実験室で行われる研究活動は、研究財団からの補助金によって支えられて - フランダース（FWO、助成番号G.0545.08とG.0298.11）、大学間の観光極プログラム（ベルギーの科学政策、助成番号P6/28とP7/13）とFWOでサポートされている研究コミュニティに埋め込まれています。フランダース（FWO） - CDHは研究財団の博士研究員である。著者は、分子·細胞内シグナル伝達（KUルーベン）、博士SPスリニバス（検眼、米国インディアナ大学）博士Leybaert（ゲント大学）との研究室の研究室のすべての現在および元メンバーに非常に感謝しています有用な議論を、最適化された手順やコネキシンヘミチャネルの研究のためのツールの開発に関与していたが提供博士Vinken（VUB）。

1。角膜内皮細胞の分離始める前にした場合：目をenucleating後できるだけ早く、地元の屠殺場から入手した、新鮮な目から細胞を分離します。目が最大18ヶ月、5分死後とアールの平衡塩類溶液中で保存の牛から、摘出されたことを確認してください - 4で1％ヨウ素溶液実験室への輸送のための°C。 <ol><li> 1％ヨウ素溶液をペトリ皿（100×20㎜）に置く - アールの平衡塩溶液の目を取り出します。 </li><li> 70％エタノールを含有する溶液と目を殺菌し、1％のヨウ素が含まれているアールの平衡塩類溶液で洗い流してください。 </li><li>でこの手順から、無菌フードで働く。注意深く目から角膜を解剖し、上向き上皮細胞層とアールの平衡塩類溶液を含むペトリ皿（35×10mm）で、中に入れてください。慎重に残っ虹彩組織のSTIを削除必要に応じて角膜に付着う。 </li><li>上向きの内皮細胞層とペトリ皿を含む別のアールの平衡塩類溶液に角膜を転送し、アールの平衡塩類溶液で2回すすいでください。 </li><li>カップ状の皿です砂時計に上向き内皮層と角膜を移し、増殖培地でそれをカバーしています。増殖培地は、25 mMグルコース、10％ウシ胎児血清、6.6％L-グルタミン、2.5μgの/ mlのアムホテリシン-Bと1％抗生物質 - 抗真菌剤混合物を10,000単位を含む/ mlペニシリン、10,000アンピシリンを含有するダルベッコ変法イーグル培地から成りストレプトマイシン/ mlで、25μgの/ mlのアムホテリシンBを</li><li>吸引ピペットで培地を除去。 </li><li>角膜の内皮層（トリプシンを含むすべてのステップが同じ濃度を使用して行われています）にトリプシン溶液（0.5グラム/ L）を300μlを適用します。 </li><li>覆われたペトリ皿に角膜を含む砂時計を置き、株式会社に入れ37℃で30分間ubator℃、5％CO 2。 </li><li>優しく無菌フード内火災研磨フック状のガラスパスツールピペットを用いて角膜から内皮細胞をこすり取る。 </li><li>内皮細胞を含む溶液を吸う、培養培地4mlを含有する培養フラスコ（25cm 2の ）に追加する。 </li><li>角膜に増殖培地300μlのを適用し、スクレイピングを繰り返し、培養フラスコに内皮細胞を含む溶液を追加します。 </li><li>もう一度、この最後のステップ（1.11）を繰り返します。 </li><li>培養物を配置し、37℃インキュベーター内で増殖培地℃、5％CO 2で角膜内皮細胞を含有するフラスコ。 </li><li> 2日後、培養培地を6 mlを加える。 </li><li>毎秒一日成長培地をリフレッシュします。 </li></ol> 2。細胞培養<ol><li>培地を取り出して、到達したコンフルエントアールの平衡塩類溶液、（アブー内で細胞を2回洗浄する分離後のtは10日）。 </li><li>それらをデタッチし、3〜4分間インキュベーター（37℃、5％CO 2）でフラスコを配置する細胞に1.5ミリリットルトリプシン溶液を加える。 </li><li>増殖培地12ミリリットルを追加します。細胞を分散させ、細胞をカウントするために内と外培地三回ピペット。 </li><li>シード細胞密度に応じて可変の端数を持つ細胞と培養器に入れます。 