著者らは、質量キャリブレーションおよびデータ処理に関する貴重な議論のためにデトレフシューマン、ジェニファー·サットン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とナサニエル·スナイダー（ペンシルバニア大学）を承認したいと思います。この刊行物で報告された研究が受賞番号R00CA168997の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1。LC-MS試薬、クロマトグラフィ法の確立の準備、計測器操作手順の確立<ol><li> LC溶媒の準備<ol><li> 500ミリリットルの移動相を準備します。 Aは、20mM酢酸アンモニウムおよび3％アセトニトリル/水中の15mMの水酸化アンモニウム、最終pHは9.0であり;そしてBは、100％アセトニトリルである。 </li><li>緩く、ボトルにキャップを水浴超音波処理に置き、そして余分な加熱せずに10分間超音波処理。 （このステップは、アンモニウム塩の全てが完全に溶解すること、および残存気泡がないことを保証することである。） </li><li> LC-MS用に250mlのガラスボトルに250mlの溶媒を移し、4℃で剰余を保つ</li></ol></li><li>低質量範囲のキャリブレーション溶液を調製する。正確な質量が、低分子量で検出されることを保証するメタボロミクスアプリケーション用にカスタマイズされた低質量範囲のキャリブレーション混合物を使用することが重要である。 <ol><li> SODI両方5mgを量るウムフルオロおよびホモバニリン酸および1 mg / mlの最終濃度を作るために5mlの水にそれらを溶解する。 10 mg / mlの終濃度を作るためにメタノールにダイアジノンを溶解する。 </li><li>負の低質量較正溶液1mlを調製し、ナトリウムfluoroaceateおよびホモバニリン酸溶液20mlで熱負の較正溶液960ミリリットルを混合する。正の低質量キャリブレーション溶液1mlを加えるには、サーモプラスの校正液の990ミリリットルと10ミリリットルダイアジノン溶液を混合。 （低質量​​キャリブレーション溶液は、4℃で保存されるべきであり、2ヶ月ごとに新しく調製する。） </li></ol></li><li>低質量範囲でのQE-MSのキャリブレーション<ol><li>低質量範囲のキャリブレーションを行う前に、製造者の指示に基づいて、正と負の両方のモードで標準的な質量較正た（m / z、150-2,000）を行う。 </li><li>定期的な質量キャリブレーションが経過すると、測定器のコントロールパネルで60〜900メートル/ Zとスキャン範囲を調整そしてポジティブモードとネガティブモード35 eVで25 eVでのソースCIDが適用される。 （これはカフェインのフラグメントイオンと硫酸イオンの強固な信号が得られます。ここでスキャン範囲が固定され、最後のm / zが始まるのm / zの15倍よりも大きくするべきではありませんので） </li><li>イオン源が安定すると、カスタマイズされた後、キャリブレーションを行う。注：安定したソースがポジティブモードで総イオン電流変化量の10％未満と定義し、ネガティブモードで15％未満れる。カスタマイズされたキャリブレーションイオンおよび対応するm / zが表1に列挙されている。 </li></ol></li><li>極性代謝物分析のためのLC-MS装置を確立します。 LCは、代謝産物の分離および検出のためのQE-MSに連結されている。 <ol><li>加熱されたエレクトロスプレーイオン化プローブ（H-ESI）とQE-MSを装備。記載されているプローブに関連するチューニングパラメータを設定します。ヒーターの温度、120℃;シースガス、30;補助ガス、10; 、スイープガス3; 、電圧をスプレーするため3.6 kVのポジティブモード及びネガティブモードのは2.5kV。 55で320℃、キャピラリー温度、およびS-レンズセット。 </li><li>フルスキャン範囲：次のようにフルスキャンの方法を構築する60から900（M / z）を;解像度70,000;最大射出時間：50ミリ秒の周りに典型的な噴射時間で200ミリ秒;自動利得制御（AGC）3,000,000イオン。