我々は、NIH（受賞番号MKLにR00 NS072192、HD029178 AS.L.に、2 RO1 NS032457 CAWまで）からの支援に感謝しています。 MKLは、チルドレンズホスピタルボストンキャリア開発フェローシップ/ハーバードメディカルスクールショアフェローシップとアルフレッド·P·スローン財団のフェローの受賞者です。 CAWのは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。

1。胚アイソレーション/準備この手法は、マウスやラットのために使用することができます。このプロトコルでは、CSFの収集テクニックやマウス胎児脳と大脳皮質植郭清術を実証する。我々は一般的な手法の中に存在ラット対マウスの任意の重要な相違点についてコメントします。胎齢ステージングシステムでは、E1がラットのプラグの日のように分類されており、E0.5、マウスのプラグの日として分類されます。 <ol><li>シルガードシリコーンエラストマーと顕微解剖皿を準備します。シルガード184シリコーンエラストマーは、2つの部分の液体成分は、パートとパートBパートAおよびパートBとして供給されている重量又は体積で10:1の比率で混合される。液体成分が混合された後、皿の全面を覆うようにペトリ皿にSYLGARDエラストマーを注ぐ。いくつかの気泡が硬化プロセス中に放散され存在していてもよい。上のシャーレのふたを置き、elastomを許可ERは、治すために。エラストマーは、24時間、またはそれ以上の温度（ 例えば 37℃）で速く硬化、室温で硬化させることができる。液体成分が固化したら、解剖皿を使用する準備が整いました。皿は、それが手順に従ってきれいに掃除されていれば、複数の実験のために繰り返し使用することができます。 </li><li>マイクロキャピラリーピペット（針）の調製。マイクロキャピラリーピペットは熱を加えることによって調製し、以下の設定でナリシゲPC-10垂直マイクロピペットプラーを使用してプルされています：ワンステッププル;ヒーター＃2 58に設定され、100グラムプル重量。マイクロピペットの細い先端を慎重に罰金55位鉗子を使用してオフにスナップされます。針の結果として、平均内径が85μmである。 </li><li> CSFの吸引用吸引器アセンブリを準備します。キャピラリー針にマイクロキャピラリーピペット付属マイクロプランジャーを挿入します。あるいは、Tに接続されているアスピレータチューブアセンブリの端にプラスチック製の使い捨てフィルターを取り付けるマイクロキャピラリーピペットをO。アスピレーターアセンブリの反対側の端の位置にガスケットを介して針を押し込みます。 </li><li>ごみからシルガードで調製顕微解剖皿に分離胚を転送します。 </li><li>胚が明確に露出するように胚外膜や組織を削除します。各組織層初の子宮壁、次に脱落することができますが、細かい虹彩切除はさみ（ すなわちファイン科学ツール＃15000から02）を用いて解剖することができます。各移植部位で、最初の子宮壁は、脱落膜が子宮の長軸に平行に切開することができ、切開をして微鉗子を使用して、さらに開くことができます。脱落膜は胎児膜を露出させ、同様の切開後に除去することができる。ケアは、胎膜を切開または穿刺しないように注意が必要である。 </li><li>無菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、ピペットと同様キムワイプまたはフィルタを使用して周囲の胚から余分な水分を取り除く本稿では、三角形に切る。 </li></ol> 2。心室CSFのコレクション<ol><li>解剖顕微鏡下で胚を可視化：マウスでは、胚は、1つは、発生中の胚のサジタルビューを有するように、その側に敷設する必要があります。ラット胚E16以前で、頭蓋から尾の方向に、その最長の平面寸法に沿って、その背脊柱に胚を置き、胚はその背中に横たわっているかのよう。このようにしてCSFは、左右両方の側脳室から収集することができる。 </li><li>着実にピペットが挿入された後に神経上皮細胞と接触しないようにしようと、側脳室、脳室、または大槽にマイクロキャピラリーピペットを挿入します。マウス胚E14.5以上では、CSFは、右心室から吸引してから針を外し、左心室に挿入することができます。 E14.5より若い胚における心室と神経管の開存のため、全体CSFのボリュームは、多くの場合、単一の針挿入と側脳室から吸引することができる。接続心室の発育時間と開通が若干異なる場合がありますので、マイクロキャピラリーピペットも最大CSFの体積を収集するために大槽に挿入することができますしかし、これは必ずしもそうではありません。 </li><li>一度マイクロキャピラリーピペットを負圧を作成し、CSFを吸引するために、マイクロプランジャーのいずれかを使用して、ピペット内に髄液を吸引し始める慎重に、ゆっくりと、側脳室、脳室、または大槽内に挿入され、または提供することにより、 CSFは優しくゆっくりと制御された方法でマイクロキャピラリーピペット流れ込みを始めるように口の中で作成された穏やかな負圧。私たちは、視聴者がこれらのアプローチに向けての施策に関する自国の当局者と確認することをお勧めします。 </li><li>負圧を適用し、マイクロキャピラリーピペットにCSFを収集し続けています。E16.5/E17または年下のマウスおよびラットの胚の両方では、それは、マイクロキャピラリーピペットが古い胚ではインチであることを頭の側面に形成ディボットの出現によって若干心室崩壊を観察することができる脳の大きなサイズに起因し、それが崩壊頭部を観察することができない場合があります。 </li><li>圧力をかけて停止し、静かに側脳室からマイクロキャピラリーピペットを削除します。 </li><li>穏やかに氷上で冷却されたエッペンドルフチュー​​ブにCSFサンプルを追放。 </li><li>動物やプールの全リター試料同一チューブ内からCSFを集め続ける。 </li><li>どんな汚染細胞を除去するために10分間、4℃で10,000×gで遠心分離します。 </li><li>神経上皮細胞や赤血球を汚染の兆候のためのサンプルを分析します。汚染の兆候は、通常、血液を帯びたスポットで曇りまたはピンク/赤、またはペレットの存在が登場する流体によって示されます。遠心分離した後に、CSFは、細胞または細胞の残骸の証拠について顕微鏡分析することができます。汚染の兆候がある場合、流体は捨てられるべきです。追加制御方式として、ペレットのコンテンツは、また、細胞のために染色することができる。クリーンCSF試料は、細胞培養、皮質培養、分析、ウェスタンブロット、ELISA、および他のアッセイに使用することができます。明確なCSFは新しい滅菌エッペンドルフチュー​​ブに転送する必要があります。サンプルは現在、液体窒素で凍結した他のサンプル、またはスナップをプールし、-80℃で保存し、分析に使用することができる流体の微小サンプルの凍結融解は小さな体積減少とタンパク質濃度の変化をもたらすかもしれません。これは、試料を凍結乾燥することによって回避できます。 </li></ol> 3。皮質植解剖<ol><li>シルガードで調製顕微解剖皿にごみから分離されたE14.5胚を転送します。 </li><li>ステップ1.5で説明したように胚外膜や組織から胚を取り出します。 </li> &lt;LI&gt;無菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、ピペットを用いて周囲の胚から余分な水分を取り除く。 </li><li>胚の残りの部分（ 図1A）からヘッドを分離頸部を通して解剖する。 </li><li>細かいメス（眼科ナイフ）を使用して、頭皮の正中線を切り倒した。細かい鉗子でこの切開の両側をつかみ、皮膚を取り除きます。次に、現像頭蓋の正中線の長さを実行して切開を作るために虹彩切除術のはさみを使用しています。その後、発展途上頭蓋骨の前部と後部の両端から2追加の切開、距離の約1/3を加える。解剖のこの部分から生じる頭蓋の&quot;フラップ&quot;を把握するために細かい鉗子を使用しており、皮質（ 図1B）を露光、現像頭蓋骨組織を除去する。 </li><li>左右の皮質半球（ 図分離半ば、矢状面で正中線に沿ってメスを二分の脳を使用して1B、C）。軟膜とクモ膜は皮質に取り付けたままであり、硬膜を開発頭蓋骨と一緒に削除されます。 </li><li>個別皮質半球を準備します。あなたは神経節隆起と途上皮質（ 図1C、D）を見ることができるように半球の内側面を上にして置きます。 </li><li>メスを用いて、開発して嗅球へ尾皮質上皮を通して冠状切開を行います。この切開は横方向と内側神経節隆起の前方境界から始まり、開発皮質原基（ 図1E）の前帯状領域を介して拡張する必要があります。 </li><li>横神経節隆起（ 図1F）の後方境界にちょうど尾別の冠状切開を加えます。この切開は、途上皮質原基の内側壁に神経節隆起の側面境界から拡張する必要があります。 </li><li>皮質の &quot;フラップ&quot;クレアを撤回皮質に機械的な損傷を避けるために、200μlのピペッターに付属のHBSSストリームからメスまたは穏やかな圧力を使用して、手順3.7と3.8で作られた2つの切開によってテッド。その後開発皮質（ 図1G、H）から横神経節隆起を隔てる境界に沿って横切開を行います。その後、横皮質表面は半球間の壁を満たして新皮質の頂点で、開発海馬や内側終脳の皮質の裾を離れ解剖。 </li><li>開発皮質（ 図1H）から横神経節隆起を隔てる境界に沿って横切開を加えます。 </li><li>解剖した皮質の外植片からシルガードプレート上にある任意の余分な解剖組織を除去する。一つは余分な解剖組織を離れてピペットに新鮮なHBSS緩衝液を用いて穏やかにピペッティングを使用することができます。解剖皮質は下向きに髄膜側（ 図1I）となりました。 </li></ol><ol><li>ガラスピペットに接続されている白金線ループを準備します。ガラスピペットの最後に挿入され折りたたまれた白金線でガラスピペットを熱し。白金線ループの終わりをねじることによって、ループの大きさが増加または減少しており、ループは、所望の外植片のサイズに合うように成形することができることができます。 （これは、予め用意して再利用できます。） </li><li>ループを殺菌するために白金線の先端を加熱します。 </li><li>解剖皮質外植片を分離し、ワイヤーループで使用する少量を残して、穏やかにピペッティングすることにより、余分なHBSSメディアを取り出します。 </li><li>直径4cmイメージング皿1cmのポリカーボネート膜を置きます。 </li><li>髄膜側が上を向いているように、白金線ループの側を使って、優しく皮質を反転させます。 </li><li>ループの途中で外植片を置き、に固有の静水圧の力を使用することによって、解剖皿オフ皮質外植片を持ち上げ平面上の外植片を持ち上げます。 </li><li>優しくポリカーボネート膜上に外植片を置き、離れて外植片は、心室表面が膜に接触することによる平面上の膜の上に残るように白金線ループを持ち上げる。 </li><li>優しく膜を持ち上げ、膜の下CSFまたは他のメディア、50μlのピペット。 </li><li>イメージング皿をカバーし、継続的な細胞増殖と植片の成長をサポートするために、24時間、5％CO 2で加湿二次容器に入れ、37℃でインキュベートする。 図2は、最終皮質植皿の準備の概略図を示している。 </li></ol>

