Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.

注：手順は大学ピエール·マリー·キュリー（CE5 / 2009/048）から倫理委員会ダーウィンによって承認されたゼラチン溶液、楽器、ビブラトーム、文化メディアと培養プレートの1.準備<ol><li>少なくとも1日の実験の前に20％のゼラチン溶液を準備します。 <ol><li>ボンネットの下では、CO 2の独立した培地を含む500ミリリットル瓶（CO 2 -i）にゲンタマイシン[10 mg / mlの]の500μlを添加する。 </li><li>別のビーカー中で、15分間絶えず撹拌しながら加熱ブロック上で95℃で20 CO2-I（ ステップ1.1.1）からの溶液と熱を加える。溶液はさらなる使用のために準備ができていることを示す黄色に色の変化を観察する。 </li><li>黄色の溶液を得、45分間95℃で増加攪拌および加熱しながら4ゼラチンgの上記で調製した溶液に徐々に悪い（ ステップ1.1.2）を秤量する。ゼラチン溶液は、下で冷却することを許可する約5分間のフード。 </li><li>気泡を導入することなく、直径35mmの培養皿にゼラチン溶液4mlを注ぐ。 30分間21℃で料理をしてください。プラスチックフィルムで皿をカバーし、そして逆さま料理を断る。必要に応じて、使用前に最大2ヶ月間、4℃で料理を保管。 </li></ol></li><li> 4％ゼラチン溶液を準備します。 <ol><li>ボンネットの下では、加熱ブロックに42℃でCO 2 -i滅菌プラスチック容器中での媒体、及び熱の25ミリリットルを追加します。加熱ブロックから培地を除去し、徐々に熱い中、撹拌にゼラチンの1グラムを追加します。素早く加熱ブロック（42℃）でコンテナを返し、処理中にそれを暖かく保つ。 </li></ol></li><li>設定アップビブラトーム装置： <ol><li> 4℃で保存し、20％ゼラチン溶液を含む皿を外し。メスでゼラチンをカット。ゼラチンスライスをフリップとsのドロップを使用しビブラトームの黒い支持ディスクに貼り付けのスーパーグルー。 </li><li>半分にカミソリの刃をブレークし、ビブラトーム保持容器に半分を挿入します。ビブラトーム装置上に黒のサポートディスクを挿入します。右側に黒いノブをオンにします。ビブラトームの頭の上に保持レセプタクルを修正。ゼラチンブロックをカバーするためにビブラトーム槽にCO 2 -i媒体の十分な量を加える。 </li><li>ビブラトームに切り替えて、ゼラチンブロックの3100μmのスライスをカット。さらに使用するためのゼラチンブロックしてください。 </li></ol></li><li>培養液の40ミリリットルを準備します。 <ol><li>ボンネットの下にウシ胎児血清（FCS）の10％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.4のを使用して、1mg / mlのポリ-D-リジンを調製する。 </li><li> 96ウェルプレートにコートしたウェルの底部をポリ-D-リジンを2μg/ cm 2で加える。 5％CO 2インキュベーター内で37℃で45分間静置します。インキュベーション後、PBSを除去し、200μlと交換/ウェルのDMEMおよび使用する前に、5％CO 2インキュベーター中、37℃で再び配置します。 </li></ol></li></ol>網膜全体の2解剖<ol><li>マウスを脱核： <ol><li>欧州指令63分の2010に従ってマウスを生け贄に捧げる：頸椎脱臼により。湾曲した-はさみで頭をカットし、消毒剤で目を消毒した後に100ミリメートルの直径のペトリ皿に入れてください。 </li><li>非常に慎重に湾曲したグリップを使用して、それを区画することにより視神経を切り離した後に目を削除します。その後、21℃で滅菌したCO 2 -i培地を含む35ミリメートルペトリ皿に両眼を置く。 </li></ol></li><li>網膜を削除する： <ol><li>眼の地球儀にハサミを導入することができるように18 G針の助けを借りて、目の四肢のレベルで穴を作る。穴の内側ストレートはさみを紹介し、慎重に毛様体を除去するための眼球のすべての周囲にアイリス下の強膜をカット。 </li><li&gt;角膜とレンズを取り外し、強膜に網膜の連続で目の房を保つ。 2細かいグリップを、網膜を損傷することなく、後部室内に位置して硝子体を除去する。網膜の平坦化を可能にするために4ラジアルカット（網膜/強膜）を実行します。 </li><li>眼球を好転と「オレンジ」としてそれをはがします。強膜と網膜色素上皮（RPE）から網膜を切り離します。まだ細かい曲面ハサミで非常に慎重に視神経のレベルで添付の網膜を切り離します。 </li><li> 2細かいグリップと網膜の中心に向かって周囲から残りの硝子を外します。すべての硝子体が網膜の平坦化を可能にする完全に除去されていることを確認してください。 </li><li>プラスチックピペットの先端をカットし、プラスチックピペットとCO 2 -i培地を含む直径35mmのペトリ皿に網膜を転送する。 </li></ol></li></ol>フラットmounte 3.シールゼラチンブロックの上にD網膜<ol><li>フラットマウント型網膜のシールを可能にするために（ゼラチンブロックは無料です）ビブラトームタンクからのCO 2 -i培地30ml - 20を削除します。 </li><li>プラスチックピペットを用いてガラススライドに網膜を転送し、感光体がゼラチンスライスを下に向けた状態でゼラチンスライスに転送する前に、CO 2 -i媒体のドロップを追加。 </li><li>優しく網膜とゼラチンブロックと同時に反対側の温かいゼラチンを排出する間のブロックの片側に4％のゼラチンを温め注入することにより、ゼラチンブロックに網膜を取り付けます。 </li><li>パスツールピペットで吸引し、4％のゼラチン。合計シーリングを可能にするために10分間待ちます。完全にブロックし、ブレードを浸漬することがCO 2 -iメディアを追加します。 </li></ol> 4.網膜をセクショニング注：このステップは、他の網膜細胞なし視細胞の層を得るために重要である（ 図1）。 <ol><li>ゼラチンブロックの上から順に、網膜に到達するために100μmの連続切片をカット。内層の120μmのセクション - その後、100を切った。用途に応じて、この層は廃棄してもよいし、液体窒素中で保存した。ビブラトームの速度が内側の層または光受容体層の切片中に（1または2で）非常に遅いことを確認してください。 </li><li>内側と外側の網膜の間のインタフェースに対応する網膜の中間15μmのセクションを実行します。顕微鏡下でこのセクションを確認します。血管が存在しないことは、網膜の外側に達したことを示す。 </li><li>ゼラチンと外側の網膜の200ミクロン（光受容体層）をカットし、それをCO 2 -i培地3mlで満たされた直径35mmの皿に移す。すべての網膜のすべての光受容体層部分が得られるまで氷の上に保管してください。 </li></ol> 5.解離光受容細胞<ol><li> （ディッシュを取る複数の）光受容体層（複数可）を含有し、10分間37℃のインキュベーター中でそれ（それら）を置く。 </li><li>鉗子を使用すると、静かにゼラチンから光受容体層を分離し、リンゲル液の3ミリリットルで満たされた新しい皿にそれを転送する。各光受容体層の製造のために、この段階（5.2）を繰り返します。 </li><li> 5ミリリットルのポリプロピレン、滅菌チューブに、5％CO 2インキュベーター内で37℃で、それを30分間インキュベート活性剤溶液の25μL（60μMのβメルカプトエタノール; 5.5 mMのL-システイン1.1 mMのEDTA）とパパインの2台をインキュベート。パパインの活性化は、37℃で達成される。このインキュベーションの間、2ミリメートル2枚（ 小さ ​​すぎない ）に光受容体層をカットし、5ミリリットルチューブにこれらの作品を移す。 </li><li>重力沈降に続くソリューションリンゲル液の1.5ミリリットルで二回網膜をすすぐ。検体とチューブから残りのすべてのリンゲル液を除去します。 </li><li>活性化したパパインとミックスを含むチューブにリンゲル液の475を添加する。網膜を含むチューブにこのソリューションを追加します。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター内で37℃で20分間網膜にチューブをインキュベートします。 DMEM、10％FCSを1 ml添加することにより反応を停止する。死細胞からDNAを消化するためにデオキシリボヌクレアーゼの25 U I（DNアーゼI）を追加します。注意深くた1mlピペットを用いて細胞懸濁液を均質化する。 RTで6分間50×gでスピン。 </li><li>血清の痕跡を除去し、細胞ペレットに（特定reagents_equipmentの表を参照してください）​​サプリメントを含むDMEM培地を追加し、慎重に1ミリリットルピペットで細胞懸濁液を再懸濁し、上清を捨てる。 RTで6分間50×gでスピン。この工程（5.7）をもう一度繰り返します。 </li></ol> 6培養視細胞<ol><li> PN8でのマウスの光受容体層は、この技術を使用して約1から1500000の細胞が含まれています。 1における光受容体細胞を播種×10 5細胞/培地および培養を5％CO 2インキュベーター内で37℃で5日間、細胞と培養プレート中cm 2である 。 5日目に、免疫化学及び抗体サプライヤーが提供してウエスタンブロット法の研究は、次の方法に進みます。 注：文化と予備試験を停止する手順は、参照21に記載されている。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