これらの設定は、正と負の両方のモードでスキャンを実行するために周りの550ミリ秒のデューティサイクルをもたらす。 </li><li>クロマトグラフィー法を確立する。室温13,15での化合物の分離のために、アミドカラム（100×内径2.1 mm 3.5 mm）を使用する。上述したように、移動相Aであり、移動相Bはアセトニトリルである。以下のように線形グラデーションを使用します。0分85％のB; 1.5分間、85％B、5.5分、35％B; 10分、35％B、10.5分、0〜10分15〜35％B、14.5分、35％B、15分間、85％B、20分間、85％B.流速0.15ミリリットル/分20分、10.5〜14.5分で0.3ml /分である。 </li></ol></li></ol> 2。のPr代謝産物試料のeparation <ol><li>抽出溶媒を準備します。 50mlチューブ中の40 mlのメタノール（LC-MSグレード）および10 mlの水（LC-MSグレード）に混合し、使用前に少なくとも1時間、-80℃の冷凍庫に保管してください。注：この手順は、以下の手順とは、生体組織および体液試料を抽出するために修飾することができる。 <ol><li>完全な増殖培地で3 10cmの皿または6ウェルプレート中で培養大腸癌HCT 8細胞は、RPMI 1640 10％熱不活化ウシ胎児血清および100,000単位/ Lのペニシリンおよび100mg / Lのストレプトマイシンを補充した。 </li><li>細胞が80％コンフルエントに達したときに、すぐに培地を除去し、ドライアイス13,15の上に皿またはプレートを配置します。すぐに（80％メタノール/水）、溶媒1ミリリットル抽出を追加し、-80℃の冷凍庫にプレートを転送する。 10cmディッシュのために、各ウェルに抽出溶媒の3ミリリットルを追加します。 （中の媒体から残留塩によるイオン抑制の影響を避けるために可能な限り削除するようにしてください。）</li><li> 15分間のプレートのままにしておきます。冷凍庫から取り出し、ドライアイス上で溶媒中に細胞をこすり取る。 1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに溶液を移し、10分間4℃で2万×gでの速度で遠心する。 （3反復サンプルを作るために3つの別々の皿から細胞代謝物を準備します。2のチューブを維持する目的は、バックアップとして1を持つことです。） </li><li> 2新しいエッペンドルフチュー​​ブに上清を移し、高速真空でそれらを乾燥させます。これは、使用高速真空に応じて約3-6時間かかります。 （サンプルはまた、窒素ガス下で一晩乾燥させることができる。） </li><li>乾燥後、-80℃の冷凍庫で各サンプルのストアのチューブ。準備ができたら、20mlの水（LC-MSグレード）に一つのサンプルを再構成し、分析のためにLC-MS QE-5ミリリットル注入する。 </li></ol></li></ol>サンプル·シーケンスの3。セットアップ<ol><li>較正が正しくQE-MS上で実施された後、流量で85％のAで5分間、LCカラムを平衡化LC勾配の開始条件は0.15 ml /分の速度。 </li><li>ランダムにサンプル·シーケンスを設定します。注：このようにして、各サンプルにLC-MSによって導入変動を分配し、異なるサンプル間のより正確な比較を確実にする。 LCグラジエントは10分間95％Aで0.15 ml /分の流速で85％Aで5分のカラム平衡化に続い除くすべての6サンプルは、同じMS法を共有する洗浄運転を追加する。システムのバックグラウンドを評価し、レベルに運ぶために、各洗浄の実行後にブランク試料（水100％）を追加します。 </li><li>シーケンスを保存し、LCカラムは400 PSIまわり、安定した圧力を示し、一度、シーケンスの実行を開始します。他のサンプルが存在しない場合、この配列の後に実行されるべきであり、次いで、グラジエントの最後0 ml /分の流量を有する配列の端部にストップランを追加し終えた後に「スタンバイ」を選択するシーケンス。 </li><li>再実行して同じサンプルは、キャリブレーション後の12時間に設定してください。 （これは私がキャリブレーション後の質量誤差の変動を評価するための）。 </li></ol> 4。ポストの分析計測器クリーニングとメンテナンス<ol><li>シーケンスの最後に、0.2〜2時間、ml /分の流速で95％Aでカラムを洗浄し、必要に応じて、洗浄前の列を逆転。 </li><li> LCカラムを取り外し、直接結合によってイオン源へのLCを接続してください。 （：V：V、90:10:0.2 v）を、待機モードにMSを設定し、除去し、1時間0.1ミリリットル/分の流速でLC-MSシステムを洗浄溶媒としては、水/メタノール/ギ酸を掃除調製残差は、塩または他の不純物を沈殿させた。あまりにも多くのシステム圧力がある場合、流量を低下させる。 </li><li> 50℃のキャピラリー温度を設定し、イオンケージを取り外す。キャピラリー温度が50℃まで低下した後、慎重にイオンスイープコーンおよびイオントランスファーチューブを取り出しイオンスイープコーンの表面に残った不純物を除去するために、サンドペーパーなどの粗いメッシュを使用する。 </li><li>イオンの移動を置く0.1％ギ酸を含む10ミリリットルの90％水/メタノールを含有する15 50mlのFalconチューブにチューブ。 20分間水浴超音波処理チューブを超音波処理した後、内部の溶媒をデカント10ミリリットル純メタノールと交換し、さらに20分間超音波処理。 （必要に応じて、超音波処理は、良好な洗浄結果を達成するために40℃以上、より高い温度で行うことができる。） </li></ol> 5。LC-MSデータの解析を<ol><li>サンプル·シーケンスを確実にするためには、シーケンスの最初の二つのサンプルを終えた後、未知の代謝物ピークを確認し、スムーズに動作します。入力ファイルとして、代謝物名、中性化学式および検出モード（正または負）の一覧のCSVファイルを使用して、出力ファイルはppmで抽出されたピークと質量誤差が含まれています。ピーク形状が異常であるか、質量誤差が5ppm以下でオフである場合、シーケンスの残りの部分は停止し、トラブルシューティングを行う必要があることが必要である。 </li><li> 「ピークの位置合わせの方法を選択してくださいそして市販のソフトウェアでのフレーム抽出」。 LC-MSおよびグループ化からの生データを選択します。ピークの位置合わせのためのクロマトグラフィーの基準サンプルとして実行シーケンスの途中でサンプルを選ぶ。収集した情報に基づき対象となる代謝物の分析と、対応するフレームの種のための既知の代謝物を含むフレームの種をアップロードします。 </li><li>別々に正および負のモードでデータ解析を行う。他のパラメータのデフォルト設定を使用してください。データベースの検索機能をオフにして、ワークフローを実行します。すべてのフレームのピーク面積を含むExcelシートとして処理されたデータをエクスポートします。フレームの最初のセットは、ターゲットリスト内の代謝物に対応しています。注：標的代謝産物分析のために、代謝産物情報は、以前の研究13,15に基づいて取得される。 </li><li>非標的代謝物分析のために、「成分抽出」の方法を選択します。バックグラウンド除去のためのブランク試料をロードします。設定したピーク強度閾値aをt10の5,3の対雑音比10 ppmおよび信号のm / zの幅。 </li><li>未知の化合物の同定のためのヒューマン·メタボローム·データベースを使用します。反復サンプル内の大きなCVSでコンポーネントを削除するのCVフィルタを使用します。手動で各コンポーネントを通過し、明確に定義されたピークまたはデータベース検索のための種々のサンプルタイプでは比較的大きな差を持つものを選択します。データベース内のヒットしたデータをエクスポートします。 （ピークアラインメントスコアが低すぎる場合には、ピーク位置合わせをバイパスすることができる。） </li></ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

