この作品は、アメリカ心臓協会GRAの春09ポストドクトラルフェローシップ（09POST2250268）およびNIH R01 CA097465によって部分的にサポートされています。我々は非常に腫瘍移植の彼女の援助のために博士ウェン李博士とヴィカスGulaniのMRIプロトコル·テストとセットアップのため、氏とイヴォンヌ·パーカーを高く評価しています。

プロトコルは、以前の研究11から適応。 1。 CLT1ペプチドにのGd-DOTAの結合体<ol><li>標準固相ペプチド合成を使用して、2 - クロロトリチルクロリド樹脂上のFmoc-保護アミノ酸（1.0ミリモル）からCLT1ペプチド（CGLIIQKNEC）を合成する。 </li><li>最後のアミノ酸を添加した後、2時間0℃でDMF中のタリウム（III）トリフルオロ酢酸塩（1​​.09g、2.0ミリモル、2当量）を用いて樹脂上の線状ペプチド（20ml）に環化する。 </li><li>次に、コンジュゲートPEGおよびFmoc-NH-PEG-COOH（3.0ミリモル）のFmoc-Lysのカルボニル（Fmoc）-OH（3.0ミリモル）で連続的に反応させることにより、樹脂上CLT1ペプチド（1.0ミリモル）のN末端へのリジンを順次、およびFmoc-Lysのカルボニル（Fmoc）-OH（6）の第二バッチ。 </li><li>ピペリジンでのFmocを除去します。 2時間、樹脂上のリシンデンドリマーから4本の遊離アミンと反応するDOTA-トリス（Buはt-ブチル）（4.58g、8.0ミリモル、各アミノ基に2当量）を添加する。 </li><li>最後に、生成物を切断し、脱保護樹脂からの室温で8時間、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソブチル（TIS）（20ミリリットル、95/2.5/2.5）のカクテルで処理することによって。トリフルオロ酢酸（TFA）で洗浄した濾過により樹脂を除去。合わせたろ液は、遠心分離器、冷たいエチルエーテル（200ミリリットル）に滴下追加し、エチルエーテル4Xで洗浄する。無色の固体（1.99g、61％収率）を得、真空下で乾燥させる。 </li><li> 10分間の溶媒Aで20分間、40〜90％溶媒Bのための溶媒A（0.1％TFA水溶液）中アセトニトリル（0.1％TFA）〜40％溶媒Bの勾配を使用する分取HPLCで粗生成物を精製し。 </li><li>溶解DI水中CLT1-DL-（DOTA）4（250mgを、0.077ミリモル）（15ml）および1 M NaOHを用いてpHを6に調整する。 1 M NaOHを用いてpHを6に維持しながら、溶液に少しずつのGd（OAcでの）3·H 2 O（472ミリグラム、0.462ミリモル、DOTAモノアミドに1.5当量）を添加する。 48時間RTで反応液を撹拌した。 </li><li> Eとの複合体の残存のGd（III）thylenediaminetetraacetic酢酸（EDTA）（90mg、0.31ミリモル）、及び最終製品CLT1-DL-（のGd-DOTA）4（169mg、57％）を得サイズ排除カラムで粗生成物を精製する。 </li></ol> 2。造影剤の特性評価<ol><li>誘導結合プラズマ発光分光分析とのGd（III）の含有量を測定する。 </li><li>マトリックスとして2,5 - ジヒドロキシ安息香酸（2,5-DHB）を用いて線形モードで、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量スペクトルを取得する。 </li><li>緩和計with CLT1-デシリットル-（のGd DOTA）4コントラスト剤および非標的制御エージェント60メガヘルツ（1.5 T）少なくとも異なる濃度sCLT1-デシリットル-（のGd DOTA）4水溶液緩和時間を測定37℃で、 T 2を測定するために、500のエコーとT 1とハーンメイブーム-ギルシーケンスを測定するために、反転回復パルスシーケンスを使用しています。 T 1とTを目の2緩和を計算するGdの濃度対1 / T 1および1 / T 2のプロットの傾きから電子剤。 </li></ol> 3。同所PC3前立腺腫瘍を持つ動物モデルの細胞培養および開発<ol><li> /μlのPBS 2.5×10 4細胞の密度で、5％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン、トリプシン処理によって収穫し、再懸濁を補充したRPMI培地中で緑色蛍光タンパク質（GFP）の構成的発現を有する培養PC3前立腺癌細胞。 </li><li> CWRU機関動物実験委員会によって承認された動物プロトコルに従って胸腺欠損動物基盤施設の雄のNIH胸腺ヌードマウス（4-5週齢）、ケースウエスタンリザーブ大学（CWRU）を維持する。 </li><li>外科用表面は、2％クロルヘキシジン溶液を噴霧し、次いで、吸収性ドレープで覆った。無菌手術用手袋は、手術中に着用された。動物の手術前に、IPはanesthetizにアベルチン（250 mg / kgの）を注入マウスを電子。代替的に、ケタミン/キシラジン/アセプロマジンで50/5/1 mg / kgの濃度で使用することができる。眼軟膏は、麻酔中に十分な水分を維持するために、マウスに適用した。 </li><li>滅菌メスを使用して約1cmの長さで下正中線に沿って皮膚や腹膜を通して小さな切開を切断することにより、手術を開始します。無菌手術用ドレープは、生存の手術の際に切開部位を中心に覆われていた。 </li><li>優しく前立腺を露出させ、前立腺背側葉を体外にして安定させる。 30ゲージの針を用いて前立腺にPBS（20μL）で、PC3-GFP細胞の懸濁液を注入する。最終的に創傷オートクリップ12で切開を閉じます。 </li><li>後手順の監視については、1週間1日2回、動物を監視します。