אנו מכירים תמיכה של NIH מענקי P30ES013508 ו5T32GM008076. אנו מודים גם תרמו מדעיים לגישה לנפה 2.0 ובני זוג. יוג&#39;ין Ciccimaro ומארק סנדרס של תרמית מדעית לדיונים מועילים.

1. הפקת דגימה מתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחת 10 ס&quot;מ של תאים: לאסוף 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא הגבהה מדיה לתוך צינור צנטריפוגות זכוכית מסומן מראש 10 מ&quot;ל. לשורות חסיד, צריכים להיות הרים תאים עם גירוד עדין ב1.5 מ&quot;ל של תקשורת כל הזמן על קרח אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף aliquot מתאימה בשלב זה. הערה: מרווה של חילוף חומרים תאיים חיונית למטבוליטים מסוימים. לניתוח של מטבוליטים זמן רגישים, כגון מיצוי הליכי מתנול קר צריכים להיחשב. 17 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל של כלורופורם (CHCl 3) / מתנול (CH 3 OH) (2:1, V / V) לכל אחד מצינורות זכוכית 10 מ&quot;ל המכילים את הדגימות. הגדר את הדגימות שבייקרו או רב vortexer במהירות נמוכה למשך 30 דקות. אחרי שלחצתי, דגימות centrifuged עם הגדרת ההאצה / האטה נמוכה ב 1935 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד את השלבים לגמרי. אופציונלי </eמ &#39;&gt;: כדי להימנע מהשימוש בCHCl 3, עקירות יכולות להתנהל עם dichloromethane (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, להעביר את השכבה האורגנית (תחתון) לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. המשך 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מימית העליון מאוחר יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. להתאדות המדגם תחת גז חנקן. תמשיך 2.6.2 לdesalting השלב המימית או להמשיך 4.1 לניתוח ישיר. </li></ol> 2. הפקת מדגם מסרום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 20 μl של סרום לתוך צינור פלסטיק 2 מ&quot;ל אפנדורף אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף aliquot מתאימה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 190 μl של CH 3 OH ומערבולת עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 380 μl של CHCl 3 ו מערבולת עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 120 μl של H 2 O כדי לגרום להפרדת פאזות. וורטקס הדגימות עבור 10 שניות ומאפשר לאזן על RT במשך 10דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד בין השלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני נמוך יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. המשך 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מימית העליון מאוחר יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. להתאדות המדגם תחת גז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות מדגם H בμl 200 2 א &#39; ריאגנטים חומצה או בסיס (0.1% חומצה אצטית, חומצה פורמית או 0.1% אמוניום הידרוקסיד) עשויים לשמש כדי לחלץ מעדיף מטבוליטים רגישים pH. Sonicate במשך 20 דקות על קרח כדי מחדש להשעות המדגם לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את עמודות ספין C18 עם CH μl 500 3 OH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את עמודת הספין עם שני שוטף של H 2 O μl 500 ולאחר מכן לטעון את המדגם. אם נעשה שימוש בחומרים כימי חומצה / בסיס לשמור על ריכוז זה בשלבים לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם H 2 O μl 500 לdesalt המדגם. שוב, אם נמצאים בשימוש חומרים כימיים חומצה / בסיס לשמור על הריכוז הזה בכביסהצעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם שני כרכים של 80% μl 200 CH 3 OH בH 2 O לתוך צינור נקי 2 שכותרתו מראש מיליליטר אפנדורף. שוב, אם נמצאים בשימוש חומרים כימיים חומצה / בסיס לשמור על ריכוז זה בשלבים לשטוף. המשך 4.1. </li></ol> 3. הפקת דגימה מהרקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לרקמות, השתמש בין 10-100 מ&quot;ג של רקמה קפוא. הוסף כל פיסת הרקמה שלכותרתו מראש צינור Eppendorf שייר נמוך מ&quot;ל 2 עם 1 מ&quot;ל של PBS (1 M, pH 6.8) באמבט קרח אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף אותו למאגר, לפני הוספה הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמות בקרח עם מטחנת רקמה חשמלית למשך 30 שניות בכל אפנדורף. בין דגימות, לנקות את מטחנת הרקמה בשני צינורות נפרדים המכילים CH 3 OH ו-H 2 O, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את homogenate הרקמות עם טפטפת פלסטיק לתוך צינור צנטריפוגות זכוכית שכותרתו מראש 10 מ&quot;ל. לאחר ההעברה, יש לשטוף את כל צינור Eppendorf2x עם 1 מ&quot;ל של CH 3 OH ולהוסיף את שוטף לhomogenate הרקמות בצינורות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של CHCl 3 לכל אחד מצינורות זכוכית 10 מ&quot;ל המכילים homogenate הרקמות ו3 שוטף OH CH. הגדר את הדגימות שבייקרו או רב vortexer במהירות נמוכה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלחצתי, צנטריפוגה דגימות עם הגדרת ההאצה / האטה נמוכה ב1,935 XG במשך 10 דקות כדי להפריד את השלבים אופציונלי לחלוטין:. כדי להימנע משימוש בכלורופורם, עקירות פותחו עם CH 2 Cl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, להעביר את השכבה האורגנית (תחתון) לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. המשך 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, מעביר את השכבה המימית לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. עבור ל2.6.2 לdesalting או להמשיך ל -4.1. </li></ol> 4. השעיה מחדש וסינון של דוגמאות לUPLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות SAMPLes תחת גז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקם ייבש את דגימות בנפח מתאים של הפתרון מוצא לשיטת UPLC הרצויה (ראה טבלה 1). 50-100 μl הוא בדרך כלל נפח השעיה מחדש רצוי. מערבולת בעדינות ו / או פיפטה המדגם למעלה ולמטה כדי לסייע בהמסת analytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הדגימה למסנן 0.22 מיקרומטר ניילון צינור ספין במהירות של עד 14,000 XG עד המדגם עבר לחלוטין דרך המסנן (~ 5 דקות). ודא שאין משקעים שנותרו גלוי במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant המדגם המסונן לתוך בקבוקון UPLC שכותרתו מראש עם הוספה. בקבוקון פקק, לאחר מכן קפיצי בקבוקון כדי להסיר בועות מתחתית בקבוקון המדגם. הנח את הדוגמא בautosampler המקורר (4-5 מעלות צלזיוס). </li></ol> 5. התקנת UPLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת השליטה לכרומטוגרף נוזלי, ליצור ריצה למדגם האורגני המבוססת על הנחה של התנאים המפורטים ב <strאונג&gt; טבלת 1. לאחר מכן ליצור שיטה לשלב המימית את התנאים המפורטים בטבלה 1 אופציונלי:. אם סט ידוע של analytes היעד הוא של ריבית גבוהה, לייעל את תנאי שימוש בUPLC האנלוגי שכותרתו הכבדה של תרכובות אלה, וליצור באמצעות שיטה בתנאים אלה . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר UPLC לאזן כראוי. זו צריכה לכלול תחול מלא ממסים לפני הצמדת טור, ובעקבות הוראות היצרן עבור נפח איזון של עמודה חדשה (בדרך כלל 3-5 כרכי עמודות). לשמור על יומן של הפעלה לחצים בחזרה כדי לסייע באבחון בעיות בעתיד. </li></ol> 6. התקנת ספקטרומטר מסות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת השליטה לספקטרומטר מסות ברזולוציה גבוהה, ליצור שיטת מצב חיובית תוך שימוש בתנאים המפורטים בטבלה 2. לאחר מכן שימוש באותם תנאים, ליצור שיטת מצב שלילית אופציונלי:. אם סט ידוע של analytes היעד הוא של int הגבוהerest, מקור לייעל ותנאי שימוש באופטיקה האנלוגי שכותרתו כבדה של תרכובות אלה, וליצור באמצעות שיטה בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ולכייל את המכשיר, להקים תרסיס יציב לספקטרומטר, ולאפשר זמן לפתרון הכיול כדי להפיג במידה מספקת מהמקור ואופטיקה. יציבות קביל של תרסיס צריכה לתת 3-5% RSD בעוצמה מעל 100 לפחות סריקות עם הזרקה של תמיסת כיול באותו קצב הזרימה כשיטת LC בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר רצף עבור כל הדגימות, להגדיר את עוצמת זריקה מתאימה, ולהפעיל ריק לפני המדגם הראשון. אם שריד או מטריצת השפעות בין דגימות חשודות, לרוץ החסר / שטיפה נאותים. דגימות צריכה להיות הגדרה באופן אקראי באמצעות מחולל מספרים אקראיים ומפתח כדי למנוע השפעות אצווה שהוצגו על ידי ניתוח. הערה: דגימות בקרת איכות לרבות תקני איזוטופ יציבים או סטנדרטים אנליטיות של מטרות סבירות יכולות להיותיקר מאוד בפתרון הבעיות ומבטיחים תוצאות אמינות, לשחזור, וחוקיות. לשכפל טכני של מדגם רק סטנדרטי ואחריו ריק ממס יכול לשמש לכניסות סטייה של עוצמת אות וזמן שמירה, כמו גם שריד לטווח הריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל רצף ולפקח מעת לעת לבעיות, כולל תנודות בלחץ, או אובדן של עוצמת אות על פני הטווח. אם בעיות חמורות מזוהות, להפסיק את הריצה, וחזור מ -6.2. </li></ol> 7. ניתוח ההפרש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי זרימות עבודה מוצגות לפרוטוקול זה. הראשון הוא בנפה 2.0, תוכנה לניתוח ההפרש ללא תווית קניינית נמכרת על ידי תרמו פישר. העבודה השנייה היא באמצעות XCMS באינטרנט, פלטפורמה החופשית באמצעות מכון מחקר Scripps. -11 לפני תחילת ניתוח ההפרש, באופן ידני לבדוק את טיקים או להסתכל chromatograms מסונן לכל תרכובת ידועה במדגם כדי להבטיח שחזור של ריצותוהזרקת יציבות / UPLC / ספריי לאורך כל הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את קבצי הנתונים הגולמיים. מספקטרומטר המסות על הכונן הקשיח של תחנת העבודה שבו נפה מותקנת. (הערה: נפו את הריצה עם הנתונים המאוחסנים על כונן מחובר לרשת או יציאת USB לא מומלצת כפי שהוא יכול להגביל את המהירות של ניתוח.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפה את פתוח, ולהתחיל ניסוי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את הקבצים המתאימים למסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת קבוצות השוואה ובחר בקובץ התייחסות אחת כדי לאפשר למסננת כדי ליצור את הפרמטרים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההנחיות ולהתאים את כל פרמטרים לדרישות של כל ניסוי בודד. זה בדרך כלל מומלץ להתחיל עם פרמטרים מחמירים ולאחר מכן לחזור ולשחרר את הפרמטרים כהגדרות נדיבות יותר יכולות להאריך את זמן ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את רשימת adduct הנכונה למצב חיובי או שלילי בפרמטרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> XCMS המקוון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר קבציםלפורמט מקובל לXCMS באינטרנט. במקרה שלנו, אנחנו להמיר לפורמט mzXML. 19 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> XCMS הפתוח באינטרנט, וליצור עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלה שם את מערכי נתונים. רק שני מערכי נתונים (לדוגמה, בקרה לעומת טיפול) ניתן להעלות כXCMS עצמאי מוגבל להשוואות ראש בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות רצויות מהרשימה הנפתחת. פרמטרים שאוכלסו כבר זמינים עבור setups מכשור שונה, ויכולים להיות שונה אלה נוספים לצרכי ניסוי. במקרה שלנו, אנו משתמשים בהגדרות HPLC-Orbi2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח ולאשר את העבודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למסננת וXCMS רשימה של מסגרות ותכונות, בהתאמה, תהיה מאוכלסת ברגע הניתוח הוא סיים. להבטיח כי כל שכבות יישור LC פסגות ציון דרך. אם כל אחד מריצות LC המעוות מראה סטייה גדולה בפסגות ציון דרך זה עשוי להצביע על בעיה במדגם. אופציונלי: למסננת, אם נעשו שימוש בסטנדרטים פנימיים, אתרקבוצת השיא המקבילה ולנרמל למסגרת שנבחרה. לXCMS on-line, ניתן לעשות נורמליזציה בגיליון אלקטרוני לאחר יצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את הנתונים על ידי מקדם שונה (CV) בתוך אוכלוסיית מדגם כמו (דגימות בקרה למשל). כל ערכי CV גדולים עשויים להצביע על בעיה בדגימה אחת או יותר. למיין את הרשימה המבוססת על תכונות רצויות (p-value &lt;0.05, שינוי פולד&gt; לדוגמא 1.5, סטיית תקן נמוכה בתוך קבוצה, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון כל שיא ביישור מתאים לשיא בכל קבוצות, אינטגרציה שיא, שיא צורת גאוס, עוצמת אות, איזוטופים, והמחאת adduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא הנתונים המועדפים לניתוח נוסף או ליצור רשימות המוניות ממוקדות על אישור וניסויי n טרשת נפוצה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+the+fission+yeast+S.+pombe:+quantification+of+compounds+under+different+temperatures+and+genetic+perturbation.">Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation.</a> Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).</li><li>Makarov, A., Denisov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+Evaluation+of+a+Hybrid+Linear+Ion+Trap/Orbitrap+Mass+Spectrometer.">Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).