著者らは、利害の衝突を宣言していません。

このプロトコルを使用して、細胞内の正常な代謝物プロファイリングのための最も重要なステップは次のとおりです。1）増殖培地、細胞を慎重に取り出しを制御する。 2）定量のためのピーク間で十分に（通常は少なくとも10）のデータ·ポイントがあることを確認するために、MSメソッドの設定に基づいて、LC法を調整する。 3）サンプルを実行する前に、低質量キャリブレーションを行う。...

同時に複数の代謝物を測定した実験として定義メタボロミクスは、強烈な関心領域となっている。メタボロミクスは、分子生理学の直接的な読み取りを提供し、癌の1-4などの開発や病気への洞察を提供してきました。核磁気共鳴（NMR）、ガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）は、最も一般的に使用される器具5-9の一つである。 NMR、特に、13 C標識された代謝産物などの重同位体標識された化合物は、以降フラックス実験のために使用されている、10,11 NMR活性である。しかし、この戦略は、比較的高いサンプル純度とメタボロミクスへの応用が制限され、大きなサンプル量を必要とする。一方、NMRから収集されたデータは、集中的な分析を必要とし、複雑なNMRスペクトルの化合物の割り当てが困難である。 GC-MSは、広く極性代謝および脂質研究のために使用されてきたが、それは揮発性compounを必要とするDS、したがって、場合によっては時間がかかる可能性が錯体化学を伴い、実験ノイズが導入されて代謝物の多くの場合、誘導体化、。 第3の四重極を特徴フラグメントまたは娘イオンを選択するために使用される三連四重極質量分析に連結した液体クロマトグラフィー（LC）は、次いで、第2四重極で断片化された無傷の親イオンを選択するための第1の四重極を使用する。特定の娘イオンの親イオンからの遷移を記録するこの方法は、多重反応モニタリング（MRM）と呼ばれる。 MRMは、小分子とタンパク質定量12-15,21両方のための非常に感度が高く、特異的で、かつロバストな方法である。しかし、MRMはその制限があります。高い特異性を達成するために、MRM方法は、各代謝産物のために構築する必要がある。この方法は、プロペンの事前知識を必要とする、特定のフラグメントを識別し、最適化された衝突エネルギーを対応するから成りこのような化学構造情報のような目的の代謝産物のrties。したがって、一般的なフラグメントのニュートラルロスを伴ういくつかの例外を除いて、それがこの方法で、未知の代謝物を同定することは不可能である。 近年では、高分解能質量分析（HRMS）器具は、例えばLTQ-オービトラップとExactiveシリーズ、QuanTof、およびTripleTOF 5600 16-18,22として、リリースされている。 HRMSは、数ppmの誤差内で無傷のイオンの比（m / z）の質量電荷を提供することができる。したがって、すべての前駆体イオン（ すなわち、フルスキャンモード）を検出することによって操作HRMS器具は、正確な質量及び分析物の得られた元素組成から直接の構造情報を得ることができ、この情報は、潜在的な代謝産物を同定するために用いることができる。実際、化合物に関するすべての情報は、構造異性体のレベルまで、正確な質量を得ることができる。また、フルスキャン方式は、代謝物の予備知識を必要とせず、法の最適化を必要としません。のm / zの走査範囲に落ちると、全てのイオンを分析することができるので、HRMSは、MRM法と比較して、単一の実行で定量することができる代謝産物の数の点でほぼ無制限の容量を有する。 HRMSも発生するフルMSスキャンで得られるデータ点の同程度の数が、その結果、短いデューティ·サイクルに定量的な能力の三連四重極MRMに匹敵する。したがって、HRMSは、定量的メタボロミクスのための代替アプローチを提供します。近年、HRMSの改良版は、（QE-MS）は、検出範囲19を拡張し 、単一の方法では十分に速いサイクル時間を有する正および負のモード間の切り替えの下で動作させることができるQ-Exactive質量分析法と呼ばれる。ここでは、QE-MSを用いて当社のメタボロミクス戦略を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。しかし、現在のプラットフォームでは、このような労働集約的試料調製、低検出限界、スロースキャン速度、各代謝のための集中的な方法の最適化、および積極的に両方を測定することができないことや、単一の実験では負に帯電したイオンなどの異なる制限要因を持っています。このため、新たなメタボロミクスプロトコルはメタボロミクス研究を進めることができます。アミド系親水性クロマトグラフィーは、任意の化学的誘導体化することなく、極性代謝物の分析を可能にします。 Q-Exactive（QE-MS）を用いて高分解能MSは、イオン光学系を改善し、スキャン速度（解像度7万256ミリ秒）に上昇し、正/負切り替えを行う能力を有している。冷メタノール抽出戦略を使用して、QE-MSとのアミドの列を結合することは、同時に、追加機能の168の標的極性代謝と数千のロバストな検出を可能にします。 DAT処理は非常に効率的な方法で市販のソフトウェアを用いて実施され、マススペクトルから抽出された未知の機能がデータベースに照会することができる。

メタボロミクスデータの精度は非常にLC-QE-MS装置の性能に依存します。器具が良好な状態で動作しているかどうかを評価するために、 図1に示すように、適用される方法が適切であるかどうか、いくつかの既知の代謝産物のLCピークは、全イオンクロマトグラム（TIC）から抽出される。アミノ酸を含む極性代謝産物、解糖中間体、TCA中間体、ヌクレオチド、ビタミン、というよう?...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。極性切り替えと迅速なデューティサイクルの高分解能質量分析に連結された正常相化液体クロマトグラフィーを利用して、我々は、高感度、精度、および解像度を有する生物学的物質の極性代謝物を分析するためのプロトコルを記載している。

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K ビュー.  Cornell University. 代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。極性切り替えと迅速なデューティサイクルの高分解能質量分析に連結された正常相化液体クロマトグラフィーを利用して、我々は、高感度、精度、および解像度を有する生物学的物質の極性代謝物を分析するためのプロトコルを記載している。 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

生物学

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

大規模なSNPジェノタイピングアプリケーション用インフィニウムアッセイ

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...