無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

代謝産物は、ゲノム環境や管理手法などの要因の影響を受けます。これらの要因間の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。従来の2つではなく第3の移動相を組み込むことによって、この技術はより広い範囲の代謝産物の分離および検出を可能にする。

メタボロミクスは、生物学の任意の領域に適用することができます。まず、生物の生化学の理解を深め、生理学に関連して、生物的または生物的ストレスに対するそれらの反応を説明するのを助ける。第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。

イソプロピルアルコールは粘性溶媒であるため、低フレア速度で導入する必要があり、組成を98%に増やす前に十分な平衡時間を使用すると、クロマチックグラフィックシステムが過加圧したり、誤差を返したり、分析カラムを損傷したりする可能性があります。穀物の調製を開始するには、実験室用ブレンダーを使用して穀物を粉砕します。ブレンダーを高速で20秒間実行してから、繰り返します。

ベースからブレンダージャーを取り外します。ブレンダージャーの側面をタップして、粗く粉砕した粒をサンプルの表面に持ち込みます。粗粉砕粒は廃棄するか、保存することができます。

ブレンダーから細かく粉砕された穀物を2ミリリットルのプラスチックマイクロ遠心管に移します。抽出と同じ日に、原稿に記載されているように抽出溶媒を調製する。次に、200ミリグラムの細挽き穀物を2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に計量する。

チューブ内の穀物に500マイクロリットルの抽出溶媒を加えます。さらに、空のチューブに500マイクロリットルの抽出溶媒を加えてブランクを作製します。ホモジナイザーを使用し、6,500RPMにセットし、溶媒と穀物を20秒間混合する。

その後、さらに 20 秒間繰り返します。その後、チューブを摂氏4度、16倍、100倍Gで5分間遠心分離する。上清を2ミリリットルのプラスチックチューブに移し、ペレットを保持します。

ペレットの抽出プロセスを2回繰り返します。3つの上清を組み合わせ、約1.5ミリリットルの総抽出量を生成し、渦によって混合する。品質管理に使用するすべての穀物抽出物のプールサンプルを作るために、各穀物抽出物の55マイクロリットルを2ミリリットルのチューブと渦に移します。

次いで、このプールされたサンプルの50マイクロリットルのアリコートをガラスバイアルに移す。各穀物サンプル抽出物の50マイクロリットルのアリコートをガラスバイアルに移す。書かれた原稿に記載されているように、液体クロマトグラフィー質量分析に必要な溶液を準備する。

LCMS分析の日に、1ミリリットルの5%アセトニトリルを調製し、1ミリリットルのロイシン・エンケファリン当たり200ナノグラムを含有する。この溶液の950マイクロリットルを、粒抽出物の50マイクロリットルアリコートを含むガラスバイアルに加えます。渦をかいてバイアル中の内容物を混ぜます。

まず、原稿とメーカーのユーザーガイドに記載されているように、機器のキャリブレーションを設定します。次に、移動相および洗浄溶媒を含むLCMSグレードの溶媒を使用してLC流体システムをパージし、洗浄する。LC方式の開始条件を使用してLCシステムを平衡化し、カラム圧が安定していることを確認します。

計測器シーケンステーブルを設定します。サンプルシーケンスの最初にナトリウムのフォーマットを注入して、機器のキャリブレーションを確認します。最初に溶剤と予備ブランクを分析し、次にシステムコンディショニング用のプールされた品質管理サンプルを分析し、次に無作為化サンプルリストを分析します。

技術複製として、品質管理サンプルを定期的に実行します。シーケンスの最後に 2 つの品質管理サンプルを実行します。シーケンスの実行中に、内部標準質量精度と信号再現性の両方を含むデータ品質を確認します。

信号の再現性を確認するには、オーバーレイスペクトルの目視検査で十分です。4つの内部標準は、穀物抽出物を調製するために使用される溶液に含まれていた。LCMSでは、正と負のイオン化モードの両方で、良好な質量精度と内部標準の単一再現性が観察されました。

ブランクの分析に基づいて、負のモードで421の信号と正のモードで835の信号がアーティファクトであると判断された。これらのシグナルは、穀物サンプル中の平均単一強度の5%以上の強度でブランクに存在していた。アーティファクトの除去とデータのさらなるフィルタリングの後、ネガティブモードは483の機能を返し、ポジティブモードは523の機能を返しました。

約250の特徴は生物学的に関連しており、小麦品種の強度が大きく異なっていました。このプロトコルでは、準備ブランク、内部標準、プールされたサンプルを含めるなどの品質管理対策が重要です。