אנו מודים סשה רייכמן ודומיניק Santiard-רון על עזרתם בעריכת פרוטוקול טיהור רנ&quot;א.

1. כתב עת: נוהל לשחזר את הדגימות מהבלוק כירורגי במעבדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל חוזה יבוא מחברת ספנות מפורשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 10 (או 25) צורות משלוח עם כתובת הדואר של המעבדה מצביעה על איש הקשר במעבדה (מספר טלפון וכתובת דואר האלקטרוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 (או 25) צורות דוגמאות ממוספרות מ -1 עד 10 (או 25). צורות אלה כוללות חללים ייעודיים להודיע ​​על זיהוי אלמוני) של החולה, ב) מועד הניתוח וג) שום הערות נוספות המנתח רוצים להוסיף. הכן 10 (או 25) מעטפות מרופדות (150 מ&quot;מ x 210). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוכן באמצעות 25 מ&quot;ל (או 65) ריאגנטים RNAse ללא כלוריד guanidine ז 6 בdiethylpyrocarbonate (DEPC) שטופלו H 2 O (GHCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 10 או 25 מנתה 5 צינורות פוליאתילן תחתית עגולות סטריליים מ&quot;ל עם 2.4 מ&quot;ל של תמיסת GHCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משמש גז ארגון כדי למלא את החלק העליון של צינורות אלה, יותר מעיתונות TIghtly בכובע כדי למנוע החמצון של פתרון GHCl על פני כמה שנים של אחסון בארון כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את כל 5 צינורות מ&quot;ל בשפופרת 50 מיליליטר סטרילי פוליפרופילן חרוטי תחתית עם כובע בורג. השתמש בפיסת רקמת נייר נקי כדי להחזיק את צינור 5 מ&quot;ל לשפופרת 50 מ&quot;ל, לסגור את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות 50 מ&quot;ל על מדף קלקר ומתל לקופסא קרטון עם המעטפות המרופדות, צורות המשלוח, צורות דוגמאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק את ההוראות (ראה: 1.12-1.19) הפנימי של העטיפה של קופסא הקרטון כדי להקל על הקריאה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח קופסא הקרטון בדואר לאיש הקשר בבית החולים. </li></ol> בבית החולים <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את קופסא הקרטון מהארון כירורגית לחדר הניתוח. זהירות שימו לב: אם ההליך כרוך מטופל נפגעים חיסונית, הקרטון לא צריך להיות מובא לחדר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הניתוח, הנח את SPECIM הרשתיתen לפוליפרופילן הממוספר 5 מיליליטר סטרילי מלא פתרון GHCl. סגור היטב את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצינור לזמן קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על כיסא הנדנדה צינור הדם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הטופס הממוספר המדגם הנלווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח על מספר זיהוי על גבי צינור מ&quot;ל המקביל הממוספר 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את צינור 5 מ&quot;ל עם הדגימה כירורגית לתוך צינור 50 מ&quot;ל, להחליף רקמת נייר ולהבריג את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את הצינור ואת הטופס מילא המדגם לתוכו באחת מהמעטפות המרופדות הנלוות. לסגור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקשר לחברת הספנות המפורשת ללהרים. </li></ol> 2. טיהור RNA במעבדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize את הדגימה בצינור פוליפרופילן 5 מ&quot;ל שלה עם פתרון GHCl עם homogenizer דקות 1 תוך כדי התנועה מעלה ומטה בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 270 μl 5.0 pH של 2 אצטט אשלגן ז. נער נמרצות במשך 10 דקות על ידי הנחת הצינור על שייקר בהמצב אופקי (420 דקות -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 דקות ב -5,000 סל&quot;ד (6,500 XG) ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בצורה חלקה שבריר המסיס מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר לתוך צינור סטרילי 14 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5.3 מ&quot;ל של 100 מ&quot;מ טריס pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3.2 גרם של כלוריד צסיום (CsCl) ולערבב את הצינור על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.8 מ&quot;ל של חומצת CsCl / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) בצינור צנטריפוגות סטרילי 11 מ&quot;ל polyallomer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם 10 מ&quot;ל סטרילי פיפטה פסטר, להעביר את פתרון RNA על 1.8 מ&quot;ל CsCl / EDTA על ידי הזזה לאט בקצה הצינור, כדי למנוע הפרעה לכרית הצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות (צינור שני המכיל את המאגרים בלי רשתית במקרה צורך) לרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 24 שעות ב32,000 סל&quot;ד (225,000 XG) ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חלק מעולה של הפתרון עם פיפטה פסטר סטרילי, וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הדרגה תוך הבדיקהרגע שבו את ה-DNA (צמיג) הוא aspirated עם סטרילי פיפטה פסטר שני, וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון שנותר נזהר שלא לשחרר את גלולה RNA עם סטרילי פיפטה פסטר שלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף התחתון של הצינור עם אזמל להבה מעוקר, ואז לשים את החלק הנותר של הצינור זה במהופך על מבט סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצינור ולשטוף בעדינות עם 160 μl של GHCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו היבש גלולה למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב150 μl של (10 מ&quot;מ טריס pH 7.5-1 מ&quot;מ EDTA - 0.1% SDS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 2 מ&quot;ל, ולאחר מכן לקצור את גלולה שיורי עם 30 μl של (10 מ&quot;מ טריס pH 7.5-1 מ&quot;מ EDTA - 0.1% SDS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של (10 מ&quot;מ טריס pH 7.5-1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של 3 מ &#39;pH נתרן אצטט 5.0, מערבולת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900 ​​μl של אתנול 100% (-20 מעלות צלזיוס), מערבולת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צינור 30 דקות בקרח נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuge דקות צינור 30 ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את החלק היחסי המסיס, וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 אתנול μl 70% (RT), מערבולת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקות צינור 20 ב15,000 סל&quot;ד (18,000 XG) ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעד השטיפה (70% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה ולחסל אתנול נותר עם טפטפת P200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו גלולה האוויר היבש למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב50 μl DEPC שטופל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים נמרצות על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות ב 45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li></ol> 3. ניתוח הרנ&quot;א על ​​ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים agarose ג&#39;ל בתוך מנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל סטרילי, להוסיף 2 μl של רנ&quot;א כדי להיות מנותח ו6.4 μl של חיץ הכנת מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 1.5 מ&quot;ל שני, להוסיף 3 μl של תקני RNA ו9.6 μl של חיץ הכנת מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הצינורות דק 15 על 65 מעלות צלזיוס, לשים אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 ethidium רומיד μl (EB) חיץ טעינה ללא צבע בצינור מדגם RNA וחיץ EB μl 1 טעינה עם צבע בצינור הסטנדרטים רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל תחת 80 - 100 V בתוך מנדף כימי בריצה חיץ, עד שאחד מהצבעים (bromophenol הכחול) מגיע ל 2/3 מהחלק התחתון של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הג&#39;ל פעמיים 15 דקות עם 250 מ&quot;ל דה טופל DEPC 2x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה דיגיטלית התחת תאורת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את היחס שבין הרצועה העליונה (23S rRNA) והרצועה התחתונה (rRNA 16S). </li></ol> 4. טיהור סופית של רנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הקול של מדגם RNA ל -100 μl עם DEPC שטופל H 2 O (במידת צורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של חומצת פנול (1 מיליליטר פנול רווי ב+ 130 μl DEPC שטופל H 2 O של 50 מ&quot;מ של נתרן אצטט, pH 5.2), מערבולת במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 דקות ב -13,000 סל&quot;ד (15,000 XG) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Recover בזהירות ולהעביר את השלב המימית (שלב העליון) לרומן צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 3 אצטט M נתרן, pH 5.2 ו250 μl של אתנול 100% (-20 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינור 30 דקות לתוך קרח נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקות צינור 30 ב 14,000 סל&quot;ד (18,000 XG) ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בזהירות את החלק היחסי המסיס, וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 70% אתנול (בטמפרטורת חדר), ומערבולת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקות צינור 20 ב 14,000 סל&quot;ד (18,000 XG) ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעד השטיפה (70% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה ולחסל אתנול נותר עם טפטפת P200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת אוויר יבש גלולה למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור לתוך 50 μl של DEPC שטופל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אז צינור 15 דקות ב 45 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה (ABS) ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר ב -2 μl של מדגם RNA. מחושב Abs260/Abs280 היחס. </li> &lt;li&gt; חנות מדגם RNA ב -80 ° C (יציב במשך כמה שנים). </li></ol> 5. פתרונות והליכי ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשלגן אצטט 2 מ &#39;, pH 5.0: ממיסים אצטט 19.6 גרם אשלגן לתוך 70 מ&quot;ל של DEPC שטופל H 2 O. נקה את הבדיקה מד pH על ידי השרייה לעם 1M NaOH במשך 15 דקות, ואחרי 5 שטיפות עם DEPC שטופל H 2 O. התאם ל-pH 5.0 עם חומצה אצטית לאחר מכן להתאים את עוצמת קול עד 100 מ&quot;ל עם שטופלו DEPC H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריס-HCl 100 מ&quot;מ, pH 8.0, 1% N-Lauroylsarcosine: ממיסים 2 גרם של N-Lauroylsarcosine (מתחת למכסת מנוע) בעד 40 מ&quot;ל של 0.5 מ &#39;טריס pH 8.0-הבסיס. התאם את עוצמת קול עד 200 מ&quot;ל עם DEPC שטופל H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 גרם של CsCl ב50 מיליליטר מ&quot;מ pH 10 EDTA 7.5 מוכנים עם שטופלו DEPC H 2 O. חיטוי ולהתאים את עוצמת קול עד 100 מ&quot;ל עם DEPC שטופל H 2 O. בדקו אם ה-pH &lt;7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose ג&#39;ל 1%: שים 1 גרם של agarose ב62 מ&quot;ל DEPC שטופל H 2 O. מרתיחים בתנור מיקרוגל. הוסף 18 מ&quot;ל של 12.3 Mפורמלדהיד, 20 מ&quot;ל של מגבים 5x. יוצקים בתוך מנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר מכין מדגם: כדי להיות מוכן מאולתר. מערבבים פנימה כימי מכסה המנוע של מגבים μl 8 5x, 16 μl של פורמלדהיד M 12.3 ו -40 μl של פוראמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EB טעינת חיץ (ללא צבע): כדי להיות מוכן מאולתר. הוסף 4 μl 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ברומיד ethidium 20 μl של 80% גליצרול מוכנים עם DEPC שטופל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EB טעינת חיץ (עם צבע): כדי להיות מוכן מאולתר. הוסף 2 μl 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ברומיד ethidium 10 μl של גליצרול 80% המכיל 0.25% xylen cyanol, 0.25% כחול bromophenol עם שטופלו DEPC H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריצת חיץ: עד 60 מגבים 5x מ&quot;ל, להוסיף 54 מ&quot;ל של פורמלין M 12.3 ו186 מ&quot;ל של DEPC שטופל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופל DEPC H 2 O: מים מזוקקים דגירה עם 0.1% diethylpyrocarbonate V / V לשעה 2 ב 37 ° C עם ערבוב. לעקר על ידי החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי homogenizer: הוסף 25 מ&quot;ל של תמיסת ניקוי (RBS) ל1 ליטר של DEPC שטופל H 2 O, ותשקיע את דקות ציר 1 עם ערבוב. דגירה שעה 2 ב 60 ° C. לשטוף ביסודיות עם 2 H DEPC שטופל O גלישה במכשיר לאלומיניום והכניס לתוך קופסא המכשיר. לעטוף את הקופסה. לעקר על ידי החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי מכשיר אלקטרופורזה: לשטוף את המנגנון, את המגש ואת מסרק 15 הבארות. דגירה 15 דקות ב3% מי חמצן. יש לשטוף פעם אחת עם 100% אתנול. אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי הכלים הזכוכית: יש לנקות את הכלים מזכוכית 2% RBS כל הלילה, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים לפני העיקור ב 200 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפיתוח של הליך להתאוששות רקמה מהגוש כירורגית כבר חיוני לניתוח transcriptome של היפרדות רשתית. אחד צריך לשים לב כי סוג זה של ניתוח הוא התאמן בחירום ושיש לי ההפעלה רופאי העיניים קצת זמן כדי להשתתף בתכנית מחקר ביולוגית כאשר הם פועלים. retinectomy זה מבוצע גם stochastically בכל שירות, כך שה?...