網膜は、生物学のモデル器官である。網膜の研究は、生物学の6つの主要な発見につながった。これは、最初の腫瘍抑制遺伝子RB1の原点にある。それは、sevenlessの息子との相互作用を介して受容体チロシンキナーゼおよびMAPキナーゼの間の分子のリンクを明らかにしている。それは、PAX6、臓器の形態形成のための最初のマスター制御遺伝子の発見に関与していた。これは、加齢性黄斑変性症（AMD）、ゲノムワイド関連画面（GWAS）によって同定された最初の疾患感受性遺伝子と補体因子H（CFH）の遺伝的関連の中心にある。最後に、レーバー先天性黒内障のために最初に成功した遺伝子治療、すべての遺伝性疾患の人間の最初の矯正遺伝子治療臨床試験につながった。この器官の構造は、ほとんどの脊椎動物種において保存されている。 生体内での操作のためのアクセシビリティセントのこの不可欠な部分で機能ゲノミクスの調査に早期に奨励してきた神経系をRAL。 私たちは、ビブラトーム切片によって網膜の内層から光受容体層を分離する方法をここに示しています。このステップでは、純粋な光受容体培養を得るために重要である。私たちの解剖プロトコルは、RPE細胞による汚染が非常に低いことができます。 主要な課題の一つは、セクション適切に内側と外側の網膜に必要である網膜の平坦化である。網膜の切片は、げっ歯類からのもののように小径の網膜上で最高であり、この直径は、現在入手可能な材料と技術の制限です。 これは、網膜のサンプルで練習するために、生物学的に意味のある実験を開始する前にお勧めします。我々は、mRNAおよびタンパク質の両方の発現研究を実行するための材料を用いて、培養された光受容体細胞から得られた代表的な結果によって方法を説明する。発現研究もsectioで交互に行うことができますナノ秒レーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより得られたが、培養物は、最高のビブラトーム切片を用いて行われる。私たちは完全な別の戦略に顕微解剖レーザーの技術を使用することもできました。しかし、培養のためのマイクロダイ装置を用いて感光層を収集するために、それは、固定液を回避するために、これはかなり現在の方法が複雑になることが必要であろう。 私たちは、網膜色素変性症のモデルにおける光受容体の変性の間にビブラトームのセクションの遺伝子およびタンパク質発現の動力学を研究することを目的としたプロトコルを開発している。私たちは、プロトコルの詳細な説明は、網膜生物学の分野の研究者にとって有用であり、最も特にプロテオミクスやメタボロミクス研究のためになると信じています。