病気の兆候は食べるの欠如、尿道の周りの濃い尿の収集、およびステープルで膀胱の感染症や閉塞を示している可能性が不安定歩行が含まれています。 </li><li> 10日後、Tを削除彼は、ステープルステープルリムーバーを使用して。腫瘍サイズおよび体重減少、行動偏差、モータ欠陥などの疼痛の証拠を評価するために動物を毎日監視する。腫瘍増殖の際の痛みの倫理的に許容限度又は証拠を超える腫瘍サイズを示した動物を安楽死させる。 </li></ol> 4。蛍光イメージングおよび組織学を有するペプチドの結合特異性腫瘍の確認<ol><li>腫瘍細胞接種の後、腫瘍増殖の約4週間撮像始まる前に可能にする。ペプチドプローブの注射の前に、腫瘍の存在を確認するために、蛍光イメージャー上の生きたマウスでGFP蛍光画像を取得する。 </li><li> IVは、テキサスレッドが10ナノモル/マウスの用量で腫瘍を有するマウスにペプチドをラベル注入する。 </li><li>頸椎脱臼により2時間後にマウスを犠牲に、腫瘍および主要な器官を収集し、すぐに蛍光イメージャー上の画像。 44：GFP（励起用の緑色光フィルタを使用する4から490ナノメートル、放出：515 nmのロングパスフィルタ、取得設定：テキサスレッドための10 nmのステップで500から720）と赤色光フィルター（励起：576から621ナノメートル;放射：635nmのロングパスフィルタ;買収設定：10 nmのステップで630から800）。 GFP及びテキサスレッド、150ミリ秒10ミリ秒の露光時間。 </li><li>すぐに全体の組織蛍光を測定した後、腫瘍組織を収集し、ホルマリンで固定し、凍結切片5μmのスライスに。 </li><li> PBSですすいだ後、直ちに、共焦点レーザー走査顕微鏡に4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を含有する封入剤1滴、画像にマウントする。 </li></ol> 5。磁気共鳴イメージング（MRI） <ol><li>腫瘍細胞接種後約4週間は、腫瘍の直径が0.3〜0.6センチメートルまで成長することができます。 MRIの研究のためのボリュームの無線周波数（RF）コイルが7 T MRIスキャナを使用してください。 </li><li>イソフルラン誘導チャンバ内の2％イソフルランと酸素の混合物で、マウスを麻酔。 OPHthalmic軟膏は、麻酔中に十分な水分を維持するために、マウスに適用した。 </li><li>ヘパリン処理した生理食塩水で満たされた1.0メートルの長いチューブに30ゲージの針を挿入します。マウス尾静脈に自作のカテーテルを配置します。 </li><li>磁石にマウスを置き、ノーズ​​コーンを経由して1.5％イソフルランと酸素と吸入麻酔下に保つ。 </li><li>呼吸の速度と深さを監視するための腹部に監視システムに接続され、呼吸センサーを配置します。フィードバック制御システムを介して磁石に熱風を吹き込んで、37℃で体温を維持する。 </li><li>腫瘍の位置（TR / TE = 200/3.7ミリ秒、FOV = 3.0センチメートル、スライス厚= 2.2ミリメートル、2 =平均スライス数= 16、フリップ角度= 45°を識別するために局在化配列を用いてサジタル断面画像で始まるマトリックス= 128×128）。 </li><li> CE-MRI（TR / TE = 151.2/1.9ミリ秒、FOV = 3.0センチ×3.0センチメートル、用2Dアキシャル画像を取得するために2次元T1強調勾配脂肪抑制シーケンスを使用して、Sシラミ厚さ= 1.2ミリメートル、スライス番号= 12、平均= 1、フリップ角= 80°、マトリックス= 128×128）。 </li><li>注入前のベースラインMR画像の取得後に、生理食塩水200μlでフラッシュすることにより0.03ミリモルのGd / kgの用量で標的化剤または抑制剤を注入し始める。 </li><li>最大30分間、異なる時点でCE-MRI画像を取得し続ける。 </li></ol> 6。画像処理と解析<ol><li>画像解析のためのイメージングソフトウェアを使用してください。 </li><li> 2次元の撮像面に全腫瘍の上の関心領域（ROI）と腎臓を引き出し、平均信号強度を測定する。 </li><li> （S 0 - ΔSNR=（S トン/σt）は ：CE-MRIデータを定量化するために、以下の式を用いて造影前SNRオーバー造影後SNRの増加を計算することによって、腫瘍または腎臓コントラスト強調（ΔSNR）を測定/σ0）、S 0、SはTタムの信号を表す場合、またはまたはコントラスト前と後の腎臓、σ0、σtは 、コントラストの前後背景空気から測定されたノイズの標準偏差である。 </li><li> 、p &lt;0.05で統計的有意性を仮定し、スチューデントの両側t検定を用いてp値を計算する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, M. A., Semelka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MRI Basic Principles and Applications. , (2003).</li><li>Artemov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+magnetic+resonance+imaging+with+targeted+contrast+agents.">Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents.</a> J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).