We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1.細胞外フラックス計測器でバッファリングパワー測定：2つのバリエーションを注：ここで説明した計算及び方法は、細胞外フラックスアナライザーを使用して開発されました。他の楽器のために、測定体積は適切にスケーリングされなければなりません。 <ol><li>製造者の指示に従って（材料および機器を参照）塩酸濃縮物を用いて水に0.1 M塩酸標準を準備します。 注：すべての4つの注入ポートにおいて使用するためのHClの注射を調製するための計算例を表1に示します。 </li></ol><img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> 細胞外フラックスアッセイに表1連続塩酸注射も。 <ol start="2"><li>培地中のHCl標準の希釈液は、カールされる技術的反復の数については、表1のようにアッセイする準備一方のプレートの中でIED、プラスワンは、ピペッティング誤差を許容するために、 例えば 、ポートの4技術的反復注射のために、（48.9μL×5）アッセイ培地（1.1μL×5）、0.1MのHClの株式を準備します。 </li><li> 50μLを測定プローブカートリッジの各ポートAに配布します。残りのポートA、B、C、およびDに、この手順を繰り返し</li><li> 4ポートの追加のそれぞれについて、[2分ミックス、1分待ち、5分の測定]の2つのサイクルが続く標準較正サイクルを有する細胞外フラックスアッセイ10を実行します（ 図2を参照）。 <ol><li>ソフトウェアの指示に従って機器のソフトウェアで上記実験をプログラム。マシンに準備されたカートリッジをロードして、ソフトウェアの指示に従ってキャリブレーションを行います。 </li><li>プログラムによってプロンプトが表示されたら、較正物質含有プレートを取り外し、よく機器に各アッセイ培地を含むプレートを挿入します。プログラムを続行します。 </li></ol></li><li> U<html>以前から定常状態で得られた8-10データポイント（通常は最後の8-10点）の平均値を歌い、各ポートを添加した後、標準的な酸の各注入によるpH値（ΔPH）中（累計）の差を計算します。 </li><li>測定プローブに捕捉された7μlのボリュームに含まれるナノモルの H +に対してプロットΔPH。線形勾配はMPH /ピコモルのの H +でバッファリングパワー（BP）です。 </li><li>あるいはステップ1.2〜1.3に、ポートA、B、及びCは、表2のようにポートD.中のHClの注入に続いて実験を行うために使用される4つの技術的反復であるれるアッセイ以下ΔPHの測定を行います細胞外フラックスアッセイプレート（4背景温度補正ウェルを除く）20実験ウェル中の5点標準曲線の各点を生成するために使用されます。 </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; よく細胞外フラックスアッセイに表2.シングル塩酸注入。 2.外部のpHメーターを使用してバッファリングパワーを測定注：外部pHプローブを用いて、培地の緩衝能​​力を測定する、37℃でプローブを校正し、実験の間、すべての試薬について、この温度を維持します。 <ol><li>製造者の指示に従って、塩酸濃縮物を用いて水に0.1 M塩酸標準を準備します。 </li><li>暖かいpHプローブ、pHが基準、そのバッファリング電力測定するアッセイ培地、及び水浴中で37℃に0.1 MのHCl。 </li><li>製造者の指示に従って、37℃でのpHプローブを校正。熱板や水浴を使用してアッセイを通して37℃ですべての試薬を維持します。 </li><li>小さなビーカー又は円錐チューブに小分けし、アッセイ培地10mlを。連続浸漬pHプローブを用いてpHを監視します。 </li><li> 0.1 M HClをように追加10〜20μlのアリコート中の培地を言います。 <ol><li>攪拌棒を使って、または手動で各酸を添加した後、容器を旋回による混合を確認してください。 </li><li> pH測定のための数秒間は、各添加後のpHを記録した後、安定化させます。 </li><li> 表3に示されているように、正確な傾きの計算を確実にするために、実験中に予想されるpH範囲をカバーするのに十分な数の加算を行います。 </li></ol></li></ol><img alt="表3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> 表3. pHメーターを使用して、緩衝力を測定した。データを、0.1 M HClを620μlの添加との典型的な実験を表します。 <ol start="6"><li>ナノモルH +に対してプロットΔPHは、緩衝力（ 図1）を表し 、線形勾配を与え、7μlのあたりに追加されました。 </li></ol> 図1.バッファリングパワーを決定します 。 HClの標準曲線は 、表3のように、表1、表2または（ここでは）のように測定した。線形曲線適合の傾斜は、緩衝力液（pH /ナノモルのH + 7μlの）を与えます。各点は、n = 9の技術的反復の平均±SEMを表します。 <ol start="7"><li>緩衝力は、上記の方法1または2を介して知られると、電源（BP）（MPH /ピコモルのH +）をバッファリングすることによってECARを割ることによってPPR（ピコモルのH + /分/μgタンパク質）にECAR信号（MPH /分）に変換各ウェルのタンパク質含量にスケーリング。 PPRのTOT（ピコモルのH + /分/μgタンパク質）= ECAR（MPH /分）/ BP（MPH /ピコモルのH + 7μLで）ウェル（μgの）あたり/タンパク質式6 </li><li>あるいは、この方法で同じ実験を使用自動データ収集中にPPRを計算するために機器のソフトウェアによって使用される緩衝能力（BC）の値を計算するための1又は2。 注：機器のユーザーマニュアル12（107ページ）BCは次のように記述されている緩衝能力を計算し、使用方法についての詳細な情報を提供 BC（モル/ L）=モルのH + /（ΔPHXバッファ容量（L）） 式7 注：式7で定義された緩衝能力は、機器又は上記の外部pHプローブアッセイで算出することができます。バッファリングパワーと緩衝能の間の変換を簡単に（添付のスプレッドシートを参照してください）​​行われます。 BC = 1×10 -9 / BP（（MPH /ピコモルのH + 7μLで）/ 7μl）を式（8） 注：アッセイを行う前に知られている場合は、緩衝能力が実験中の機器のソフトウェアに直接入力することができます。 </li><li>以前の刊行物6に記載のように 、この手順とほとんどの従来の緩衝系を使用する上記の計算を適用します。 注： 表4の緩衝力といくつかの従来の媒体の緩衝能力。 </li></ol><img alt="表4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> 表4.バッファリングパワーと選択したメディアの緩衝能力。 3. C2C12筋芽細胞を用いた細胞外フラックスアッセイを行います注： - + Hステップ3.4.3において、CO 2には観察された差はなかったその存在がHCO 3にCO 2の完全な変換に必要とされないことを示唆し、C2C12培養での炭酸脱水酵素の存在に依存酸生産を由来+。しかし、経験的に異なる実験系でこれをテストする前にOMをお勧めしますitting炭酸脱水酵素。 <ol><li>培養マウスC2C12 11.1 mMグルコース、2mMのグルタミン、10％v / vのウシ胎児血清（FBS）、100 Uを有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、95％空気/ 5％CO 2下、37℃で13筋芽細胞/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン。 </li><li> 24時間アッセイの前に、20,000細胞で同じ培養培地100μlでプレート/シード細胞/ウェルでなし追加のコーティングを含む24ウェルポリスチレン細胞外フラックスアッセイプレート（材料及び方法を参照）。 </li><li>クレブスリンガーリン酸、HEPES（KRPH）アッセイ培地（2 mMのHEPES、136mMの塩化ナトリウム、2mMののNaH 2 PO 4、3.7 mMのKClを、1で10倍の最終濃度になるように、FCCPをオリゴ希釈し、ロテノンプラスmyxothiazol、およびHCl（オプション） mMのMgCl 2を、37℃で1.5ミリモルのCaCl 2、0.1％w / vの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、pH7.4中）。 </li><li>細胞調製<ol><li>アッセイの前に30分、GEに吸引することにより、接着細胞を3回洗浄ntlyウェルから培地を除去した後、ゆっくりと500μlのKRPHを追加。 </li><li> （この重炭酸塩を含まない培地のpHを変えるわけではない、5％CO 2下で、）、37℃空気中での3回目の洗浄工程の後、細胞をインキュベートします。 </li><li>アッセイ開始時には、追加の基板を、500 U / mlの炭酸脱水酵素とグルコース（10 mM）のまたは中のいずれかのみを含む500μlの新鮮なKRPHでウェルにKRPHを交換してください。 </li></ol></li><li>センサカートリッジのロード<ol><li>ポートA：2 / mlのオリゴマイシン、ポートB：0.5μMFCCP、ポートC（アッセイにおける最終濃度が十分に与えられた）、次のように細胞外フラックスセンサカートリッジのカートリッジポートにステップ3.3で調製した各10倍化合物のピペットで50μlのアリコート：1μMロテノン、1μMのmyxothiazol、ポートD：塩酸（上記および表2に記載されているようでアッセイ酸キャリブレーションを行う場合）。 注：ここで説明する完全な呼吸鎖阻害の目的のために、1μMの私xothiazol 1μMのアンチマイシンAと交換可能に使用することができます</li></ol></li><li>細胞外フラックスアッセイ： <ol><li> 10に記載の呼吸制御を決定するための標準的な細胞外フラックスアッセイを行います。 </li></ol></li></ol>注：実験の各セグメントについては、ミックスを決定し、待って、測定時間が必要なだけでなく、セグメント当たりのサイクル数。 注： 表5のデータは、3アッセイサイクルはバッファリングのキャリブレーションのためのHCl（量の異なるポートDを添加した後に発生すると、2分ミックス、1分待ち、および各セグメントの5分の2つの測定アッセイサイクルにわたって収集しました表2のようにパワー）。 <img alt="表5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> 表5.細胞外フラックスアッセイ構成。 4. MeasuriNGエンドポイント乳酸濃度注：の減少（2分かけて）初期速度を測定することにより、従来の96ウェルプレート中で直接決定することができる細胞外フラックス実験の終わりにいくつかの異なるシステム、エンドポイントの乳酸濃度でここに記載の間接アッセイを検証しますNAD +→NADHは、事前の出版物6に詳細に記載さ乳酸脱水素酵素によって触媒。代表的な結果に示されたデータは、グルコース含有アッセイウェル内のエンドポイントの乳酸濃度は〜40μmでした。 <ol><li> 2倍ヒドラジン媒体を準備し、1Mのトリス、20mMのEDTA、400mMのヒドラジン、22℃でのpHは9.8）。すぐにアッセイ開始前に、40 U / mlに4ミリ、乳酸脱水素酵素（LDH）にNAD + を追加します 。最終的なアッセイ培地組成物（1×）：500 mMトリス、10mMのEDTA、200mMのヒドラジン、2 mMのNAD +、20 U / mLのLDH。 </li><li>すぐに細胞外フラックスアッセイ以下、100を削除します細胞外フラックスアッセイプレートの各ウェルからアッセイ培地μlの不透明（黒色）を、96ウェルプレートのウェルに移します。 </li><li>各サンプルウェルに、100μlの2倍ヒドラジン媒体を追加します。 </li><li>直ちにマイクロプレートリーダーにプレートをロードし、340 nm励起/ 460 nm発光でNADH蛍光の監視を開始。 </li><li>約2分間の初期速度を記録します。 </li><li> 0〜50μMの追加乳酸濃度についての乳酸濃度に対する初期速度をプロットすることにより標準曲線を構築するために同様の実験を実行します。 </li><li>標準曲線を用いて、各ウェルの実験中の乳酸濃度を計算します。 </li></ol> 5.タンパク質含有量を測定します<ol><li>アッセイプレートの各ウェルから残りのアッセイ培地を除去します。 </li><li>底のウェル表面から細胞の脱落を最小限に抑えるように注意しながら、BSAフリーKRPHμlの250でウェルを3回洗浄します。 </li><li> 25μlのRIPA溶解を追加培地（150mMのNaCl、50mMのトリス、1mMのEGTA、1mMのEDTA、1％v / vのトリトンX-100、0.5％w / vのデオキシコール酸ナトリウム、0.1％v / vのSDS、22℃でpH7.4）中アッセイプレートの各ウェルに。 </li><li>氷上で30分間、プレートをインキュベートします。 </li><li> 5分間1200 rpmでプレートシェーカー上でプレートを撹拌します。 </li><li>溶解緩衝液組成物は、測定方法に対応していることを確認して、BCAアッセイにより、例えば 、標準的な方法によりタンパク質濃度を測定します。 図2の実験中のタンパク質含量/ウェル〜4μgのでした。 </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li><li>Renner, K., Jansen-D&#252;rr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption.">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li><li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism.">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).</li><li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li></ol>

博士ショナムケルジーは、彼女は何の競合する金融利害関係がないことを宣言します。ドクターマーチンブランドは、この記事で使用される機器および試薬を生成シーホース・バイオサイエンスのためのコンサルティングを行ってきました。この記事のオープンアクセス料はタツノオトシゴバイオサイエンス社のために支払われました。

細胞外酸性化は、細胞の代謝速度の容易に測定指標です。適切セルラ解糖の速度を決定するために、（乳酸産生によって定義される）には、アッセイ培地の緩衝能​​力を知ることが、生産速度をプロトン酸素消費および酸性の細胞外フラックス測定値を変換することが重要です。この計算を行うことにより、クエン酸サイクル中に放出されたCO 2から生じた酸性化は乳酸産生に起因する酸性化を残して、減算することができます。 この補正のための緩衝力を測定するためにここに与えられた複数の異なる方法は、異なる長所と短所を有します。 pHプローブを使用して、外部の測定は非常に正確で再現性があるが、小さなアッセイプレート内に含まれる蛍光団によって導入されたpH検出の違いは、アッセイ中の化合物の添加、またはTの存在を反映していない可能性が彼は細胞自体を。中板pH測定は、これらの問題に対処するだけでなく、実験的なノイズの様々な程度をご紹介します。 ECARへのCO 2の補正は初めて解糖率の明確なおよび定量的計算を可能にし、実験の過程で総ECARの呼吸器および解糖系の寄与の変化を明らかにする。式5及びOCR、ECAR、及び緩衝力の測定値を用いて、解糖速度は、簡単なスプレッドシートに設けられた （表6）を用いて算出することができます。 6必要に応じて、この速度は、事後乳酸測定により確認することができます。ペントースリン酸経路は非常に活性である細胞では、例えば、6-アミノニコチンアミドのような経路阻害剤の使用は、解糖速度を単離するために有用であり得ます。細胞外酸性化速度と酸素Consumptを測定し、総からと乳酸由来の H + - CO 2の両方の寄与の計算イオンレートは、代謝活性についての強力かつ定量的な文を作るために、細胞外フラックスデータを使用のための貴重なツールです。 緩衝力を測定し、調査し、所望のデータを下の細胞のための細胞外フラックス実験を最適化するための様々な変形例を含むここに記載した手順を使用して、無傷の細胞における解糖の速度は、実験条件の広い範囲の下で定量化することができます。この方法は、ポリスチレン表面（に付着され得るか、または細胞または細胞小器官）で接着培養で増殖することができる細胞に限定されています。これは、有用なデータが依然としてこれらの条件の範囲に亘って得ることができるものの、培養細胞は、均質でコンフルエントにあるときに、最も信頼性が高くなります。計算はK細胞である場合は、異なる基板と部分酸化6のためのより多くの完全な酸化のための0.65から1.0への最大のH + / Oなどの2レンジ 、細胞の代謝のいくつかの知識を必要としますノウングルコースを酸化するために、1.0の値を想定することができます。 すべての代謝的特徴付けに関連しているがシステムで使用される場合、この方法は、細胞のATPの供給を維持するために呼吸及び解糖代謝の間にずれが幹細胞および腫瘍由来の癌細胞の特徴付けを含む、重要な表現型である、特に有用であり得ます。これらおよび他の文脈での代謝制御の変化を理解することは、これらの細胞型の実験計画と解析で洗練された精度の高い程度をできるようになります。