</li><li>Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative,+validated+capillary+electrophoresis-time+of+flight-mass+spectrometry+method+with+integrated+high-confidence+analyte+identification+for+metabolomics.">Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics.</a> Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).</li><li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+methods+for+differential+analysis+of+LC/MS+profile+data.">Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data.</a> BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).</li><li>Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultra+performance+liquid+chromatography+coupled+to+q-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies.">High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).</li><li>Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS2:+processing+tandem+mass+spectrometry+data+for+metabolite+identification+and+structural+characterization.">XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization.</a> Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).</li><li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine:+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data.">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+Modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).</li><li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS:+Processing+Mass+Spectrometry+Data+for+Metabolite+Profiling+Using+Nonlinear+Peak+Alignment,+Matching,+and+Identification.">XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li><li>Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XCMS+Online:+A+Web-Based+Platform+to+Process+Untargeted+Metabolomic+Data.">XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).</li><li>Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Lipid+Extraction+for+Targeted+Stable+Isotope+Dilution+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+Analysis.">Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis.</a> J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).</li><li>Want, E. J., Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLCG&#199;&#244;MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCG&#199;&#244;MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li><li>Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+suspension-cultured+mammalian+cells+for+global+metabolite+profiling.">Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling.</a> Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).</li><li>Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+evaluation+of+metabolite+extraction+protocols+for+untargeted+metabolic+profiling+of+liver+samples+by+UPLC-MS.">Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).</li><li>Shaham, O., Slate, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+signature+of+human+mitochondrial+disease+revealed+through+metabolic+profiling+of+spent+media+from+cultured+muscle+cells.">A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).</li><li>Cequier-Sa&#252;nchez, E., Rodri&#252;guez, C., Ravelo, A. G., Za&#252;rate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichloromethane+as+a+Solvent+for+Lipid+Extraction+and+Assessment+of+Lipid+Classes+and+Fatty+Acids+from+Samples+of+Different+Natures.">Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).</li><li>Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+proteomics+MS/MS+analysis+platform+utilizing+open+XML+file+formats.">A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats.</a> Mol. Syst. Biol. 1, (2005).</li><li>Cleveland, W. S., Devlin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+weighted+regression+-+an+approach+to+regression-analysis+by+local+fitting.">Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting.</a> J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).</li><li>Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+alignment+procedures+for+LC-MS+proteomics+and+metabolomics+measurements.">Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).</li><li>Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+feature+detection+for+high+resolution+LC/MS.">Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).</li><li>Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAMERA:+An+Integrated+Strategy+for+Compound+Spectra+Extraction+and+Annotation+of+Liquid+Chromatography/Mass+Spectrometry+Data+Sets.">CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets.</a> Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).</li><li>Kanehisa, M., Goto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG:+kyoto+encyclopedia+of+genes+and+genomes.">KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).</li><li>Smith, C. A., O'Maille, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+a+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: a metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).</li><li>Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PubChem:+a+public+information+system+for+analyzing+bioactivities+of+small+molecules.">PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules.</a> Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).</li><li>Wishart, D. S., Knox, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB:+a+knowledgebase+for+the+human+metabolome.">HMDB: a knowledgebase for the human metabolome.</a> Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li><li>Folch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).</li><li>Avery, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+differential+ion+suppression+on+liquid+chromatography/atmospheric+pressure+ionization+mass+spectrometric+bioanalytical+methods.">Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