</li><li>Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+molecular+weight+folate+receptor+targeted+contrast+agent+for+magnetic+resonance+tumor+imaging.">A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging.</a> Mol. 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J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+new+MRI+contrast+agent+prepared+from+polypropyleneimine+dendrimers,+generation+2.">Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2.</a> Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).</li><li>Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+matrix+metalloproteinases:+experimental+molecular+MR+imaging+in+vivo.">Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo.</a> Radiology. 251, 429-438 (2009).</li><li>Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP-2104R:+a+fibrin-specific+gadolinium-Based+MRI+contrast+agent+for+detection+of+thrombus.">EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).</li><li>Pilch, J., Brown, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+selected+for+binding+to+clotted+plasma+accumulate+in+tumor+stroma+and+wounds.">Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).</li><li>Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+magnetic+properties+of+MRI+contrast+media+solutions+at+different+magnetic+field+strengths.">Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths.</a> Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).</li><li>Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+peptide+targeted+small+molecular+Gd-DOTA+monoamide+conjugate+for+MR+molecular+imaging+of+prostate+cancer.">Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer.</a> Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).</li><li>Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+diagnostic+of+glioblastomas:+detection+of+an+extracellular+fragment+of+protein+tyrosine+phosphatase+mu.">A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu.</a> Neoplasia. 12, 305-316 (2010).</li><li>McBride, J. 	. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resin-coupled+cyclic+peptides+as+proteinase+inhibitors.">Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors.</a> Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).</li><li>Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+method+for+facile+intramolecular+disulfide+formation+in+synthetic+peptides.">General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

重要なステップ 適切なバイオマーカーの選択と小ペプチドをターゲットに 正常に小さいサイズを有する標的化造影剤を開発するために、2つの重要な点を考慮する必要がある。第一に、正常組織にはほとんど存在感のある病変組織に豊富に存在する適切な分子バイオマーカーを選択することが重要である。私たちの選択された癌関連バイオ...

