このビデオの目的は、操作された線維芽細胞増殖因子1によって刺激された、治癒を加速したデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデルを説明することです。フックス内皮角膜ジストロフィー(FECD)は、角膜内皮細胞におけるポンプ機能の喪失およびデスメ膜の表面上のコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスタンパク質の過剰な蓄積を特徴とする疾患であり、角膜腸を形成する。FECDの唯一の既知の治療法は、様々な形態の内皮角膜形成術であり、そのすべてが拒絶反応および内皮細胞喪失のリスクを伴う。
眼科手術の進歩により、これらの手順は時間の経過とともに侵襲性が低くなりましたが、移植のいかなる形態にも拒絶のリスクと生涯ステロイド使用の可能性が伴います。デスメのストリッピングオンリー(DSO)は、角膜の中心に局在するガッタを有するFECD患者が、移植片置換なしにデスメ膜の中央4ミリメートル円を除去する実験的代替手段である。ガッタエの除去は、健康な末梢細胞が内方に移動し、内皮単層を改革することを奨励し、最終的に間質浮腫を逆転させ、視力を改善する。
この方法には多くの利点がありますが、治癒プロセスは長く一貫性がなく、手術の翌月に治癒が見られない場合、救助移植を必要とする患者もいます。DSO後のより速い創傷治癒を刺激する治療は、FECD患者にとって手順をより実現可能な選択肢にし得る。このプロトコルは、DSO後の創傷治癒を改善するための治療法を試験し、DSOをFECD患者にとってより実現可能な選択肢にすることを目標に、ヒトドナー角膜を用いた臓器培養形式で臨床DSO手順をモデル化する。
私たちの研究室では、このモデルを使用して、操作された線維芽細胞増殖因子で治療された角膜の創傷治癒をテストし、このビデオの後半で代表的な結果を紹介します。手順のこの部分では、生検パンチを使用して、デスメの膜が剥がされる4ミリメートルの創傷領域をマークする。滅菌鉗子を使用して、培地から角膜を除去し、1X PBSですすぎ、残留培地および細胞破片を除去する。
すすぎ後、角膜内皮側をペトリ皿のふたの上に置きます。新しい4ミリメートルの生検パンチを溶接皿のトリパンブルーに浸し、過剰をタップします。両手でパンチを角膜の中心の上に置き、内皮表面にまっすぐ下に下げ、最小限の圧力をかけます。
角膜の位置や圧力を変えずにパンチを片手にずらし、新しく空いた手で鉗子に手を伸ばします。鉗子を使用して角膜を所定の位置に保持し、生検パンチを約90度前後に数回静かにねじります。生検パンチを角膜からまっすぐ持ち上げて脇に置きます。
1X PBSでもう一度すすぎ、余分なトリパンブルーを除去します。ペトリ皿のふたの角膜を解剖スコープに移す。湾曲した鉗子で角膜を所定の位置に保持し、生検パンチによって残されたトリパンブルーのリングに沿って鋭い30ゲージ針の先端を軽く引きずることによってデスメの膜をスコアする。
基礎となる間質を混乱させないように最小限の圧力を使用してください。シンスキーフックでは、穏やかなすくい上げの動きを使用して、傷口の周りのデスメの膜を持ち上げて剥がします。病変の中心に向かって働く。
デスメの膜は、ほとんど抵抗を思いつくべきではありません。あなたが困難を経験しているなら、あなたはおそらく間質を引き上げているでしょう。このような場合は、傷口に沿って新しい点から持ち上げて、もう一度やり直してください。
デスメの膜の大部分が間質から分離されたら、ゴロヴォイ鉗子を使用して膜を取り除き、脇に置いておきます。剥ぎ取られた部分に膜の残りの部分がないか調べ、ゴロボイ鉗子で取り除きます。デスメのストリッピングに続いて、角膜をトリパンブルーで染色し、創傷領域を視覚化する。
0.01%の塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含む1X PBSで角膜をすすぎ、トリパンブルーと相互作用する可能性のある細胞破片を除去し、残りのCECの無傷のデスメ膜への強固な接着を促進します。角膜を溶接皿に入れ、30マイクロリットルのトリパンブルーを内皮層上に30秒間ピペットで置く。鉗子を使用して角膜を静かに揺らし、内皮表面全体が覆われていることを確認します。
PDS中の過剰なトリパンブルーをカルシウムおよびマグネシウムで洗い流し、染色された角膜を解剖顕微鏡下でゼロ時点の日について画像化する。この手順が完了した後、下記列挙成分からなる低血清培地を含む6ウェルプレートで角膜を培養した。左角膜を8ミルの低血清培地単独で培養し、右角膜を操作されたFGF-1または他の所望の試験処置を添加した低血清培地で培養する。