המטרה הטיפולית העיקרית בהיפרדות רשתית (RD) היא למצוא דרך להגביל את נזק photoreceptor תא ודלקת רשתית כתוצאה מההפרדה של קולטניים אור מתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית. במהלך RD, תאי הרשתית מופעלים, להעביר, dedifferentiate, ומתרבים על פני השטח של הרשתית המנותקת, הפעלת כוחות התכווצות שהובילו לסיבוכים. ניתוח transcriptomics של RD הוא דרך לזהות גני המטרה עם ביטוי שונה בעקבות RD ומולקולות טיפוליות עתידיות ומכאן שיכולים לשפר את התוצאה סופית חזותית בשילוב עם ניתוח. העובדה ידועה הוא חומצה ריבונוקלאית (RNA) אינה יציבה כפי שהיא חומצת deoxyribonucleic (DNA), האחרון בשימוש נרחב למחקרים גנטיים, יציבותו התירה הרצף של הגנום הניאנדרטלי מדגימות כפליאונטולוג של יותר מ -30,000 שנים 2. תמלול של ה-DNA של גנים מהגנום לתוך RNA השליח הואתהליך מרכזי בביטוי גנים, ואת ה-mRNA הוא יציב כדי להוות אות. RNAs מאוד במהירות מושפל על ידי RNAse אנזימים אשר לסיים את האות. כאשר רקמות מבודדות מהאורגניזם, את RNAs הם לעתים קרובות מאוד מושפל לפני הביטוי הוא למד במעבדת מחקר. RNA מושפל אינו מתאים לניתוח ביטוי גנים. כי צוות המעבדה לא יכול להשתתף בניתוח, פיתחנו הליך שהוא קל ורק דורש שהמנתח לשחזר את הרקמות לפתרון ללא RNAse מתאים. את הרנ&quot;א של הרקמות הוא יציב וניתן לנתח ללא כל סימן של הידרדרות לאחר 72 שעות בטמפרטורת חדר בפתרון זה. את RNAs מדגימות הם מטוהרים על ידי שיטה סטנדרטית מעורבת ultracentrifugation בשיפוע צזיום כלוריד, לאחר שהועבר למעבדה 3. ואז, איכות של RNAs מוערכות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ועל ידי RT-PCR. יש פרוטוקול טיהור RNAיתרון של הפרדת המולקולות על פי הצפיפות שלהם שהיא שונה עבור DNA ו-RNA ומבטיח כי רנ&quot;א אינו מזוהם על ידי מולקולות הדנ&quot;א שתפקנה אותות artifactual במחקרי ביטוי גנים. בנוסף, העברת RNAs (tRNAs), שהן כמותית את הרנ&quot;א הנפוץ ביותר בתוך תא, מופרדים על פי אותו הנכס הפיזי מרנ&quot;א ריבוזומלי (rRNAs) ואת RNAs השליח (mRNAs), שני אלה שעבר אחד להיות בסופו של תוצר הלוואי של תהליך הטיהור. הסרת tRNA מההכנה היא שימושית שכן רוב פרוטוקולי אנליטיות microarray כללו שימוש בtranscriptases בחסר וpolymerases RNA אשר מעוכבים על ידי tRNA 4-6. את הרנ&quot;א מנוקה מדגימות כירורגית מסומנים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי והכלאה לשבב microarray והתוצאות מנותחות באמצעות שתי שיטות משלימות, שיטת שיעור הגילוי הכוזבת, ושימוש בשיטה חדשה המבוססת על מידע הדדי וvisualized בשרת מבוסס אינטרנט Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

