この作品は、国立科学財団（助成番号MCB - 0447750）からの助成金によって賄われていた。

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するアイスキャップ法は一日で、個々の植物の数百、または数千、から組織サンプルを収集し、効率的にタイピング反応で使用するために、これらのサンプルからゲノムDNAを抽出するためにある科学者が可能になります。個々の科学者を短期間で苗木の遺伝子型の数千に能力を与えることによって、アイスキャップ方式では、そうでない場合は実行するために実用的ではないと遺伝学的実験の数を容易にする可能性を秘めています。いくつかの例を以下に用意されています。 <ol><li> 遺伝的マッピング 。研究者は、第3染色体に沿って指定された時間内で組換えイベントを識別することができる場合ファインスケールの遺伝子マッピングが速くすることができます。この間隔が非常に短い遺伝的距離が含まれている場合は、その後の組換え現象は​​分離マッピング集団では比較的まれである。このような理由から、それは希望の再を見つけるために、個々の植物の数千をスクリーニングする必要がありますcombinant個人。このプロセスは、アイスキャップの使用により大幅に促進された可能性があります。であってもゲノムワイドな再シーケンシングの時代に、それが直接、特定の変異は、関心の表現型の直接の原因であることを実証するために依然として必要です。これらのケースでは、候補となる変異が実際に原因であることを証明するために、他の密接にリンクされている変異から離れて興味の変異を分離することが必要となります。このような状況では、アイスキャップはしっかりとリンクされている変異のペア間の結合を壊すための効率的な方法を提供するであろう。 </li><li> マルチ変異体 。それは、機能的な冗長性4-6を克服するために、単一の個体に複数の別個の遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合するためにシロイヌナズナを研究する研究者のために一般的になっています。例として、1つは遺伝的交雑を介して単一の植物に4つの異なった遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合した​​い場合を考えます。このプロジェクトでは、それが生成するために必要となる交差スキームの一部として、これらの4つの遺伝子座でヘテロ接合体であるn個の個々の。この四重ヘテロ接合体セットの種子は、四重ホモ接合体は子孫の結果として人口の256人に1人の割合で存在することが期待されているときに。伝統的な方法でこの珍しい個々のスクリーニングはかなりの手間になる。比較することにより、このプロジェクトのためにアイスキャップを使用すると、単一の世代に珍しい四重ホモ接合体を識別するための効率的な戦略と科学者を提供するでしょう。 </li><li> iTILLING。当研究室では最近、 シロイヌナズナ 7で目的の遺伝子の誘発突然変異の存在をスクリーニングするための新しいアプローチを説明した。このメソッドは、化学変異原80〜10で治療した患者の順序付けられた集団での変異を見つけるために使用されている耕起と呼ばれる確立された技術のバリエーションです。それがIND許可ティラーの個別バージョンであるため、我々はiTILLINGたちという名前のメソッドにしている伝統的に大規模な研究チームが完了するために必要としていますが何かを達成するためにividual科学者。後述するように氷のキャップは、iTILLING方法7の不可欠な部分を形成している。 </li></ol> iTILLINGの背後にある考え方は、伝統的な耕作のプロジェクト用に作成された耐久性のある変異体の集団とは対照的に立っている一時的な変異個体を、生成することです。 iTILLINGの場合は、筋肉隆々 M2集団から種子は、50から100アイスキャップのブロックに播種し、そしてDNAはアイスキャップ法を用いて抽出されます。 シロイヌナズナ実生は、4に配置されている° C変異のスクリーニングは、アイスキャップのDNAを使用して実行している間プレップ。トマトの苗を12℃で保存されます。苗運搬所望の変異が特定されたら、彼らはアイスキャッププレートから回収し、土壌に転送されます。 iTILLINGは、画面全体の研究コミュニティのための長期的な変異体集団を提供することを意図されていません。その代わり、iTILLINGはどのによって戦略を提供します。ある科学者は、効率的、かつ比較的低コストで、迅速に遺伝子の一握りの突然変異のためのカスタム変異個体を選別できます。 我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米を栽培し、ジェノタイピングのための効果的な方法であることがアイスキャップを発見した。我々は、植物の他の種がまたアイスキャップに従順であることを期待しています。アイスキャップに収容することができる、様々な種の1つの制限は、種子の大きさです。 96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ唯一の植物は、その現在の構成でアイスキャップと互換性があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td>スペックス/ CertiPrep、メタチェン、ニュージャージー州</td><td> 2000ジェノ/グラインダー</td><td> DNA抽出のためにルートのプレートを振るための機械</td></tr><tr><td> ABgeneサーモシーラー</td><td> ABgene米国</td><td> AB - 0384 </td><td>組織破壊する前にルートのプレートに使用される手動のヒートシール機</td></tr><tr><td>スイングプレートキャリアを装備した遠心する</td><td>ベックマンコールター</td><td>アレグラ25R </td><td>スイングプレートキャリアを持つ任意の遠心は適して</td></tr><tr><td> MicroFillマイクロプレートディスペンサー</td><td> BioTekの www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td>マイクロプレートを埋めるための自​​動化された液体ディスペンサー</td></tr><tr><td> Bialettiブランド17x11インチ商用大型クッキーシート</td><td>ターゲットデパート</td><td> www.bialetti.com </td><td>この特定のクッキーシートは、アイスキャップのための理想的な深さを持っています</td></tr><tr><td>カスタムはメタルラックメイド</td><td>ハードウェアストア</td><td></td><td>完全な説明のテキストを参照してください。 </td></tr><tr><td> 33リットルのプラスチックの収納ボックス</td><td>ターゲットデパート</td><td> Steriliteブランド</td><td>アイスキャップの泉のため。 17x11インチのクッキーシートを保持するのに十分な大きさのプラスチック収納ボックス</td></tr><tr><td>時間噴水ポンプあたり30ガロン</td><td>デイトナ</td><td> 104506 </td><td>ガーデン用品店で入手可能な小型の水中噴水ポンプ</td></tr><tr><td>噴水ポンプ用ホース</td><td>あらゆるラボ供給会社</td><td></td><td>噴水のポンプと互換性のあるホース</td></tr><tr><td>プラスチック製のクランプ</td><td>ハードウェアストア</td><td></td><td>クッキーにホースを保持するクランプシートの</td></tr><tr><td>ファルコンマイクロテスト平底96ウェルのポリスチレンプレートから透明なプラスチックの蓋</td><td> BDファルコン www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td>アイスキャップの苗木のプレートをカバーするための透明なプラスチックの蓋</td></tr><tr><td> 3M細孔サージカルテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch直径のステンレス鋼ボール</td><td>ハートフォードテクノロジーズ、ロッキーヒル、コネチカット州</td><td> 034から006 - 1K </td><td>収穫後の根の組織を妨害するために使用</td></tr><tr><td> 3インチの弾性ヘアバンド</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>苗のプレートにルートのプレートを固定するために使用</td></tr><tr><td>直径4mmの木製串</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>これらの串は、通常、kabobsを準備するために使用されます。 </td></tr><tr><td>フィッシャーサイエンティフィックヌンクブランド、フリットなし1 mLをフィルタープレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 278012 </td><td> 96ウェル底部の穴と苗のプレート。 </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96ウェルトール-チムニーPCRプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14-230-242 </td><td> 96ウェルルートプレート</td></tr><tr><td>寒天 - 細胞培養テスト済み</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 Morpholinoethanesulfonic酸（MES） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td>ムラシゲとスクーグ（MS）基底塩の混合物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M - 5524 </td><td></td></tr><tr><td>イージーピールのヒートシールホイル</td><td> ABgene米国</td><td> AB - 0745 </td><td>組織破壊する前にルートのプレートをシールするためのヒートシールフィルム</td></tr><tr><td>ダックのブランドエクストラワイド梱包形態テープ、3.00&quot;X 54.6ヤード</td><td>オフィスマックス www.officemax.com </td><td>項目なし。 21242139 </td><td>接着テープストレージのためのDNA抽出を含むシーリングマイクロプレート用</td></tr><tr><td>シーリングローラー</td><td> Bio - Rad社</td><td> MSR - 0001 </td><td>手は、マイクロプレートの上に粘着シールテープを押圧するための転造工具を開催</td></tr><tr><td> 96ウェル金属サーマルブロック</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 36400〜66 </td><td>組織の収穫のためのルートのプレートを凍結するために使用</td></tr><tr><td>ワットマンろ紙</td><td>ワットマンインターナショナル</td><td> 1002 090 </td><td>表面殺菌の種子のために使用</td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 13から678 - 6A </td><td> 5 ¾苗プレートに種を転送するために使用される&quot;使い捨てパスツールピペット</td></tr><tr><td>パイレックスグラタン皿（20センチ× 30センチ） </td><td>ターゲットデパート</td><td></td><td>ドライアイス/エタノール浴を構築するために使用。 </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

