私たちは、RNA精製プロトコルを編集中で彼らの助けのためにサシャライヒマンとドミニクSantiard-男爵に感謝します。

1。ジャーナル：手術ブロックから標本を回復する手順ラボで<ol><li>急行運送会社からの輸入契約を得る。 </li><li>研究室で担当者を（電話番号及び電子メールアドレス）を示す実験室の住所と10（または25）出荷形態を記入してください。 </li><li> 10（または25）サンプルフォームは10（または25）に1の番号が準備します。これらのフォームは、患者の）匿名ID、手術のb）の日付と外科医が追加したいc）のいずれかの追加の発言に通知するために専用のスペースが含まれています。 10（または25）パッド入りの封筒を（150×210ミリメートル）を準備します。 </li><li> H 2 O（GHCL）はジエチル6 Mグアニジン塩化ML（DEPC）処理したRNaseフリー試薬25（または65）を用いて調製。 </li><li> 10または25を埋めるGHCL水溶液2.4ミリリットルで5 mlの滅菌ポリエチレン丸底チューブの番号。 </li><li>プレスチタニウムなく、これらの管の上の部分を埋めるためにアルゴンガスを使用したghtly外科用キャビネット内のストレージ数年間GHCL溶液の酸化を防ぐために、キャップに。 </li><li>スクリューキャップで50 mlの滅菌ポリプロピレンコニカルボトムチューブが5 mlチューブをご紹介します。を50mlチューブに5ミリリットルチューブを保持するためにきれいな紙の組織片を使用し、チューブを閉じます。 </li><li>パッド入りの封筒、出荷フォーム、サンプルフォームで段ボール箱にポリスチレンラックとラック上の50mlチューブを置きます。 </li><li>彼らの読書を促進するために段ボール箱の蓋の内側：命令（1.12から1.19参照）を貼り付けます。 </li><li>病院で担当者にメールで段ボール箱を送ってください。 </li></ol>入院して<ol start="11"><li>手術室に手術キャビネットから段ボール箱を持参してください。注意注意：手順は免疫妥協患者が含まれた場合は、段ボールは、手術室に運ばれるべきではない。 </li><li>手術中に、網膜SPECIMを配置番号5ミリリットル滅菌ポリプロピレンにENがGHCL溶液を充填。しっかりとチューブを閉じます。 </li><li>簡単にチューブを返します。 </li><li> 10分間血管ロッカー上にチューブを置きます。 </li><li>添付サンプル番号がフォームに入力します。 </li><li>対応する番号を50mlチューブに識別番号を報告します。 </li><li>を50mlチューブに手術標本で5 mlチューブを導入し、ティッシュペーパーを交換してチューブを固定します。 </li><li>添付パッド入りの封筒のいずれかでチューブとそれに充填サンプルフォームをご紹介します。それを閉じます。 </li><li>ピックアップのための明白な運送会社に電話。 </li></ol> 2。 RNA精製ラボで<ol><li>チューブを上下に移動しながら1分間ホモジナイザーGHCLソリューションとその5 mlチューブポリプロピレンで標本を均質化。 </li><li> 2 M酢酸カリウムのpH 5.0の270μLを加える。その中シェーカー上にチューブを配置することによって、10分間激しく振る水平位置（420分-1）。 </li><li> 20℃で5,000 rpmで（6,500×g）で10分間の遠心</li><li>ペレットを乱すことなくスムーズに可溶性画分を吸引。 </li><li> 14ミリリットル滅菌チューブに移します。 </li><li> 100mMトリスpH8.0で、N-ラウロイルサルコシン1％5.3ミリリットルを追加します。 </li><li>塩化セシウム（セシウム）の3.2グラムを加え、ボルテックスでチューブを混ぜる。 </li><li>滅菌11ミリリットルのポリアロマー遠心管でのCsCl /エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の1.8ミリリットルを追加します。 </li><li> 10ミリリットル滅菌パスツールピペットを用いて、密度クッションを乱すことを避けるためにチューブの端にゆっくりとスライドさせて、1.8ミリリットルのCsCl / EDTAにRNA溶液を移す。 </li><li>ローターにチューブを（必要に応じて網膜ずにバッファを含む第二の管）を置きます。 </li><li> 20℃で32,000 rpmで（225,000×g）で、24時間を遠心</li><li>滅菌したパスツールピペットを用いて、溶液の優れた部分を削除して、それを捨てる。 </li><li>確認しながら、徐々に削除しますDNAは（粘性）は、第2の滅菌パスツールピペットで吸引し、それを破棄している瞬間。 </li><li>サード滅菌パスツールピペットを用いてRNAペレットを解放しないように注意しながら、残りの溶液を除去。 </li><li>メス火炎滅菌を持つセクション管の底には、その後チューブ逆さまに無菌の視線上にそれの残りの部分を置く。 </li><li>チューブを逆にしGHCL160μlのと微妙にすすいでください。 </li><li> 10分間ペレット乾燥してみましょう。 </li><li> 150μlの（ - 1mMのEDTA - 0.1％SDS、10mMのトリスpH7.5）中でペレットを再懸濁します。 </li><li> 2ミリリットル滅菌マイクロチューブにソリューションを移し、その後30μlの（ - 1mMのEDTA - 0.1％SDS、10mMのトリスpH7.5）で残留ペレットを収穫。 </li><li> 150μlのを（ - 1mMのEDTA、10mMのトリスpHは7.5）を追加します。 </li><li> 3 M酢酸ナトリウムのpHは5.0、ボルテックスチューブ30μlのを追加します。 </li><li>エタノール100％（-20°C）、ボルテックスチューブの900μLを加える。 </li><li>氷の融解でチューブ30分置きます。 </li><li> CEN4℃15,000 rpmでチューブ30分℃でtrifuge </li><li>微妙に可溶性画分を吸引し、それを捨てる。 </li><li>ボルテックスチューブ、500μlの70％エタノール（RT）を追加します。 </li><li> 4で15000回転（18,000×g）ででチューブ20分を遠心℃に</li><li>リンス工程（70％エタノール）を繰り返す。 </li><li>手短に遠心し、P200のピペットで残りのエタノールを除去する。 </li><li> 10分間ペレット空気乾燥してみましょう。 </li><li> 50μlのDEPC処理H 2 Oでペレットを再懸濁し</li><li>ボルテックスで精力的に混ぜる。 </li><li>水浴中で15分間45℃でインキュベートする。 </li></ol> 3。ゲル電気泳動によるRNA解析<ol><li>化学フード内側のアガロースゲルを注ぐ。 </li><li>滅菌済み1.5ml微量遠心チューブに、分析されるRNA2μlのとサンプル前処理バッファーの6.4μLを加える。 </li><li>第二の1.5 mlのチューブに、RNA基準3μlのとサンプル前処理バッファーの9.6μLを加える。 </li><li> 65℃で15分間チューブを加熱°C、氷の上に置く。 </li><li> RNAサンプル管とRNA基準チューブ内の色素で1μlのEBローディングバッファー中の色素なしで1μlのエチジウムブロマイド（EB）ローディングバッファーを追加します。 </li><li>染料の1（ブロモフェノールブルー）ゲルの底の2/3に達するまでバッファを実行中の化学フードインサイド100 V、 - 80の下のゲルを実行します。 </li><li>ゲル250ミリリットルデDEPC処理2×SSCで2回15分を洗浄します。 </li><li> UV照射下でのデジタル化された画像を取る。 </li><li>上のバンド（23S rRNAの）と低域（16S rRNAの）との比率を計算します。 </li></ol> 4。 RNAの最終精製<ol><li> DEPC処理H 2 O（必要な場合）と100μlにRNAサンプルの音量を調整します。 </li><li> 100フェノール酸の液（1ミリリットルフェノール酢酸ナトリウム、pHが5.2の50 mMにDEPC処理H 2 O + 130μlの飽和）精力的に、ボルテックス。を追加</li><li>室温で13,000 rpmで（15,000×g）で10分間遠心します。 </li><li>カーヴrは小説滅菌済み1.5mlマイクロ遠心チューブに水相（上相）を慎重にして転送。 </li><li> 3 M酢酸ナトリウム、pHは5.2とエタノール250μlの100％（-20℃）10μlのを追加します。 </li><li>溶ける氷にチューブ30分間インキュベート。 </li><li> 4℃14,000 rpmで（18,000×g）ででチューブ30分間遠心℃に</li><li>慎重に可溶性画分を吸引し、それを捨てる。 </li><li> 500 70％エタノール（室温）の添加、ボルテックスチューブを追加します。 </li><li> 4℃14,000 rpmで（18,000×g）ででチューブ20分を遠心℃に</li><li>リンス工程（70％エタノール）を繰り返す。 </li><li>手短に遠心し、P200のピペットで残りのエタノールを除去する。 </li><li>空気は10分間ペレットを乾燥させてみましょう。 </li><li> DEPC処理H 2 O50μlの中にペレットを再懸濁し</li><li>その後45時チューブ15分℃でインキュベート</li><li> RNAサンプル2μlの上で260 nmおよび280 nmでの吸光度（ABS）を測定します。比Abs260/Abs280を計算した。 </li> &lt;李&gt;ストア-80 RNAサンプル°C（数年間安定した）。 </li></ol> 5。ソリューションおよび清掃手順<ol><li>酢酸カリウム2 M、pHは5.0：DEPC処理H 2 O 70mlの中に19.6グラム酢酸カリウムを溶解DEPC処理H 2 Oで5回洗浄し、続いて15分間1M NaOHでにそれを浸漬することによってpH計プローブを清掃酢酸でpHを5.0に調整し、次にDEPC処理したH 2 Oで100mlに音量を調整する</li><li>トリス-HCl、100mMの、pHが8.0、N-ラウロイルサルコシン、1％：0.5 MトリスベースpH8.0の40mlのにN-ラウロイルサルコシン（ボンネットの下）の2グラムを溶かす。のCsCl / EDTA）DEPC処理H 2 Oで200ミリリットルにボリュームを調整する：50 CsClを96gのmlの10mMのEDTA pHを7.5 DEPC処理H 2 Oを用いて調製しオートクレーブDEPC処理H 2 Oで100mlに音量を調整するpH値&lt;7.5をチェックします。 </li><li>アガロースゲルは1％：62ミリリットルDEPC処理したH 2 Oでアガロースの1グラムを入れて電子レンジで沸騰。 12.3 M 18mlのを追加ホルムアルデヒド、5倍MOPS 20mlの。化学フードの内側に注ぐ。 </li><li>サンプル前処理バッファ：俄仕立て準備する。 5倍MOPSの化学フード8μL、12.3 Mホルムアルデヒド及びホルムアミド40μlの16μlの内部ミックス。 </li><li> EBのローディングバッファー（染料なし）：リハーサルなしの準備する。 DEPC処理したH 2 Oで調製した80％グリセロール中に20μlの4μlの10 mg / mlのエチジウムブロマイドを追加する</li><li> EBのローディングバッファー（色素）：リハーサルなしの準備する。 0.25％xylenシアノール、DEPC処理H 2 Oとの0.25％ブロモフェノールブルーを含む80％のグリセロールを10μlに2μlの10 mg / mlのエチジウムブロマイドを追加</li><li> 、60ミリリットル5倍MOPSへ12.3 Mホルムアルデヒドの54ミリリットルを追加し、DEPC処理H 2 Oの186ミリリットル：バッファを実行している</li><li>攪拌しながら37℃で2時間で0.1％v / vのジエチルとインキュベート蒸留水°C：H 2 OをDEPC処理。オートクレーブで滅菌する。 </li><li>ホモジナイザーのクリーニング：1 Lに洗浄液を25ml（RBS）を追加DEPC-H 2 Oを処理し、撹拌しながら、軸1分飛び込む。 60で2時間インキュベートする℃にアルミにDEPC処理H 2 Oラップ楽器でよくすすぎ、計器箱に入れ。箱を包む。オートクレーブで滅菌する。 </li><li>電気泳動装置のクリーニング：装置、トレイと15ウェルコームを洗う。 3％過酸化水素で15分間インキュベートする。 100％エタノールで一回すすいでください。乾燥した空気。 </li><li>ガラス皿のクリーニング：すべての夜ガラス皿をRBS 2％を清掃し、その後200℃で滅菌前蒸留水ですすぎ</li></ol>