היפרדות רשתית (RD) מתארת ​​הפרדה של רשתית נוירו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית). הרשתית היא חיונית לתפקוד תקין של התאים העצב הרגישים לאור, photoreceptors. ניתוק של הרשתית מהרשתית יוצר פער פיזי, כי הוא מלא בנוזל חוץ תאי. RD יוזם תופעות לוואי תאיות ומולקולרית המשפיעות גם נוירו הרשתית והרשתית מאז חילופי פיסיולוגי של יונים ומטבוליטים הוא מוטרדים קשה. התוצאה עבור חזון קשורה לתקופת הניתוק מאז reapposition מהיר של תוצאות שתי הרקמות בשיקום הראייה 1. הטיפול בRD הוא אך ורק ניתוחי. הסרת ג&#39;ל זגוגית (Vitrectomy) ואחריו הסרת חלק החיוני שאינו של הרשתית באזור המרוחק לטובת היפרדות רשתית. דגימות רשתית הסיר הם מיל nullius (שום דבר) וכתוצאה מכך בדרך כלל מושלך.כדי לשחזר RNA מן הדגימות כירורגית אלה, פיתחנו את כתב עת ההליך המאפשר לרנ&quot;א שימור במהלך ההעברה מהבלוק כירורגית למעבדה. אנחנו גם טופל פרוטוקול לטהר הרנ&quot;א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח ביטוי גנים הגלובלי. האיכות של RNA קבלה תוקף גם על ידי RT-PCR וניתוח microarray. ניתוח של הנתונים מראה מעורבות בו זמנית של דלקת וניוון photoreceptor במהלך RD.