<ol>
	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li><li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid.">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li><li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure.">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li><li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface.">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li><li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li><li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

心室CSFの収集のための記載の方法は、細胞アッセイ9の数は安定したタンパク質組成と一貫性のある活動と胚CSFの比較的純粋な試料が得られている。良いコレクションのテクニックと10 E14.5マウスの産仔数と、1は、CSFの10から15μlを集めることを期待することができ、およびE16ラットのごみから、1は、CSFの50〜90μlのについて収集することが予想されます。このコレクションのテクニッ?...

CSFは開発上皮1-6を浴びると脳の発達のために8月12日手がかりを推進不可欠圧力7と成長を提供する複雑な流体である。脳の発達の過程でCSFを勉強するために、我々は6,9開発のさまざまな段階でラットやマウス胚の開発から心室CSFを単離するための技術を開発した。分離する従来の方法は、ガラスマイクロ針を使用し、マイクロインジェクター1,2を使用して脳脊髄液を分離する含まれています。我々の手法は、その先端の改善組織浸透のための超ポイントを作成するために引き出されたガラスマイクロキャピラリーピペットを使用しています。ガラスマイクロキャピラリーピペットは、その心室CSFのコレクションはプレッシャーの中で穏やかに変化を制御することができるように吸引器に接続されています。 CSF信号の幹細胞の影響を調べるために、我々は、大脳皮質の外植片を解剖ポリカーボネート膜の上に置き、適切なCUの上に浮くlture媒体は、CSF試料9を補った。この手法では、メディアの減量化量は、CSF 9の効率的な利用を可能にする、文化組織をするのに十分である。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> Wiretrop IIキャピラリー針</td><td>ドラモンド·サイエンティフィック</td><td> ＃5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td>シルガード</td><td>エルズワースの接着剤</td><td>第184 SIL ELASTキット</td><td></td></tr><tr><td>アスピレータチューブアセンブリ</td><td>シグマ</td><td> ＃A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てフィルター</td><td>ベンチュリまたは地元の薬局</td><td>利用できない</td><td>標準的なタバコのフィルター</td></tr><tr><td> Roundstock眼科ナイフ（15度刺すナイフ） </td><td>世界の精密機器株式会社</td><td> ＃500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mmのガラス底培養皿</td><td>マテック（株） </td><td> ＃P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td>白金イリジウム線</td><td> Tritech研究</td><td> ＃PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nucleporeトラックエッチメンブレン</td><td>ワットマン</td><td> ＃09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> ＃SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td>虹彩切除はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> ＃15000から02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

CSFは、開発全体と成人期の動的に変化するプロテオームを持つ複雑な流体である。胚発生時には、発生期のCSFは前方神経管の閉鎖時に羊水から区別します。 CSFのボリュームは、神経上皮前駆細胞は脳室と脈絡叢生成CSFを裏打ちするように、その後の日にわたって増加します。発達中の脳や脊髄の神経幹細胞の胚CSFの接点は心尖、心室表面。 CSFは脳の発達の拡大のための重要な流体圧を提供し、時間的に特異的に神経前駆細胞への促進因子の重要な成長を配布しています。 CSFの機能を調べるためには、血液や開発終脳組織からの汚染なしに胚CSFの純粋な試料を分離することが重要です。ここでは、使用することができる胚性心室CSFの比較的純粋な試料を分離するための技術を説明質量分析、タンパク質電気泳動し、細胞と一次移植片培養を含む実験アッセイの広い範囲。我々はメディアやCSFの減量化量を使用した開発皮質組織を成長させるために多孔質ポリカーボネート膜上に皮質の外植片を分析し、文化する方法を示しています。この方法では、実験は標的細胞上のプロテオームCSFの生物活性を調べるために、さまざまな年齢や条件からCSFを用いて行うことができる。

CSFのコレクションは明確で、透明な液が得られるはずです。吸引とエッペンドルフチュー​​ブで、赤または黄色を帯びた流体によって実証されるように、血液からの汚染の証拠があってはなりません。また吸引とエッペンドルフチュー​​ブ内の組織の証拠があってはなりません。 CSFは遠心分離された場合、1はまた、汚染がないことを確実にするために顕微鏡CSFを評価することができま?...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

心室の脳脊髄液（CSF）は、胚の初期に脳の発達の間に神経上皮および大脳皮質前駆細胞を浸す。ここでは、その生物学的機能を調べるために、異なる年齢の齧歯類の胚から心室CSFを分離するために開発された方法を説明します。加えて、我々は我々の大脳皮質植郭清および培地またはCSFの最小限のボリュームで外植片の成長を可能にする培養技術を実証する。

解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

isolation-cerebrospinal-fluid-from-rodent-embryos-for-use-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K ビュー.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. 心室の脳脊髄液（CSF）は、胚の初期に脳の発達の間に神経上皮および大脳皮質前駆細胞を浸す。ここでは、その生物学的機能を調べるために、異なる年齢の齧歯類の胚から心室CSFを分離するために開発された方法を説明します。加えて、我々は我々の大脳皮質植郭清および培地またはCSFの最小限のボリュームで外植片の成長を可能にする培養技術を実証?...

ビデオ: Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

神経科学

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

ひと脳脊髄液中の Endopeptidomic の分析のための試料作製

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

麻酔下のマウスから脳脊髄液のコレクションのための改良法

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

炎症性サイトカインの脳内注射による広範囲にわたる大脳皮質脱髄のラットモデル

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

加圧齧歯動物に及ぼす影響の爆発による頭部外傷の中間の大脳動脈

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

中国式マッサージ技術:脳性麻痺ラットの運動機能強化

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal posture development, often accompanied by cognitive impairment. Massage, a traditional Chinese Medicine therapy, can coordinate Zang and Fu, regulate Qi and blood, make the viscera work more smoothly, and calm Yin and Yang. Furthermore, it has been an effective method for CP in clinical. This paper summarizes a set of simple and standardized manipulations of massage for young rats with CP, which is easy to follow. The procedure follows: first, massage of four limb acupoints, including Quchi (LI11) and Zusanli (ST36); second, massage of the abdomen acupoints Zhongwan (RN12), Tianshu (ST25), Guanyuan (CV4), and Qihai (CV6); and finally, massage of the abdomen of the rats. This set of massage methods considerably improved the motor function of young rats with CP and is simple, standardized, and easy to follow. We adapted this set of manipulation methods in animal models to promote the internationalization and standardization of massage.

著者スポットライト:動物モデルを使用した脳性麻痺におけるマッサージ療法の可能性の探求 

Here, we present a set of massage manipulations in the rat model of cerebral palsy that can considerably improve the motor function of cerebral palsy rats.

脳性麻痺ラットの運動機能障害を改善するための腹部マッサージ

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...