165,000細胞の細胞数（1cm 2当たりの細胞密度39286）を持つ2つのウェルチャンバースライドを（4.2 cm 2との面積を持つ）を準備します。 1cm 2当たり6,250の密度で新しい道を80 cm 2と培養フラスコを準備し、25ミリリットルの合計ボリュームに新鮮な培地を追加します。 </li><li> 2日ごとに培地をリフレッシュします。 </li><li>細胞層の密集度は、3〜4日後に到達する。実験のためにセルを使用。 </li><li>ときフラスコ内の細胞層の密集度に達している、2.6に手順2.1を繰り返します。通路2までの細胞培養物をfを用いることができるまたは実験。 </li></ol> 3。誘導カルシウムウェーブのために機械的刺激<ol><li>静かに振とうしながら10μMのFluo-4とチャンバースライドで細胞をロードするには、AMで37℃で30分間のためにリン酸緩衝生理食塩水。 </li><li>フルオ-4ソリューションAM削除、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を5回洗って、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をインキュベートし、測定前に室温で少なくとも5分間細胞を残す。 </li><li>アルゴンレーザーと使用ビームスプリッタHFT 488と488 nmで励起し、ロングパス発光フィルターLP 505を使用して530 nmで蛍光発光を収集するには、最低でもピンホールを設定します。油浸40X対物レンズ（エア、1.2 NA）を使用します。 ARL-67156を用いた実験では、10倍の対物レンズ（エア、0.3 NA）を使用します。 </li><li>細胞は共焦点顕微鏡に合流されているフィールドを検索します。 </li><li>それは位置チャンバースライドに対しては45°であり、細胞膜に触れるように、ピペットを。単一のセルに短い（≈1秒）機械的刺激を引き起こす。機械的な刺激が簡潔ですアンプを通して運営圧電結晶ナノポジショナに結合ガラスマイクロピペット（先端直径&lt;1μm）を持つ細胞膜の1％未満に触れることにより、細胞の急性、短期的な変形で構成されていますマイクロマニピュレータに取り付け。ガラスマイクロピペットは、微小電極プラーで作られています。ナノポジショナが機械的刺激の間に0.2〜1.5 Vの間の電圧によって運営されていることを確認してください。 1.5 V以上の電圧は、セルの損傷につながることができます。各セルタイプと条件については、細胞の損傷なし機械的刺激のための最適な電圧を慎重ハイ（1.5V）電圧（0.2 V）が低いから始まる一連の電圧を印加することによって決定されなければならない。この電圧が細胞膜に適用される機械的応力および歪みを決定するので、電圧は、刺激の力の尺度である。ザ機械的刺激の力は領域で機械的応力を掛けることによって算出することができる。領域（&lt;3.14ミクロン2）および機械的応力の両方が非常に低いので、機械的な刺激の力が低い。 （細胞が損傷したときに、セルとセルの外蛍光漏れが暗くなりますので注意してください。） </li><li>共焦点顕微鏡での[Ca 2 +] iの次の機械的な刺激の空間的な変化を測定する。 </li><li>画像を収集し、保管してください。 </li><li>共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して応答性の細胞（アクティブエリア、AA）の総表面積を定義するには、興味のある多角形領域を描画します。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、マイクロピペットを使用して、ローカライズされた、制御された機械的刺激を提供することにより、プライマリウシ角膜内皮細胞の単層の細胞内のCa 2 +波の伝播を測定するための簡単な方法を述べる。機械的に刺激された細胞では、細胞内のCa 2 +波伝播11,67を駆動する本質的な細胞内シグナル伝達分子である、どちらも細胞内のIP 3およびCa 2</sup...

細胞間のコミュニケーションとシグナリングは細胞外組織におけるアゴニスト及び全臓器レベル1,2に対応して生理学的プロセスの調整のために不可欠である。細胞間コミュニケーションの最も直接的な方法は、ギャップ結合の発生によって作成されます。ギャップ結合は、隣接するセル3,4（ 図1）の2コネキシン（Cxの）ヘミチャネルの頭に頭ドッキングによって形成されたタンパク性チャネルであるギャップ結合チャネルのプラークです。ギャップ結合は、隣接セル6（ 図2）の細胞内貯蔵から引き起こし、変調のCa 2 +放出のCa 2 +又はIP 3 5を含む1.5未満キロダルトンの分子量を有する小さなシグナル伝達分子の通過を可能にする。ギャップ結合チャネルはしっかりレドックス変形例のように、内および分子間相互作用によって、タンパク質と細胞内シグナル伝達プロセスによって規制されているとリン7。 GJSは、それによって化学的および電気的合胞体として作用し、接続されたセルの協調対応を容易にします。例えば、心房および心室筋細胞全体の心筋活動電位の広がりはCxに基づくGJチャネル85によって媒介される。 CXSはギャップ結合チャネルとしての役割を持っているだけでなく、対ヘミチャネルを形成することにより、定期的なイオンチャネル8-10（ 図1）と同様に膜におけるチャネルとして機能していない。ヘミチャネルは、イントラと細胞外環境との間のイオンとシグナル伝達分子の交換を制御することにより、隣接するセル間のパラクリンシグナリングに参加しています。 多くの細胞型（上皮細胞、骨芽細胞、星状細胞、内皮細胞などのような）及び器官（脳、肝臓、網膜、蝸牛および脈管構造等）において、細胞間のCa 2 +波多細胞応答の調整のための基本となる<suP&gt; 11。特定の細胞内Ca 2 +濃度の増加は、このセルに限定されるものではなく、それによって細胞内のCa 2 +波12,13を確立し 、周囲の隣接セルに伝達されない。これらの細胞内のCa 2 +波合胞体などの細胞層の正常な生理的調節のために重要であり、それらの調節不全は、病態生理学的プロセス11と関連している。角膜内皮および上皮では、私たち自身の25-33を含む異なるグループ14-24は 、細胞間コミュニケーションの仕組みや役割を学んだ。非興奮性細胞では、角膜内皮細胞のように、細胞間コミュニケーションの二つの異なるモードが28,29、すなわちギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間のコミュニケーションを発生する。ギャップ結合細胞間コミュニケーションは、ギャップジャンクション7 を介してシグナル伝達分子の直接交換を伴う。ギャップジャンクショ​​ンtional細胞間の通信は、細胞増殖を制御し、細胞外ストレス10,34,35に同期された応答を確立し、組織の恒常性を維持するために重要である。病状の数は、ギャップ結合の結合が不完全によりCXSに減少し、これによって細胞間のギャップ結合コミュニケーション36に影響を及ぼしている。これは、多細胞生物におけるギャップ結合細胞間コミュニケーションの重要性と影響力を強調している。それは、細胞外拡散性メッセンジャー（ 図2）の放出を伴うため、ギャップ結合細胞間の通信とは対照的に、傍分泌細胞間の通信は、細胞-細胞同格に依存しない。シグナル伝達分子の異なるタイプのシグナリング細胞によって細胞外空間に放出される。分子は、それが特定の受容体タンパク質によって検出される標的細胞に輸送される。その後、受容体シグナル複合体はどの細胞応答を誘導信号、不活化又は脱感作を除去することによって終了する。リリース脂溶性の細胞外シグナル伝達の使者は膜を貫通し、細胞内の受容体に作用。対照的に、親水性の使者が応答細胞の原形質膜を通過しないが、その後、細胞内環境への信号を中継する表面発現受容体タンパク質に結合するリガンドとして作用する。細胞表面受容体タンパク質の三大家族がこのプロセスに参加：イオンチャネル連結、酵素、およびGタンパク質結合した。解放メッセンジャー分子は、近接標的細胞（パラクリン）上、または循環系（内分泌）を必要とする遠隔標的細胞に、同一セル（自己分泌）の受容体に作用することができる。 角膜内皮28,29を含む多くの細胞型において、ATPは、細胞間のCa 2 +波37-40の伝播を駆動する主要な親水性、パラクリン要因の一つである。 DURる種々の薬剤による機械的変形、低酸素症、炎症または刺激ATPは44,45を膨潤せん断応力、伸張、又は浸透圧に応答して41-44健常細胞から放出させることができる。別のATP放出メカニズムは、同様に、小胞のエキソサイトー44、例えばATP結合カセット（ABC）トランスポーター、形質膜電位依存性アニオンチャネル46、P2X7受容チャネル47,48などのトランスポートメカニズムの過多を含む、仮定されている コネキシンのヘミチャネル49-52とpannexinのヘミチャネル43,49,53。細胞外ATPはADP、AMPに急速に加水分解されると細胞外環境に存在するectonucleotidasesで54,55をアデノシンができます。細胞外に放出されたATP及びその代謝ADP 56は拡散によって広がっていく。隣接するセルでプリン受容体とこれらのヌクレオチドのその後の相互作用は、pに関与している細胞内のCa 2 +波28,37,51のropagation。プリン受容体の二つの異なるクラスが存在している：両方のプリン（ATP、ADP）とピリミジン（UTP、UDP）ヌクレオチドが最もP2-57プリン受容体に作用しながら、アデノシンは、P1-プリン受容体の主要天然リガンドである。 細胞間のコミュニケーションは、スクレープ負荷、移染、IP 3およびCa 2 +、機械的刺激、 等のようなアゴニストのローカルアンケージングなどの異なる方法で調査することができる。ここでは、+波の伝播は、単一セルの機械的刺激によって誘発されるのCa 2の研究を説明します。機械的刺激によってのCa 2 +波伝播を研究することの利点は、時間をかけてのCa 2 +波の広がりを定量化する簡単なツールを提供し、それは定量的に細胞の異なる前処理とを比較可能にすることである。角膜内皮において、これらの細胞内のCa 2 +波共同を可能にする単層からコーディネートの応答は、ここに眼内手術中に細胞外の応力に耐えられるように内皮を助ける非再生角膜内皮の可能性の防御機構として機能しているか、免疫拒絶またはブドウ膜炎58,59間に炎症性メディエーターに暴露される。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