הליך ז&#39;ורנל (איור 1) מאפשר לנו לשחזר את הדגימות של רשתית מהגוש כירורגית למטוהרי RNA, ולנתח את transcriptome של היפרדות רשתית. תוצאות היפרדות רשתית בupregulation של chemotactic גן מונוציטים MCP1 CCL2, ובירידה בביטוי של מוט photoreceptor transducing הגן GNAT1, קצר הגל החרוט Opsin OPN1SW, וCRX</e...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ&quot;א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.

ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ​​ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.

Video: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. Recent technological progress has enabled the fabrication of microelectrode arrays that allow recording the activity of multiple individual neurons in the neocortex of the human brain. These arrays have the potential to bring unique insight onto the neuronal correlates of cerebral function in health and disease. Furthermore, the identification and decoding of volitional neuronal activity opens the possibility to establish brain-computer interfaces, and thus might help restore lost neurological functions. The implantation of neocortical microelectrode arrays is an invasive procedure requiring a supra-centimetric craniotomy and the exposure of the cortical surface; thus, the procedure must be performed by an adequately trained neurosurgeon. In order to provide an opportunity for surgical training, we designed a procedure based on a human cadaver model. The use of a formaldehyde-fixed human cadaver bypasses the practical, ethical and financial difficulties of surgical practice on animals (especially non-human primates) while preserving the macroscopic structure of the head, skull, meninges and cerebral surface and allowing realistic, operating room-like positioning and instrumentation. Furthermore, the use of a human cadaver is closer to clinical daily practice than any non-human model. The major drawbacks of the cadaveric simulation are the absence of cerebral pulsation and of blood and cerebrospinal fluid circulation. We suggest that a formaldehyde-fixed human cadaver model is an adequate, practical and cost-effective approach to ensure proper surgical training before implanting microelectrode arrays in the living human neocortex.

We designed a procedure in which a formaldehyde-fixed human cadaver is used to assist neurosurgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain.

אימוני ניתוח ההשתלה של מערכים Neocortical Microelectrode באמצעות מודל של פורמלדהיד-קבוע גווייה אנושי

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

אבחון וטיפול כירורגי של דלקת ברוסלאר Spondylodiscitis אנושי

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...