点を抱いてすることができます。これらの線に沿って、GFRを決定するための手術クリアランスの準備には時間がかかるだけでなく、自然の中で、端末である。 1999年にローレンツら 12は麻酔したマウスの単一ネフロンGFRのマーカーとしてFITC-イヌリンを導入しました。 5年後チーら 15 FITC-イヌリンを使用することによって意識のマウスにおける全体腎臓GFRを決定した。代替プロトコルは今や意識と麻酔したマウスでGFRを測定する外因性マーカーとしてFITC-イヌリンを使用しています。これらのプロトコルは、蛍光detectiを使用して、放射性イヌリンの感度を維持するで、放射性ラベルマーカーでの作業の欠点を回避。 FITC-イヌリンアッセイは、光度3300 fluorospectrometerの微量の能力を活用するために、他7,8および私達22,23によって変更された。これは、GFR測定ごと&lt;100μlの血液に必要な総サンプル量を低減することができる。 方法と本書に提供される高スループットプロトコルでは、我々は一日あたり24意識マウスにでGFRを測定の実現可能性を実証する。この手法は、マウスGFRを勉強し、他の研究者に有用である可能性が、我々はそのようなクレアチニンと血中尿素窒素などの腎機能の指標としてはあまり正確な方法を置き換えることを願っています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

糸球体濾過率（GFR）の測定は、腎機能の評価の金本位である。現在、研究者らは、内因性のバイオマーカークレアチニンまたは外因適用放射性ラベルされたイヌリン（3 Hまたは14 C）のレベルを測定することにより、GFRを決定します。クレアチニンは、全腎クレアチニン排泄の約50％のための近位尿細管分泌アカウント実質的な欠点を持っており、したがって、クレアチニンは、信頼性の高いGFRマーカーではありません。行った実験に応じて、イヌリンクリアランスは、単一の静脈内ボーラス注射または連続注入（静脈内又は浸透圧ミニポンプ）によって決定することができる。両方のアプローチは、それぞれ血漿または血漿および尿の収集を必要とする。放射性ラベルされたイヌリンの他の欠点は、同位体の使い方、動物の時間がかかる手術の準備、および端末実験の要件が含まれています。ここでは、単一のボーラス注射を使用する方法を説明フルオレセインイソチオシアネート（FITC）ラベルイヌリンと希釈血漿中1-2μLでその蛍光を測定する。マウス当たり8血液コレクションを、二コンパートメントモデルを適用することにより、それが特別な作業フローのプロトコルを使用して、1日24までのマウスにおいてGFRを測定することができる。このメソッドは、非拘束と目を覚ましマウスで収集されるすべての血液サンプルとの短いイソフルラン麻酔を必要とします。別の利点は、それが数ヶ月や治療（ すなわち、食生活の変化または薬物アプリケーションと対実験を行う）にわたってマウスに追従することが可能であるということである。我々はGFRを測定するこの手法は、マウス腎機能を研究他の研究者にとって有用であり、そのような血漿クレアチニンと血中尿素窒素などの腎機能を推定する精度の低い方法を置き換えることを願っています。

GFRは、以下の式を用いて計算される。 GFR = N /（A/K1 + B/K2）、ここで N =注入量（N = C•V、C = FITC-イヌリン濃度、V =注入量） =スパン1、除去のy切片 除去のための定数K1 =崩壊 B =スパン2、y切片分布 配布用の定数K2 =崩壊 （注）、K1、BおよびK2はグラフパッドプリズム、二相の指数関数的減衰を分析することのできるすべてのソフトウェアによって与えられている略語を使用することができますが、他の科学的なソフトウェアは、異なる略語を使用する場合があります。 プラズマFITC-イヌリン濃度に基づいて二相指数関数的減衰曲線フィットを採用することにより、 図1に示すものと同等の曲線が得られるべきである。上に示した式（でGFRを計算して、ここにに記載されて&lt;&gt; 20をSUP）1型糖尿病（ 図2）を持つマウスに見られるよう腎機能15または糸球体過剰ろ過8、23の障害を検出することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> 図1。意識のあるマウスでGFRを測定するために、単回静脈内注射後のFITC-イヌリンの血漿中動態が使用される。GFRを計算するために、2つのコンパートメントモデルが採用されている。 2区画モデルでは、初期の急激な減衰相は細胞外液の血管内区画からFITC-イヌリンの再分配を表している。 FITC-イヌリン濃度の遅い減衰との後の段階では、主にプラズマから全身クリアランスを反映している。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> 図2。 Detectionは、野生型マウスでは糖尿病の過剰濾過の。I型糖尿病は、ストレプトゾトシンを腹腔内アプリケーション（STZ、5日間連続して50 mg / kg）を誘導した。 GFRは、前に（基礎）と5週間糖尿病の誘導後に決定した。尿細管糸球体フィードバックのため、近位の再吸収の主な増加は、早期に糖尿病過剰濾過21野生型マウス（n = 10、P &lt;0.01対基底同じマウス）で再現性がある発見を引き起こす。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> 図3。 6マウスのセットにおけるGFRを測定する。単回ボーラス注入法で全体腎臓GFRを測定するためのフローチャートは 、8血液サンプル10、15、35、56及び75分後、7,3、5 ​​で収集されなければならないFITC-イヌリン噴射。数字は時点を示している。括弧内の数字はサンプル数を示す。赤い縦線の左側の時点では、注射を示す時点（0、11、22、33、44、55分で）。各マウスは、異なる色でマークされています。シーケンシャル血のコレクションを取得するには矢印に従ってください。グレーボックスは次のマウスは注射前にイソフルラン麻酔のために準備しなければならない場合を示している。このプロトコルを使用して別のマウスから2血コレクション間の最小時間は1分です。

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

糸球体濾過率（GFR）の測定は、腎機能の評価のための金本位である。ここでは、二相指数関数的減衰モデルで血漿およびGFRの計算に単一のボーラス注射、フルオレセインイソチオシアネートの判定（FITC）-イヌリンを使用して、意識のあるマウスでGFRを決定することができる高スループット方法を説明する。

意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

a-high-throughput-method-for-measurement-glomerular-filtration-rate

Research

JoVE Journal

Biology

43.1K ビュー.  University of California, San Diego. 糸球体濾過率（GFR）の測定は、腎機能の評価のための金本位である。ここでは、二相指数関数的減衰モデルで血漿およびGFRの計算に単一のボーラス注射、フルオレセインイソチオシアネートの判定（FITC）-イヌリンを使用して、意識のあるマウスでGFRを決定することができる高スループット方法を説明する。

ビデオ: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

生物学

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

環境試料中の有機Pのハイスループット測定と分類

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

生理学ラボデモンストレーション：ラットにおける糸球体濾過率

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...