細胞間のコミュニケーションは、脳、肝臓、網膜、蝸牛と血管系を含む、臓器や組織の様々な細胞間の生理学的プロセスの調整のために不可欠です。実験的な設定では、細胞内のCa 2 +波単一セルに機械的刺激を印加することによって誘発することができる。これは、細胞内シグナル伝達分子のIP 3およびCa 2のリリースにつながる+隣接セルへの機械的刺激を受けた細胞から+波同心円状のCa 2の伝播を開始すること。細胞内のCa 2 +波の伝播を制御する主要な分子経路は、IP 3の直接転送を通って、ATPの放出を通じてヘミチャネルによってギャップ結合チャネルによって提供されます。プロパティと異なるコネキシンおよびギャップ結合チャネルとヘミチャネルとしてpannexinアイソフォームの規制の同定と特徴付けはquantificatioで許可されているnは細胞内のCa 2 +波は、siRNA、およびギャップ結合チャネルとヘミチャネルの阻害剤の使用の広がり。ここでは、結果として細胞内のCa 2細胞の急性、短期的な変形によって引き起こさ制御およびローカライズされた機械的刺激に応答しFluo4-AMでロードプライマリー角膜内皮細胞の単層で+波を測定するための方法を説明1μm未満の先端径を有するマイクロマニピュレータ制御されたガラスマイクロピペットで細胞膜に触れる。また、+波ATPの放出を通じて細胞内のCa 2のための駆動力としてCx43の-ヘミチャネルの活性を評価するためのモデル系として、一次ウシ角膜内皮細胞およびその使用の単離を記述している。最後に、我々は、使用、利点、制限およびギャップ結合チャネルとヘミチャネル研究の文脈におけるこの方法の選択肢を議論する。

すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行され、実証されているプロトコルは、KUルーベンの動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。 ウシ角膜内皮細胞（BCEC）で、機能的なギャップ結合を発現させ、ギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間通信の両方は、インタラクティブな方法で細胞間のコ?...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞間のCa<sup&gt; 2 +</sup&gt;波は、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルによって駆動される。ここでは、細胞間のCaを測定するための方法を説明<sup&gt; 2 +</supローカル単細胞機械的刺激とプロパティとギャップ結合チャネルとヘミチャネルの規制を調査するために、そのアプリケーションに応じて、細胞単層で&gt;波。

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K ビュー.  KU Leuven. 細胞間のCa 2 +波は、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルによって駆動される。ここでは、細胞間のCaを測定するための方法を説明 2 +波。

ビデオ: Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

生物学

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...