この方法の全体的な目的は、正確に、細胞外フラックス分析を用いた細胞の解糖速度を測定することです。細胞外酸性化を使用して解糖速度の定量的測定は、多くの実験の所望の終点です。形で、解糖酸性化- （+ H + HCO 3に解離後、H 2 CO 3に水和物）、CO 2の形で呼吸酸性化、：しかし、細胞外酸性化の合計割合は、2つのコンポーネントの合計であります+ の H + -乳酸。 総細胞外酸性化へのCO 2の寄与は最近まで、ここで使用する測定プラットフォーム、XF24アナライザ7で無視できると考えられてきました。しかし、CO 2が外酸性化4-5に大きく貢献することができ、複数の他のシステムでは明らかです。複数の論文は、この詐欺を認めますtributionは、しかし酸3,8,9を由来のCO 2の直接定量を行わないでください。我々は最近、CO 2産生がこのシステム6における細胞外酸性化の大きな原因であることを定量的に明らかにしました。グルコース異化からのCO 2生成複数の代謝経路がありますがまた、クエン酸サイクルで行列デヒドロゲナーゼによって行わものが圧倒的な貢献者であり、すべての他の情報源は、実験誤差6の範囲内であるCO 2の量を生成します。 CO 2産生のために修正することなく、細胞外酸性化は、したがって、解糖速度の曖昧な指標であり、定量的に使用することはできません。私たちの以前の出版物は、呼吸CO 2があっても、一般的に、主に解糖系6を使用すると考えられる細胞では、総酸性化信号の大部分を含み、複数のインスタンスを強調表示します。さらに、総酸性化に呼 ​​吸CO 2の寄与は、実験の異なる部分の間に解糖率の正確な比較は、CO 2の補正が必要であることを実証し、一般的な代謝プロファイリング実験の過程で大きく異なります。 細胞外酸性化の速度を使用して、細胞の解糖速度を測定するためには、生成された合計のH +の変化に対するpHの変化に変換すること、およびクエン酸回路の動作中に放出されたCO 2により引き起こされる細胞外酸性化を減算する必要があります。ここでは、（O 2濃度の細胞外変化から）とCO 2生産（pHの外の変更やキャリブレーションアッセイ培地のバッファリングパワーから）細胞外のプロトン生成速度を測定するための簡単な方法を説明し、解糖速度を計算する方法を示しこれらの測定値を使用して。 この方法の強さ<html>乳酸産生によって定義されるように適切に解糖速度を計算するためにそれを使用することにより、細胞外酸性化の測定の有用性をens内。呼吸CO 2（または乳酸の直接測定）の補正がなければ、それはどうかを判断することは不可能であり、どの程度の総酸性化速度は、乳酸産生の直接測定された全細胞外酸性化を使用した実験の解釈を混乱させる、解糖率を反映します。 計算 CO 2および乳酸は、実験誤差の範囲内で、筋芽細胞6を用いた実験に基づいて、細胞外の酸産生に2つだけの貢献者です。したがって、総細胞外酸性化（PPR、プロトン生産率）の割合は、以下のように定義することができます。 PPRのTOT = PPR RESP + PPR glyc 式（1） _content &quot;&gt; TOT =合計; RESP =呼吸;解糖= glyc解糖PPRは、このようになります。： PPR glyc = PPR TOT - PPR RESP 式2 ここに、 PPR TOT = ECARのTOT / BP 式3 ここECAR =細胞外酸性化速度（MPH /分）、およびBP =バッファリングパワー（MPH /ピコモルのH + 7μLで）、一方、 PPR RESP =（10 のpHのpK a 1 /（1 + 10 のpHのpK a 1））（最大H + / O 2）（OCR TOT - OCR 腐敗/ MYX） 式4 ここで、K 1 = CO 2水和およびHCO 3への解離を組み合わせた平衡定数- + H +;最大H + / O 2 =番目例えば、グルコース6の完全な酸化のような特定の代謝変換の電子のCO 2由来の酸性化。 OCR =酸素消費速度（ピコモルO 2 /分）、及びOCRの腐敗/ MYX =非ミトコンドリアOCR。 式4は、任意の非ミトコンドリアOCRを減算することによりミトコンドリアのOCRを分離する（ミトコンドリア呼吸毒のロテノン及びmyxothiazolに耐性であるOCRのように定義される）と、各基板（最大H + / O 2に消費O 2当たり発生する最大のH +を占め）、（6）、ならびにCO 2の割合は、実験温度およびpH（10 のpHのpK a 1 /（1 + 10 のpHのpK 1でのH +を生じる参照）。