網膜は、脊椎動物間で保存されたアーキテクチャを有する中枢神経系の不可欠な部分である。神経網膜の神経細胞は、眼の奥の網膜色素上皮（RPE）に密着した感光層は、入射光に対して最も遠いと、レイヤーで構成されている。ロッドとコーンphotorecptorsは、光子捕獲のためオプシン敏感な分子に依存している光感受性細胞である。これらの分子は、RPE 1の方向を指す光受容体の外節に位置するセル構造のディスク膜に囲まれている。ほとんどの場合、非常に初期の感光体変性の場合の影響を受けて、この構造は、10％の毎日の割合で更新される。いわゆる内層は光受容体、双極、アマクリン及び水平細胞、ならびに神経節細胞からの受信信号を計算する他のニューロンの大部分を含んでいる。その軸索を有するこれらの後者視神経あるビームを形成する。この階層化は、細胞が内網状層2の外に発見されたときに生物用語変位アマクリン細胞を使用しているように保存されている。神経細胞の層は、ラジアルミュラーグリア細胞の電機子内に分布している。双極細胞は、神経節細胞への光受容体をリンクします。これらは、外部網状層及び内網状層の間に配置される。神経節細胞、双極細胞と接続内網状層を形成する。 amacrin細胞は双極細胞および神経節細胞との間の内網状層に位置する関連細胞として命名される。外網状層は、水平細胞が含まれています。中枢神経系のニューロン層のこのユニークな配置はビブラトームを用いてフラットマウント網膜をスライスして内側の細胞層から感光層の単離を可能にする。 元々、この技術は、トラン用感光体を単離するために使用したRD1のマウス、ヒト網膜色素変性症 （RP）3のモデルの目でsplantation。 RD1マウスはロッド特異的ホスホジエステラーゼβサブユニットをコードするPDE6B遺伝子に劣性突然変異を運ぶ。人間4内のRPにおけるこの遺伝子結果の劣性の突然変異。桿体が縮退した後、患者は夜間視力を失い、第二段階として突然変異遺伝子、縮退を発現しない、驚くほどの円錐光受容体、。コー​​ンは色覚と視力のために必要とされるので、患者は徐々に盲目になり、病気のための有効な治療法はまだ開発されていない。野生型マウスからの感光層をグラフト化することによって宿主マウスの円錐変性3,5-遅延される。ロッドと双極細胞間のシナプス接続はRのみの特定の段階で得ることができるので、ロッド·コーン退行モデルで失われたロッドは、移植で置き換えることができませんでしたNRL式 6の開始によってマークさetinal開発、。光受容体の層は、RPEと残りの光受容体、錐体のわずか3％に相当する網膜の外側との間で、ロッドレスRD1網膜の網膜下空間での手術によって導入されている。内網膜細胞の正常な層を移植した動物に、または偽手術動物と比較して、手術の2週間後に、通常の光受容体層を移植した動物からの錐体の40％が生存した。コーン生存のトポグラフィは、広がっアウトグラフト化組織の位置に変異した網膜上の全面には、保護効果は、拡散性分子7によるものであることを示している。 次に、保護効果は、ロッド8,9によるタンパク質の分泌に依存していることを検証するために共培養系ならびに馴化培地を使用した。私たちは、exprはこのタンパク質がされるという仮説を立て非細胞自律的に10で棒からの保護、信号の損失によって二次コーン変性をトリガーする疾患の第1フェーズ彼らの死のロッドによって、その継続的かつ明確にessed。このため、推定タンパク質霊長類において中心的なビジョンを仲介コーンの重要性RPのための非常に関連治療ツールとなります。 RPでコーンを保持すると、理論的に11盲目になるために世界で150万人の患者の合計を妨げる。我々は、網膜cDNAライブラリー12からロッド由来コーン生存因子（のRdCVF）をコードするcDNAを同定するために高含量スクリーニングアプローチとコーン富化培養モデルを使用している。のRdCVFは、興味深いことに、酸化還元ホメオスタシス13に関与チオレドキシン蛋白質をコードする遺伝子に相同であるNXNL1遺伝子のスプライシングされた製品です。遺伝子の第2スプライスさ製品は、RdCVFLはそのターゲット、酸化Dに対してタウタンパク質を保護する酵素である14 amage。のRdCVFの投与は、コーンの二次変性し、RP 12,15の劣性、および支配的なモデルでの視覚機能の喪失を防ぎます。これは、この革新的な治療戦略16の二つの重要な側面を示しています。まず、遺伝子に依存しない方法でRPのほとんどの場合に適用することができる。第二に、競合因子CNTFに反し、のRdCVF生存を、視覚機能17のメンテナンスに関連している。機能的効果がないことは、RP患者18へのCNTFの投与の臨床的利益が存在しないことの理由を説明することができる。 in vitroでのコーン救助はのRdCVFの免疫除去12によって阻害されるためのRdCVFが最も可能性の高いロッドとコーンの間の重要な生存シグナルの一つです。また、ロッド由来錐体生存性遺伝子の破壊は、酸化ストレス19に障害および感受性を感光体に導く。 使用感光層のRdCVFの特定の原点および神経変性疾患に関与する新規20レドックス信号である。この原稿は、分離するために、感光層からの培養細胞は、のRdCVFの活性を特徴付けるために使用されるプロトコルを記述する。光受容体は、5~7日21培養で維持することができる。この技術は、光受容体特異的遺伝子の発現を研究するために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"><a name="RANGE!A1:D28">Name of Material / Equipment</a></td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:368px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td>4.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0456</td>
			<td>2.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td>100 &#181;g/ml linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-L-thyronine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td>0.03 &#181;M Triiodo-L-thyronine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-wells plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CO2 independent (CO2-i)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18045054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps n&#176;5 Dumont</td>
			<td>Bionic</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin from porcin skin type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneChip&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>U74v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortison*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>0.55 &#181;M hydrocortison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin* (I)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.86 &#181;M insulin (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>Worthington-biochem</td>
			<td>WOLS03124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556&#160;</td>
			<td>2.0 &#181;M progesterone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5172</td>
			<td>0.28 &#181;M prostaglandin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrescine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>&#160;182 &#181;M putrescine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Albion</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissor&#160;</td>
			<td>Moria</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Selenite* (S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.29 &#181;M Na2SeO3&#160;&#160; (S)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td>3 mM taurine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferrin* (T)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.07 &#181;M transferrin (T)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome apparatus</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">* Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures

網膜は、光受容体からの層のニューロンと、光の方向を考慮して、網膜上の最も離れた部分における網膜色素上皮と接触している両方の桿体および錐体のアーキテクチャを組織した中枢神経系の一部であり、かつ最も近い距離の神経節細胞。このアーキテクチャは、ビブラトーム切片により、感光層の単離を可能にする。 8日齢マウスの解剖神経網膜は、下向きに20％ゼラチン感光層のスライスの上に4％ゼラチンでフラット包埋ある。ビブラトームと両刃のカミソリの刃を使用して、厚さ100μmの内側の網膜は、区分されている。このセクションでは、神経節細胞と、特に双極細胞と内層が含まれています。光受容体を含む外側の網膜の200程度が回復される前に、15μmの中間の部分は破棄されます。ゼラチンは、37℃で加熱することにより除去される。外層の小品はincubaです37℃で20分間活性化したパパインの2ユニットとのリンゲル液の500μlのテッド。反応は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で500μlの10％ウシ胎児血清（FCS）を添加することにより停止させ、その後、DNアーゼIの25単位は、室温で遠心分離前に添加され、血清を除去するために数回洗浄し、細胞が中に再懸濁するDMEM500μlの1×10 5細胞/ cm 2で播種。細胞は、in vitroで 5日間まで成長させ、彼らの生存率は生/死アッセイを使ったスコア。培養物の純度は、最初の実験の間、顕微鏡観察により決定される。純度は、その後播種し、組織学的スライド上で細胞を固定し、ウサギポリクローナル抗SAG、感光体マーカーとマウスモノクローナル抗RHO、桿体特異的マーカーを用いて分析することによって検証される。代替的に、光受容体層（97％の棒）は、遺伝子またはタンパク質発現分析のために移植のために使用することができる。