לא ממוקד metabolomics מציע כלי רב עוצמה לחקירת biotransformations אנדוגניים או xenobiotic, או לכידת פרופיל מטבולי ממדגם של ריבית. הפלט של המאזניים הטכניקה עם הרזולוציה והרגישות של הטכנולוגיה המשמשת להפריד ולנתח את הדגימה, את היכולת להתמודד עם מערכי נתונים הגדולים שנוצרו, ואת היכולת שלי...

בשל התקדמות טכנולוגית האחרונה בתחום HRMS, לא ממוקדים, בmetabolomics השערה שהניבו גישות הפכו גישה אפשרית לניתוח של דגימות מורכבות. 1 ספקטרומטרים המוני המסוגלים להקל על חלק 100,000 רזולוציה נמוכה שגרה למ&#39; (חל&quot;מ) דיוק המוני הפכו נרחב זמין של ספקים מרובים. 2,3 דיוק זו מאפשר מסה סגוליות ואמון במשימה ראשונית של זהות אנליטי, זיהוי תבניות איזוטופי, והזדהות adduct גדולים יותר. 4 בשילוב עם הליך מיצוי הולם ו, תערובות מורכבות עתירי ביצועים LC או UPLC ניתן לנתח עם ייחוד נוסף נובע מנתונים בזמן שמירה. 5 UPLC בעל יעילות רבה יותר ומאפשר chromatographic רגישות רבה יותר, רזולוציה וניתוח בזמן ביצוע כיסוי גדול יותר של 6 metabolome אפשרי. במערכי הנתונים הגדולים כתוצאה מכך יכולים להיות משולבים בכלשל תוכנת ניתוח ההפרש מרובה ולכרות לדפוסים שימושיים או analytes הבודדים של עניין. 7,8,9,10,11 להיטים משוער יכולים להיות מזוהים בתחילה באמצעות שילוב של אלגוריתמים לזיהוי שיא, ניבוי המבוסס על נוסחה כימי מסה מדויקת, תחזית פיצול, ו חיפוש כימי מסד הנתונים. גישה זו מאפשרת לתעדוף של מטרות לזמן רב הזדהות מבנית מלאה או לפיתוח של דילול איזוטופ יציב יותר רגיש ויותר ספציפי תגובת UPLC / הנבחר או מרובה ניטור / MS מחקרים שהשיטות הסטנדרטיות הנוכחיות הזהב לכימות. 12 הטבע שונה של דגימות ביולוגיות הוביל לאופטימיזציה של פרוטוקולי חילוץ לשתן 13, 14 תאים, סרום 15, 16 או רקמה. זה פרוטוקול תכונות עקירות לתאים, סרום, ורקמות. במקרה צורך, הערות והפניות נוספות כבר כלולות עבור modifications של ההליך כדי לטפל בהכללתו של איזוטופים יציבים, או להכללה של מטבוליטים לא יציבים במיוחד.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W7-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (CH3CN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CH3Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td>Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (CH2Cl2)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61030-1000</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid (FA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate (HCOONH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78314</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin C18 Columns</td>
			<td>Nest Group Inc</td>
			<td>SS18V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Centrifuge Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>73785-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>CLS-4301-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60000751CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Inserts (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT094171</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (plastic)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002640</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8169</td>
			<td>nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3229-1</td>
			<td>Low Retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL-Orbitrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC/UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>nanoACQUITY UPLC</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Michrom</td>
			<td>Thermo Advance Source</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Analysis Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SIEVE 2.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoACQUITY C18 BEH130</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003546</td>
			<td>1.7 &mu;m particle size, 150 mm x 100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acentis Express C8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54262</td>
			<td>2.7 &mu;m particle size, 15 cm x 200 &mu;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms)