角膜を摂氏37度で6%CO2で14日間インキュベートし、毎日の培地交換を行います。トリパン染色手順を3日目、6日目、9日目、12日目、14日目に繰り返し、染色直後の各角膜を画像化した。すべてのポイントでカメラ設定の一貫性を保つようにしてください。
培養期間に続いて、さらなる染色を、研究関心に基づいて、特に実験に基づいて角膜に対して行うことができる。私たちの研究室の研究関心に関連するその他の染色には、アリザリン染色、EDU取り込みのための蛍光染色、ZO-1タイトジャンクションタンパク質などがあります。アリザリン染色は、細胞境界を可視化し、トリパン染色結果を確認し、治癒領域の細胞形態を可視化するために行われる。
ZO-1免疫蛍光染色は、治癒領域内および治癒領域周辺で特に関心のあるCEC間のタイトジャンクション形成の可視化を可能にする。EdU標識は、増殖が治癒に寄与することを確認するための定性的尺度として行われ、また、いくつかの文脈において増殖細胞を定量するために使用することができる。これらの特定の染色手順を実行する方法に関するより詳細な手順は、このビデオに対応する記事に含まれています。
以下は、操作されたFGF-1の有無にかかわらず14日間にわたってインキュベートされたアイバンクによってジストロフィー性と判定された一対の角膜の代表的な画像である。画像に見られるように、操作されたFGF-1処理角膜は、未処理の対照角膜と比較して治癒の加速を示した。培養期間の終了時のさらなるアリザリン染色は、細胞境界を描写するのに役立ち、そしてこれらの知見で確認した。
この観察結果を11対のジストロフィー性角膜にわたって複製し、臨床DSO手順に最も関連性の高い角膜のサンプルでモデルを検証した。ImageJなどの画像処理ソフトウェアは、ここで見られるように、これらの画像内の染色領域を測定し、創傷治癒の進行を定量化するために使用することができる。操作されたFGF-1で処置されたすべてのジストロフィー性角膜は、対照角膜の38%とは対照的に、未処置の仲間と比較して、14日目に大きな治癒を示した。
そして、この差は統計的に有意であった。共焦点画像化によって視覚化されたさらなる免疫組織化学は、以前のアリザリン染色パターンを反映した、ZO−1タイトジャンクションタンパク質の半組織化発現を明らかにした。EDU標識は、創傷領域内および創傷領域周辺における増殖細胞の存在を確認し、未処理対照と比較して、処理された角膜においてより高いレベルで観察された。
いくつかの角膜対では、CEC死は、特にジストロフィー性角膜において、創傷領域の末梢に見えることがある。以下は、実質的な末梢細胞死を示すトリパン染色角膜の例の画像である。画像に見られるように、末梢細胞死は主に以前の時点で起こり、培養期間にわたって徐々に逆転する。
この末梢染色は、創傷領域縁部の位置を確認することが困難であり得るので、創傷に接続するときの創傷領域の定量を複雑にする可能性がある。しかしながら、全ての場合において、末梢トリパン染色は、最終日14時点において測定可能な画像を生成するのに十分にクリアされた。この現象は、生体外で培養したドナー角膜に特有のものであり、生体内のヒト角膜には関係ないと考えています。
末梢内皮への損傷は、我々の知る限りDSOのいかなる臨床症例研究においても報告されていない。と呼ばれる第2の染色パターンは、遠周染色、アリザリンレッド画像で撮影されたが、培養期間を通してトリパンブルー画像でも明らかであった。この観察は、侵害された内皮を示す辺縁の周りの暗い染色のリングによって特徴付けられる。
この用語にもかかわらず、このパターンは正常角膜およびジストロフィー角膜の両方で非常に一般的であったため、末梢染色に対して陽性としてカウントされなかった。このプロトコルにより、デスメのストリッピング後に操作されたFGF-1で処理された培養角膜における治癒転帰の改善を実証することができました。さらに、このストリッピングプロトコルは、DSOを研究する他の研究者にとって貴重な方法として役立ち、他の創傷治癒療法の試験、外科的技術への修正の評価、および異なるドナー集団または疾患の段階にわたる治癒の比較を含む、幅広い用途に利用することができる。
この研究と、このプロトコルを用いた他の研究が、臨床医が将来、適格なFECD患者にとって貴重な治療選択肢としてDSOを検討することを奨励することを願っています。