別に移植から、感光層は、感光体の培養物12,22を作るために細胞を播種することによって細胞シグナル伝達を研究するために使用されてきた。さらに、それらは、遺伝子発現及び概日リズム23,24を研究するために使用される。我々は、5％CO 2（ 図1Eインキュベーター中で37℃で5日間FCSの不在下で、感光体の培養物を調製するために出生後8日目の野生型マウスからの細胞光受容体層を使用し、細胞を維持している）。次いで、細胞を4％パラホルムアルデヒドを用いて固定した後、いずれかのマウスモノクローナル抗RHO（1：250、ミリポアMab5316）を有する抗体サプライヤーが提供した方法を用いて免疫細胞化学分析のために進めたか、ウサギポリクローナル抗SAG（1：200、寛大なをイガル·ジェリーとデビッドヒックスの贈り物）。我々は、使用される抗Rhoと抗SAG（ただし抗SAGラベルコーンと棒）抗SAGは抗RHOより前のマーカー、であるという事実に起因するが。 CELの割合抗RHO抗体について陽性lsが抗SAG抗体（ 図2）に陽性のものより低い。これは、SAG、ロッドアレスチンはまた、単離された層に光受容体の3％を作る円錐によって、あるいは網膜の出生後の成熟の間に、SAGの発現があることに先行するという事実によって発現されるという事実によって説明することができるRHO 25,26の。 感光層は、RNAは塩化セシウム超遠心分離法27を用いて調製し、マウスDNAチップアレイにハイブリダイズさせた35日齢の動物の野生型網膜と脳の光受容体による遺伝子の特異的発現をモニターした。ロドプシン（ロー ）、S-アレスチン（SAG）と円錐デュー（Gnat2）のためのメッセンジャーは、脳（ 図3A）と比較して、網膜に特異的に発現している。式が含まれる全体の網膜よりも光受容体層（PR）において顕著である内網膜層は、これらの遺伝子が光受容体によって実際に発現されることを示す。 Gnat2ために、Rhoとサグと比較して、相対的な発現は、それが単離された感光層中に含まれるコーンで表されることを示している。全網膜と比較して、感光層中のリカバリン（Rcvrn）の発現は（ 図3B）が増加する。 感光層は、RHOとGNAT2抗体の供給者により提供される方法に従って、ウェスタンブロットを使用しての発現を監視し、内網膜層（ 図4）に比較した。それぞれのロッドとコーンのマーカー全体の網膜における及び出生後35日目のの​​rd1マウスの網膜において、RhoとGNAT2 28が存在しないことに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg" /> Fiのグレ1.マウス網膜のビブラトーム切片の模式図。の（A）ビブラトーム刃と内網膜の光受容体は、ゼラチンスライスを下に向けてフラットマウント網膜の設置。（B）セクション。網膜外層の（C）節は、ゼラチンを添加。（D）コントロール光受容体層の単離後の網膜の断片の端にある光受容体の存在。緑色蛍光のために使用されるスケールバーは、白色光顕微鏡を用いている。光受容体は、画面の端に位置しています。（E）培養光受容細胞（ポスト5日）。（F）パネルEの高倍率<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550" /> マウスの光受容体培養におけるRhoとSAGの図2.差動式。核の（A）染色（青）、（B）SAG染色（緑）、（C）RHO染色（赤色）。（D）マージ画像。 SAGの染色は、以前のRHO染色よりも発現されるので、唯一つのセルは二重SAGとRHO（*参照）のラベルが付いています。スケールバー：23μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg" /> 脳全体の網膜および35日齢の野生型動物の光受容体における3つの遺伝子の発現の3の比較図。 （A）ロドプシン（ロー ）、S-アレスチン（SAG）と円錐デュー（Gnat2）。（B）カルビンジン（Calb1）とリカバリン（Rcvrn）。データは、相対的な表現として表示されます。相対式は、式の値であるKBaSS（http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/）知識データベースで利用可能なソフトウェア堅牢なマルチアレイ平均（RMA）とnormaliszati​​on後にマイクロアレイデータから得られた。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400" /> 内側の網膜における及び出生後35日目ACTB、ベータでのrd1マウスの網膜におけるそれらの発現の出生後35日目不在での野生型網膜から外側の網膜におけるRhoとGNAT2の図4.式アクチン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <!-- Repeat of the materials table
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 材料/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td>コメント/説明 </td></tr><tr><td>シチジン5&#39;- diphosphocholin * </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C0256 </td><td> 4.7μMシチジン5&#39;- diphosphocholin </td></tr><tr><td>シチジン5&#39;- diphosphoethanolamine * </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C0456 </td><td> 2.7μMシチジン5&#39;- diphosphoethanolamine </td></tr><tr><td>リノール酸/ウシ血清アルブミン（BSA）* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L8384 </td><td> 100μg/ mlのリノール酸/ウシ血清アルブミン（BSA） </td></tr><tr><td>トリヨード-L-サイロニン* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T6397 </td><td> 0.03μMトリヨード-L-チロニン</td></tr><tr><td> 96ウェルプレート</td><td>グライナーバイオ1 </td><td> 655から095 </td><td></td></tr><tr><td>単対物双眼顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ-75 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2の独立した（CO 2 - I） </td><td>ライフテchnologies </td><td> 18045054 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 41966029 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子N°5デュモン</td><td>バイオニック</td><td> 11254から20 </td><td></td></tr><tr><td> porcin皮膚タイプAのゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G2500 </td><td></td></tr><tr><td>のGeneChip </td><td>アフィメトリクス</td><td> U74v2 </td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシンソリューション</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15710049 </td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H0888 </td><td> 0.55μMヒドロコルチゾン</td></tr><tr><td>インスリン*（I） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I1884（ITS） </td><td> 0.86μMインスリン（I） </td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン-BIOCHEM </td><td> WOLS03124 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P-6407 </td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7556 </td><td> 2.0μMプロゲステロン</td></tr><tr><td>プロスタグランジン* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P5172 </td><td> 0.28μMプロスタグランジン</td></tr><tr><td>プトレシン* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P5780 </td><td> 182μMのプトレシン</td></tr><tr><td>スカルペルアルビオン</td><td> EMS </td><td> 72000 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>モリア</td><td> 15396から00 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S8636 </td><td> 1mMピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム*（S） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I1884（ITS） </td><td> 0.29μMのNa 2のSeO 3（S） </td></tr><tr><td>タウリン* </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8691 </td><td> 3 mMのタウリン</td></tr><tr><td&gt;トランスフェリン*（T） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I1884（ITS） </td><td> 0.07μMトランスフェリン（T） </td></tr><tr><td>ビブラトーム装置</td><td>ライカ</td><td> VT1000-S </td><td></td></tr><tr><td> *サプリメント</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1：特定の材料及び使用される機器の。 - &gt;

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Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

8日齢マウスの神経網膜を4％ゼラチンブロックの上にある。ビブラトームによる光受容体層（200ミクロン）の単離後、感光体は文化のための機械的および酵素的解離後に播種する。感光層は、分子、生化学的分析または移植のために使用することができる。

ビブラトームセクショニングマウス網膜は、感光体文化を準備する

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

vibratome-sectioning-mouse-retina-to-prepare-photoreceptor-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K ビュー.  UMR_S 968, Institut de la Vision.  8日齢マウスの神経網膜を4％ゼラチンブロックの上にある。ビブラトームによる光受容体層（200ミクロン）の単離後、感光体は文化のための機械的および酵素的解離後に播種する。感光層は、分子、生化学的分析または移植のために使用することができる。 

ビデオ: Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

神経科学

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

鶏胚のレチナから、ロッドからコーン細胞相互作用を研究するコーンエンリッチ培養

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.

マウス網膜の分離と平坦化

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.