グルコースの完全な酸化は、ミトコンドリアの酸素消費率（OCR）は、CO 2生成の速度と正確に同じである。細胞外フラックス測定の閉じ込められたアッセイ容量において、CO 2の農産物呼吸によってdは、アッセイ培地中に閉じ込められたままです。 + H + -閉じ込められたCO 2の大部分は、次いでHCO 3を解離H 2 CO 3に水和されます。ごく一部は溶解のままであるが、水和されておらず、HCO 3にCO 2水和および解離の組み合わせ平衡定数によって熱力学的に決定されるように別の小さな画分は、水和したが解離していない- + H +実験温度（37℃）およびpHで（〜7.4）。 このように、PPRのTOTからPPRのRESPを差し引くことにより、PPR gを計算するための完全な式は次のとおりです。 PPR glyc = ECARのTOT / BP - （10 のpH-PK 1 /（1 + 10 のpH-PK 1））（最大H + / O 2）（OCR TOT - OCR 腐敗/ MYX） 式5 私nは、この方法は、呼吸及び解糖、ならびにそれらに関連するATPの生産速度の速度は、定量的に直接的な測定値（酸素消費、細胞外の酸性化、緩衝能）、およびその他の必要な値をインポートまたは計算（H + / O 2から決定することができます、P / O、及び平衡定数K 1）6。ここに記載した実験は、タツノオトシゴXF24 10,11のような細胞外フラックスアナライザーを使用するための標準的な技術を拡張しました。他の細胞外フラックス測定フォーマット （例えば、XF 電子 96、またはXFP）のために、以下のすべてのボリュームが適切にスケーリングする必要があります。 アッセイ培地の緩衝能​​力を較正pHプローブを用いて直接的に外フラックスプラットフォームにまたは別々に、標準曲線を構築することによって測定することができます。ここでは、細胞外フラックスアッセイ培地によりバッファリングを測定するための3つのオプションは、すべてのinjectiの使用を含む、与えられています無細胞サンプルウェルを有する細胞外フラックスアナライザーのポート上で、または細胞含有ウェル（セクション1）または外付けのpH測定（セクション2）を使用して、最後の注入口を使用して。例データの完全な計算のために添付のスプレッドシートを参照してください。 細胞外フラックス機器のpH検出機能を用いて、緩衝力を測定するために、信号の変化を最小限に抑えるために、無細胞ウェルを使用するのが最も安全です。しかし、誤差の範囲内で、統計的な差は、無細胞および細胞含有この測定を行う際にウェル（データは示していない）との間に存在しません。注：ステップ1.7で説明した変化は、ノイズの多い信号の欠点で、添加した化合物によって、あるいは細胞の存在によって付与されるバッファへの電位変化を占めるの利点を運びます。しかし、上述のように、有意な差は、表1に示した無細胞設計の間の計算された緩衝能力に見出されなかったとここで説明した実験条件下で、表2のポスト実験デザイン。 さらに、小さなΔPH範囲（&lt;0.4単位、実験的に最高の0.2単位に制限）の上に、ΔのMPH / pmolのH + をプロットした直線状の傾斜が十分にΔPHと、[H +]との間に対数関係を近似します。この標準曲線の傾きは、したがって、7μlの中のpH /ナノモルの H +、または7μlのMPH /ピコモルのの H +でテスト中のアッセイ培地の緩衝力を表しています。我々は、培地の緩衝能​​力を増大させるか、測定時間の間に0.2 pH単位の変化を超えたサンプルについての細胞密度を低下させるお勧めします。測定時間も減少させることができるが、これは、定常状態の酸性化速度を短縮し、速度計算に誤差を導入し得ます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> 図2は典型的な実験の生データを示しています。 OCRおよびpH（縦棒を影付き）の両方のポイント・ツー・ポイントの記録からの最後の10の測定点は、計算に使用しました。最初の懸念は、各アッセイサイクルの平均値（中間点測定）が、裏づけされていないポートの追加と定常状態の酸性化速度の間のわずかなずれがあるように見えた特にとして、正確な計算のための率の十分な解像度を提供しないことこのよう計算誤差（図示せず）に大きく寄与して表示されません。