それは植物の多数の遺伝子型を必要とするプロジェクトを開発するための植物科学者のために一般的になりつつある。あらゆるジェノタイピングプロジェクトの最初のステップは、個々の植物から組織サンプルを収集することです。このタスクの伝統的なアプローチは、一度に1台ずつの植物をサンプリングすることです。個人の遺伝子型の数百または数千に1つの願いは、しかし、タイピングパイプラインの重要なボトルネックで、この戦略の結果を使用している場合。ここでは説明しているアイスキャップ法は、ある科学者が一日の1,2で数千本の苗木から組織を収集できるようにすることで、この課題へのハイスループットなソリューションを提供します。スループットのこのレベルは、組織はむしろ、一度に1台ずつではなく、96枚ごとの植物から収穫されているという事実によって実現されています。 アイスキャップ方式では、苗の成長、組織の収穫、およびDNAの抽出を行うための統合プラットフォームを提供します。アイスキャップのための基礎はseedliの成長です。96ウェルプレートの積層ペアのNGS。アッパープレートのウェルは、個々の苗が発芽する寒天の増殖培地のプラグが含まれています。ルーツは、寒天培地を下に成長する穴に通し、上部プレートを終了し、水を含む下側プレートに渡します。アッパープレートの苗は、室温でままDNA抽出のために組織を回収するために、ルートの組織を含む下側プレート内の水が急速に凍結されています。アッパープレートを氷と96実行可能な苗とワンプレートで凍結96ルートの組織サンプルを一つのプレートをもたらして、離れて下側プレートから剥離される。それがルートの組織をキャプチャするために氷を使用​​するための手法は、&quot;アイスキャップ&quot;という名前です。苗を含む96ウェルプレートは、ホイルで包み、低温に転送できます。このプロセスは、苗のさらなる成長を中断しますが、彼らの生存率には影響しません。遺伝子型の解析が完了したら、目的の遺伝子型を持つ苗木を96ウェルpから転送することができますさらなる伝播のための土壌に遅れて。我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米の苗を使ってアイスキャップ方式の有用性を実証している。我々は、メソッドはまた、96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ植物の他の種にも適用する必要があることを期待しています。

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping | Biology | Video

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

アイスキャップの方法は1つがそれぞれの苗から96ウェルプレートおよび非破壊的収穫根の組織で植物を育てることができます。このルートの組織から抽出したDNAは、遺伝子型の反応に使用することができます。我々は、アイスキャップがうまく機能することを発見した<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;、トマト、そして稲の苗。

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナ</emハイスループットジェノタイピング用96ウェルプレートで>とトマト

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

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Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

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22.7K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. アイスキャップの方法は1つがそれぞれの苗から96ウェルプレートおよび非破壊的収穫根の組織で植物を育てることができます。このルートの組織から抽出したDNAは、遺伝子型の反応に使用することができます。我々は、アイスキャップがうまく機能することを発見したシロイヌナズナ、トマト、そして稲の苗。

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

生物学

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナとトマト