この作品は、NINDS（NS066071）とNIAAAからの助成金をサポートされていました。 （P50AA017823）エコへ。著者は、ロバート·クインと動物のケアのための実験動物資源学科のスタッフに感謝します。私たちは夏の学部リサーチフェロー（SURF）などの支援については、テクニカル·サポートのためにニコールBelletierをジャドソンベルモントに感謝します。また、コメントにデビッドキャメロンに感謝し、原稿の以前のバージョンで編集します。

プラスミドグリーン蛍光タンパク質発現との1。 のEx子宮内エレクトロポ<ol><li>プラスミドDNAの注射液は、蒸留H 2 O中0.33 mg / mlの最終作業濃度まで希釈したCAG-EGFP DNAを27を用いて製造されるキアゲン遠藤フリーマキシプレップは、形質転換された細菌からプラスミドを精製するために使用されています。 〜0.02％（w / vの最終）での高速グリーン色素が注入トレーサとしてのDNA溶液に添加される。 </li><li>外科領域を用意し、70％エタノール溶液でベンチトップと解剖顕微鏡のステージを下スプレーして拭いてください。前切開に70％エタノールで手術用のハサミとピンセットをスプレーし、水分を拭き取ります。 </li><li>すべての動きは、少なくとも1分間停止するまで時限妊娠スイス/ウェブスターダムは加圧シリンダからCO 2を充填し、ダムが監視されるチャンバ内に転送することによりE13に屠殺されています。 CO 2吸入によって犠牲にした後の胚は子宮から取り出され、内に配置10cmペトリ皿含む氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）。 </li><li>慎重に周囲の胚体外膜から各胚を分析し、氷冷HBSSに保つ。 </li><li>冷HBSSを含む第二の10cmペトリ皿に個別に各胚を転送します。将来の分析のために皮質領域から空間的に分離した皮質領域に注入するために世話をして、左大脳半球の脳室にDNA速い緑混合の2-3μlを注入するためにハミルトンシリンジを使用しています。 </li><li>エレクトロポには、鉗子で軽く胚を保持し、軽く頭の背側正中線上にピンセット電極の正のパドルを置き、軽く胚のあごの下に負のパドルを置く。エレクトロポを950ミリ秒間隔で区切った50ミリ長さの5〜30 Vのパルスを提供するようにプログラムBTX830エレクトロで達成される。これらの設定はBTX830モデル用です。他のシステムは、製造業者の命令に従って使用することができるNS。 </li></ol> 2。全体の半球植準備<ol><li>エレクトロポレーション後の胚は氷冷HBSSに戻されています。脳は胚ヘッドから皮膚と軟骨頭蓋骨を除去するために2つの＃5宝石商の鉗子を用いて除去する。鉗子は、その後、頭蓋骨から無傷の脳を削除するには、脳の下にスライドさせる。エレクトロポレーションした半球（左）は、脳から離れて解剖され、添付された中脳組織が削除されます。解剖手順ケアを通して左半球皮質を覆う髄膜に損傷を与えないように注意されています。 </li><li>一度解剖し、各胚は、カット1ミリリットルピペットチップでピペッターを使用してHBSS中に転送されます。半球は優しくコラーゲンコート培養インサート上に排出されます。最大6つの半球の外植片には、各24ミリメートルの挿入時に内側を下に配置されている。一度配置された、過剰HBSSをインサートから削除され、挿入はその後6ウェル皿のウェル1 35ミリメートルに配置されます。井戸はエクサが含まれていますメディアのctly 2.7ミリリットル：グルタマックスと2％のB-27を補充し、1％G5および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地。井戸からのメディアの数滴は、各外植片の上にピペッティングすることができますが、ウェルあたり2.7ミリリットルのオリジナル過剰にメディアを追加しないでください。 </li><li>外植片はコラーゲンフィルター上に配置されていたら、外植片を含む6ウェルディッシュはビラップスローゼンバーグ（BR）の室（また、水の加湿皿を含む）に置かれます。 95％/ 5％酸素/ CO 2混合ガスは、チャンバを閉じて密封し、95％/ 10％酸素/ CO 2ガス供給管を切断する前に、少なくとも1分間チャンバー内に注入される。 BR室は、その後培養期間の残りの37℃の組織培養インキュベーター、1-2 DIVに配置されます。 </li></ol> 3。組織学的検査のための植組織の固定<ol><li>ドラフト内で予熱した（〜80＆ド100ml中のホルムアルデヒドの最初の可溶化8グラムによってパガーノ固定溶液を調製グラム、C）蒸留H 2 O可溶化を促進し、穏やかに攪拌し、NaOHを集中して1-3滴を追加します。一度500mMのスクロース、100mMのHEPES、pH7.4で、50 mMのMgCl 2、250mMスクロース、50mMのHEPES中4％パラホルムアルデヒドの最終濃度5mMのKClであることは、ソリューションに8％パラホルムアルデヒド溶液を1:1で混ぜて可溶化、25 mMのMgCl 2、2.5mMのKClで、pHは7.4。 </li><li>外植片を37℃にパガーノ修正液を温める修正するには迅速に各ウェルの培養物からDMEM/F12メディアのほとんどを除去し、外植片の各ウェルにパガーノ修正5mlを加える。修正で完全に各外植片をカバーすることを確認してください。室温で1時間を修正しました。前に固定の1時間にフィルターから外植片を外さないでください。 </li><li>固定後パガーノ修正液を除去し、修正せずにパガーノ溶液（250mMスクロース50mMのHepes、25mMのMgCl 2を 、2.5mMのKClを、pH 7.4）で置き換えます。埋め込みまで4℃で10％のアジ化ナトリウムや店舗℃で数滴を追加します。 </li></ol> 4。埋め込みとS組織学のためectioning <ol><li>温水（55℃）100mlにふくらはぎ皮ゼラチン10gを可溶化することにより10％ウシ皮膚ゼラチン溶液を調製します。ホットプレートの上に置いてゼラチン溶液は、可溶化されるまで、定期的に60℃と渦を設定します。 </li><li> 10cmペトリ皿の底に10％のゼラチン溶液約10mlを注ぎ、30分が凝固することができます。これは、外植片を埋め込むための &quot;パッド&quot;を形成します。これらのパッドは、事前に準備された日とし、4℃で保存することができますシャーレの底に格子を描き、グリッドの各ボックスに、個々の外植片を転送するために定規を使用しています。残留パガーノ溶液を除去し、ピペッターを使用して、暖かい10パーセントゼラチン溶液で各外植片をカバーし、固化することができます。各外植片が完全にあまりにも多く、一度に温めるゼラチンを添加することによりパッドを溶融しないように注意しながら、ゼラチンで囲まれるまでゼラチン溶液をゆっくり添加を再開します。 〜1時間硬化さゼラチンを可能にします。一度個々ををかたくなにUAL外植片は、ゼラチンの小さなブロックに切り出すことができる。ブロックは、前ビブラトームとセクショニングに24〜48時間の修正パガーノで後固定されています。 </li><li>ゼラチンブロック内の外植片は嗅球を配置し、厚さ100μmにおける前頭面に区画されています。セクションは、収集され、保管され、PBS中の4で+ 0.1％アジ化ナトリウム°Cの免疫組織化学的処理まで。 </li><li>免疫組織化学的検出、24ウェルプレート（ウェルあたり2から3節）にセクションを転送することによって行われます。 + B（PBS + 0.5％トリトンX 100、2％BSA）を0.5ミリリットルPBSTを追加することにより、結合の最初のブロック、非特異的抗体を各ウェルに、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートする。適切な一次抗体は、その後、PBST + Bで希釈し、ウェルあたり0.4mlを室温で一晩のインキュベーションのために追加されます。プライマリは3X PBSは、少なくとも10分間ずつ洗浄して洗い流す。二次抗体、2μg/ mlのヘキスト33342核染色法は、その後、PBST + Bで希釈し、サンプルを室温で2時間インキュベートする。穏やかに振盪しながら。三PBSの洗浄（10分毎に）が実行され、その後のセクションでは、90％グリセロール、50mMトリス、pH7.4の、マウントメディアを使用して、スライド上に搭載されている。 </li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

全体の半球外植片 - - 早期皮質発達の研究（E13-E15）のための我々は実験モデルを改善し、評価した。モデルは、移行および大脳皮質25,37の層6を構成する興奮性ニューロン系統の分化の解析に有用であることが証明されました。システムの主な利点は、準備が単純、脳の発達のこの早期、臨界期中にエレクトロポレーション、薬理学的操作とイメージングのためのニューロン〜3）実?...

連続して生成されたニューロンの協調的な増殖、遊走及び分化を通じて哺乳類大脳皮質を形成する。各ニューロンは脳室帯に生まれた（VZ）と皮質板（CP）の1を形成し 、中間帯（IZ）にVZから移動されています。彼らは異なる皮質領域を通過する際、移行のニューロンが細胞外環境と開発組織内の他の細胞成分（ 例えば放射状グリア）に依存する移行2,3の複数のモードを表示します。皮質ニューロンはその後ニューロン移動の逮捕とdendritogenesis 4の同時プロセスにおける成形皮質板の上部に移行を逮捕。 皮質の発達は、胚の始原日網状層6またはpreplate（PP）、その上に重なるVZパイオニアニューロンの層の設立を通じて、11月13日（E11-13）5との間で開始されます。プロスペクティブその後層6皮質ニューロン（VZで生まれすなわち第一皮質ニューロン）の向きは、そのステレオタイプのパターンで細胞体およびPP 7内の別個の層に合体。これらのイベントは、表面的な限界（将来の皮質第1層）とディープゾーン、サブプレート細胞（一過性皮質の第7層）から成る後者にpreplateを分割します。このプロセスは、preplate分割と呼ばれる、大脳皮質8の将来の成長の基盤となるイベントです。 多くの遺伝的変異は皮質発達9の様々な側面を混乱させることが確認されている。皮質の開発も悪影響コカイン10とアルコール11と摂取毒素への暴露によって影響を受ける可能性があります。開発中に発生する皮質奇形、神経障害（ 例えば自閉症、統合失調症）への貢献者である可能性が高いので、皮質発達に摂動の実証的調査が内在している重要LY。これは、遺伝的または毒素効果の迅速なアッセイを可能にするだけでなく、脳の発達12の初めに、この期間中に差別ニューロン、他のタイプの細胞と細胞外マトリックス（ECM）との間の相互作用の可能性を維持することが皮質の発達を研究するための手法を確立するためにかなりのに重要である。 スライス外植片13は、このようなシステムを提供していると広くアッセイ皮質ニューロンの発達14から16に使用されてきた。しかし、スライスアッセイは、神経細胞の遊走およびラミネーションは、おそらく脳の発達とアンカー放射状グリア足場を囲む髄膜細胞への損傷によって17異常なことができないという欠点に苦しむことができます。放射状グリア繊維はスライスによる基底膜の皮質ニューロンの移行18中断のための重要な基質であるとしてローカルに放射状グリアアーキテクチャを混乱させ、変化した皮質の移行につながる可能性があります。加えてSLI外植片の表面CEDは、これらの分野におけるECMの通常の構図を変化させることができる死んだ細胞の領域を提供します。 より最近のアプローチは適切な健康な細胞型とECMに囲まれているスライスの奥深くにある細胞に自分の分析を当てている。しかし、いくつかのケースでは、これらの新しいアプローチは、元の厚い培養スライスはスライスの比較的正常なインテリアが分析19から21のために利用可能になるように固定後、凍結切片またはパラフィン包埋切片であることを必要とすることができます。文化だけでなく、分析のために固定されたスライスのその後の凍結セクショニングのライブスライスを準備するセクショニングオリジナルビブラトーム両方がこれらのアッセイのためのケアと労力が動作する必要があります。 初期の皮質の発達についての研究のためのシンプルな、補完的なアプローチを提供するために、我々は初期の皮質の発達についての研究を促進する13既存のスライスのアプローチを変更しました。我々は、WHを開発した65分当たりの回転数と16〜18時間22,23に対して許可される器官の成長で振とう培養を関与して既存のE14全半球モデルに似たOLE半球植モデル。我々のアプローチでは、全体の半球の外植片を48時間器官皮質の成長を延長するために、高酸素培養雰囲気21,24内で半透膜13の上に配置されます。また、このアプローチは、皮質ニューロンの開発の一貫したエレクトロポレーションを可能にします。胚が子宮から取り出され、プラスミドDNAを導入するエレクトロポレーションとは、その後、終脳解剖されています。各半球を単離し、コラーゲンコートフィルタで内側を下に配置されます。外植片は、その後、48時間、preplate分割8を含む期間の期間培養する。培養期間中、L6のニューロンは皮質板内に正しく配置区別ニューロン25に前駆体から開発しています。この期間を通じて開発神経細胞は、 生体内の対応するセルに立ち向かうであろう適切なECMと細胞型に囲まれています。このシステムはすでにエタノール毒性26、層6の形成とpreplate分割7,25の根底にある携帯電話のイベントを解読に貴重であると判明しました。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

皮質の発達は、前駆細胞、血管、髄膜および関連する細胞外マトリックスを含む神経細胞と非神経要素間の複雑な相互作用を伴います。彼らは適切な器官の環境を提供するため、皮質スライス外植片は、多くの場合、ニューロンの分化·発達を制御し、それらの相互作用を調べるために使用されます。有益なものの、スライス植モデルは異常な細胞積層および移行などの欠点に苦しむことができます。ここでは、皮質切片より準備が簡単で、一貫性のある器官の移行およびラミネーションを示す初期の皮質の発達についての研究のために全体の大脳半球の植​​システムについて報告する。このモデルシステムでは、初期のラミネーションと移行パターンは、preplate分割の期間を含め、in vitroでの 2日間にわたって、通常の前向き皮質層の間に6フォームを進みます。次に、 元の子宮内エレクトロポレーション（EUEP）を開発背内側皮質に開発ニューロンにGFPの発現を標的に〜80％の成功を実現したアプローチ。 全体の半球植モデルはエレクトロポレーション、薬理学的介入とライブイメージングアプローチのための初期の皮質発達にアクセスできるようになります。トランスフェクションおよび面積ターゲティング一貫性の両方を向上させながら、この方法では、 子宮内エレクトロポレーション（IUEP）アプローチで求められる生存の手術を回避することができます。この方法では、神経細胞の増殖、遊走および分化の実験的研究を促進するであろう。

げっ歯類の胚性皮質が発達期間を通して横neurogenetic勾配を示し、そのようなその横新皮質は、背内側皮質28よりも約1日より成熟している。 6層のニューロンの大部分はこのように横皮質でE12に（また、フィールド40 5と呼ばれる）とE13で背内側野（またフィールド1〜5と呼ばれる）で（S期の最終的なを示すIE）が生成されます。 Preplate分割は6層ニューロンの生成?...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

このプロトコルは含ま改良植手順を説明<em&gt; EX子宮</em&gt;マウス胎児から全体の大脳半球のエレクトロポレーション、解剖や文化。準備が早い皮質開発中に遺伝子機能の薬理試験およびアッセイを容易にします。

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K ビュー.  SUNY Upstate Medical University. このプロトコルは含ま改良植手順を説明 EX子宮マウス胎児から全体の大脳半球のエレクトロポレーション、解剖や文化。準備が早い皮質開発中に遺伝子機能の薬理試験およびアッセイを容易にします。

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

神経科学

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

解剖大脳皮質植で使用するための齧歯類の胚から脳脊髄液の分離

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...