כאן אנו מציגים זרימת עבודה כדי לנתח את הפרופילים המטבוליים לדגימות ביולוגיות של עניין, כולל; תאים, סרום, או רקמה. המדגם מופרד ראשון לשברים קוטביים ולא קוטבי על ידי מיצוי שלב נוזלי נוזלי, ומטוהר באופן חלקי כדי להקל על ניתוח במורד הזרם. שניהם מימיים (מטבוליטים קוטב) ואורגניים (מטבוליטים שאינם קוטביים) שלבי ההפקה הראשונית מעובדים ליסקרו מגוון רחב של מטבוליטים. מטבוליטים מופרדים על ידי שיטות כרומטוגרפיה נוזליות שונות המבוססות על מאפייני החלוקה שלהם. בשיטה זו, אנו מציגים Ultra-ביצועי microflow (UP) שיטות LC, אך הוא ניתן להרחבה לפרוטוקול תזרים גבוה ולחצים נמוכים יותר. מבוא לספקטרומטר המסה יכול להיות דרך או תנאים אופטימליים כלליים מקור או תרכובת. זיהוי של מגוון רחב של יונים מתבצע במצב סריקה מלא במצב חיובי ושלילי על פני טווח מ &#39;/ z רחב ברזולוציה גבוהה תוך שימוש בבאחרונה גalibrated מכשיר. תווית ללא ניתוח ההפרש מתבצע על פלטפורמות ביואינפורמטיקה. יישומים של גישה זו כוללים הקרנת טבולי מסלול, גילוי סמן ביולוגי, ופיתוח תרופות.

התוצאות שהוצגו מראות נתונים נבחרים מטיפול של 6 שעות של תאי glioblastoma SH-SY5Y עם חומרי ההדברה וrotenone מעכב אני מורכב המיטוכונדריה. לשם קיצור, רק את הנתונים החיוביים במצב האורגני השלב מוצגים. הדגימות עובדו ונותחו כמתואר לעיל (איור 1, טבלת 1, טבלת 2) והועמסו על שתי פלטפורמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS at JoVE.com

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

22.2K Views.  University of Pennsylvania. לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HR...

Video: Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

הדמיה קורוזיה בממשק צבע מתכת באמצעות המסה של זמן טיסה משני המוני ספקטרומטריה

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

שחזור פרופיל עומק תלת ממדי של זיהומים מופרדים באמצעות ספקטרומטריית מסת יונים משנית

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

אפיון שינויי RNA בתאי עצב בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...