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

外科ブロックから組織回復のための手順の開発は、網膜剥離のトランスクリプトーム解析に不可欠となっています。ひとつは、手術のこのタイプは、緊急時にと眼科医がオペレーティング彼らが操作したときの生物学的な研究プログラムに参加するには少し時間を持っていることを実践されていることに気づくべきである。この網膜切除はまた、統計数値に到達するための簡単​​な方法は?...

網膜剥離の主要な治療上の目的（RD）は、視細胞の損傷や網膜色素上皮細胞からの光受容体の分離から生じる網膜の炎症を制限する方法を見出すことである。 RDの間に、RPE細胞が活性化され、移行脱分化、及び合併症につながる収縮力を発揮し、網膜剥離の表面で増殖する。 RDのトランスクリプトーム解析は、RD、手術と組み合わせて最終的な視覚的な結果を改善することができ、したがって将来の治療用分子以下の修正式で標的遺伝子を同定するための方法です。デオキシリボ核酸（DNA）、遺伝学的研究のために広く使用され、後者であるのでこれはよく知られているリボ核酸（RNA）が安定していないが、その安定性は、古い30,000以上の年2の古生物学的サンプルからネアンデルタール人のゲノムのシーケンシングを可能にしていた。メッセンジャーRNAへのゲノムからの遺伝子のDNAの転写です主要な遺伝子発現のプロセス、およびmRNAが信号を構成するために不安定である。 RNAは信号を終端リボヌクレアーゼ酵素により急速に分解される。発現は研究室で研究される前に、組織が生物から分離されると、RNAは、非常に頻繁に分解される。分解されたRNAは、分析、遺伝子発現に適していない。研究室のスタッフは、手術に参加することはできませんので、我々は容易であり、唯一の外科医が適切なRNaseフリーソリューションに組織を回復することが必要手順を開発しました。組織のRNAが安定し、この溶液中、室温で72時間後の劣化の兆候なしに分析することができる。検体からRNAを実験室3に転送された後、塩化セシウム勾配超遠心分離を含む標準化された方法で精製されています。その後、RNAの品質はアガロースゲル電気泳動により及びRT-PCRによって評価される。 RNA精製プロトコルは有するDNAおよびRNAのために異なっており、RNA、遺伝子発現研究における人為信号を生成するDNA分子によって汚染されないことを保証し、その濃度に応じて分子を分離する利点。また、定量的に細胞内で最も豊富に存在するRNAであるトランスファーRNAは（たtRNA）は、リボソームRNA（rRNAs）とメッセンジャーRNA（mRNAの）、というこれら二つの最後のものから同じ物理的性質に応じて分離されている精製プロセスの生成を終了する。マイクロアレイ分析プロトコルのほとんどは逆転写酵素とtRNA 4-6によって阻害されるRNAポリメラーゼの使用が関与するので、調製からtRNAの除去に有用である。手術標本から精製されたRNAは、標準的なプロトコルを用いて標識し、マイクロアレイチップにハイブリダイズし、その結果、2つの相補的な方法が、偽発見率法を用いて、相互情報とvisualiに基づく新しい方法を用いて分析されているWebベースのサーバーRetinobase 7,8にアルファベットのゼット。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

網膜剥離（RD）は、網膜色素上皮（RPE）から神経感覚網膜の分離を説明しています。 RPEは、光に敏感な神経細胞、光受容体の正常な機能に不可欠である。 RPEから網膜の剥離が細胞外液で満たされている物理的なギャップを作成します。 RDは、イオンと代謝物の生理的な交換がひどく乱されているので神経感覚網膜とRPEの両方に影響を与える細胞および分子有害事象を開始します。ビジョンのための結果は、ビジョン1の回復の2つの組織の結果を迅速にreapposition以来剥離の期間に関連しています。 RDの治療はもっぱら外科です。硝子体ゲル（硝子体）の除去は、網膜剥離を支持する戸建周辺網膜の除去、非本質的な部分が続いている。削除網膜標本は無主物 （1個）であり、その結果、通常は破棄。これらの手術標本からRNAを回復するには、我々は外科ブロックから実験室への転送時にRNAの保全を可能にする手順ジャーナルを開発しました。我々はまた、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコルは、精製されたRNAは全体的な遺伝子発現解析に適していることを保証する。 RNAの品質は、両方のRT-PCRおよびマイクロアレイ分析により検証した。データの分析は、RD間に炎症や変性体の同時関与を示しています。

手順ジャーナル（ 図1）は 、私たちは手術ブロックから精製したRNAに網膜の標本を回復し、網膜剥離のトランスクリプトームを分析することができます。単球走MCP1遺伝子CCL2のアップレギュレーション、および遺伝子GNAT1、短波コーンオプシンOPN1SW、及びhomeogene CRX（ 図2）伝達棒感光体の発現の減少で網膜剥離の結果。 GNAT1、OPN1SWと<e...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

私たちは、網膜剥離のトランスクリプトーム解析のために網膜切除から網膜のサンプルを使用していました。我々は外科ブロックと実験室間のRNA保全を可能に手順を開発しました。我々は精製されたRNAはマイクロアレイ解析に適していることを保証するために、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコル。

ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K ビュー.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. 私たちは、網膜剥離のトランスクリプトーム解析のために網膜切除から網膜のサンプルを使用していました。我々は外科ブロックと実験室間のRNA保全を可能に手順を開発しました。我々は精製されたRNAはマイクロアレイ解析に適していることを保証するために、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコル。

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

医学

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

ヒトブルセル脊椎椎椎症の診断と外科的治療

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...