適切な緩衝能力を実験中に入力された場合あるいは、PPRは、機器のソフトウェア又はデータの出力設定の一つとして利用可能なPC互換形式でPPR出力を表示することにより機器のデータ収集読み出しから直接読み取ることができます。 ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; O 2とH + 1の図2.代表的細胞外フラックストレース 。 OCRおよびpHは、アッセイ開始時に10 mMグルコースを含む、 表5の実験例のトレース。ポートDは、（これらの平均のトレースに示されていない）バッファリング電力の較正のための種々のHClの濃度を有していました。以前の出版物6からのデータ。各点は、n = 8の生物学的反復の平均±SEMを表している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 代表的な結果のデータ解析 スプレッドシート表6に示され、添付ファイルとして提供さを使用して、個々のウェルからのデータ値は、黄色のヘッダーに示す列に入力することができます。すべての6つの列に<html>右は、これらのエントリから計算されています。 表6の例では、前のポートに追加グルコース、オリゴマイシンの追加の有無にかかわらず、ネイティブの条件について個々のウェルからECARとOCRデータを使用してPPRのRESPとPPRのglycの計算を示しています。各生物学的製剤の技術的反復は、通常、最後の4列に出力の単一の値を与えるために平均化され、その後、別の生物学的製剤からのデータは、エラーBP内の統計と、これらの4つの値の適切な伝播に平均化されます。 <img alt="表6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> 呼吸器および解糖の酸性化の表6計算。黄色に向かって列（例えば、BP、最大H + / O 2）の値が計算から入力する指示、またはデータ収集（例えば、ECARのTOT、OCR）から。<html> PS：//www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;このテーブルの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">|。Excelのスプレッドシートとしてこの表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 補正後のPPRの解糖および呼吸の貢献 図3は、FCCPの添加（ポートB）次のネイティブ解糖および呼吸酸性化の速度、さらに（ポートA）オリゴ以下の料金、および料金については、表6のように算出されたデータのグラフィカルな出力を示しています。これらのデータは、基板の選択と呼吸と解糖の酸性化の変化の割合（なしでコントロール（CTL対グルコース）を添加）方法を実証し、ミトコンドリアの状態（ネイティブ関数対の薬理学的に変更された機能）を持ちます。 &quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> 解糖系や呼吸器のソースから図3プロトン生成速度（PPR）。呼吸からPPR（開口部）、コメントを追加しましたグルコース（3左のバー）または追加グルコース（3右バー）せずに式5を用いて計算したC2C12細胞の解糖（塗りつぶされた部分）。 6からのデータ。すべてのデータは、n = 8の生物学的複製の平均値±SEMを表します。

Watch this Scientific Journal Video about Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate at JoVE.com

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K ビュー.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

ビデオ: Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

生物学

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

ライブ顕微鏡とオープンソースソフトウェアを用いた アスペルギルスニデュラン の成長率の定量分析

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...