癌に関連する分子標的の有効撮像は、以前の癌の検出および診断の精度を向上させるために非常に重要である。磁気共鳴イメージング（MRI）は、高空間分解能なし電離放射線1を備えた強力な臨床イメージング様式である。ただし、対象となる造影剤は、臨床MRがん分子イメージングのため利用できません。目標とMRI造影剤の革新的なデザインと開発は大幅にMRがん分子イメージングの応用を進めるだろう。かなりの努力が、癌細胞の表面に発現されるバイオマーカーのMRイメージングのための標的造影剤の開発がなされてきた。によるMRI及びこれらのバイオマーカーの低濃度の比較的低い感度のために、小さな分子標的造影剤2,3を用いた効果的なMR分子イメージングのための十分なコントラスト強調を生成することが課題である。十分な増強を得るために、種々の送達系の成功常磁性のGd（III）キレートの高いペイロードを有するリポソーム、ナノ粒子及びポリマー結合体としてのhは、標的部位での4,5造影剤の局所濃度を増加させるために調製されている。これらの送達システムは、動物モデルにおいて有意な腫瘍増強を生成することができたが、それらの大きなサイズは、重大な安全上の懸念6原因となり、毒性のGd（III）イオンの長期蓄積をもたらす、身体からゆっくりと不完全な除去をもたらした。最近、いくつかの研究は、分子イメージングのためのMRIの限界が高い局所病変において発現と適切な分子バイオマーカーを選択し、容易に7,8排泄することができる小分子薬剤を使用することによって克服することができることを示している。これらの薬剤の重要な特徴は、正常組織にはほとんど存在感のある病変組織に豊富に存在する分子マーカーを標的としていることである。造影剤の高い濃度が十分に得られ、これらの標的に結合することができる効果的なMR分子イメージングのための効率の良いコントラスト強調。それらのサイズは腎臓濾過閾値よりも小さいので、結合していない造影剤は、容易に縮小背景ノイズが体内から排出することができる。私たちは、豊富に腫瘍間質に存在する凝固血漿タンパク質を、普遍的な癌関連バイオマーカーを選択し、まれに正常組織9に存在していない。我々は、強力なPC3前立腺腫瘍モデル10への特異的結合、および4つのGd-DOTAモノアミドキレートを示し、小さな標的化ペプチドCGLIIQKNEC（CLT1）を含む標的化造影剤を合成した。ここでは、マウスにおいて腫瘍を検出するためのMR癌分子イメージングのための方法を提供する。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fmoc protected amino acids</td>
			<td>EMD Chemicals Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DOTA-tris(t-Bu)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PyBOP, HOBt, HBTU</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Texas Red, succinimidyl ester, single isomer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T20175</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agilent 1100 HPLC system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ICP-OES Optima 3100XL</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>AutoflexTM Speed</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maestro FLEX In Vivo Imaging System</td>
			<td>Cambridge Research &amp; Instrumentation, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biospec 7T MRI scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

mr molecular imaging of prostate cancer with a small molecular clt1 peptide targeted contrast agent

腫瘍細胞外マトリックス分子イメージングは​​、癌のバイオマーカーとして使用することができる癌関連タンパク質の存在量を有する。本研究では、腫瘍間質内凝固した血漿タンパク質に特有の標的MRI造影剤としてのGd-DOTAモノアミド複合体の標的小分子のペプチドを用いた効果的なのMRがん分子イメージングを示した。我々は、マウス同所性PC-3前立腺癌モデルにおけるMRIによる前立腺腫瘍の非侵襲的検出のための薬剤の有効性を評価する実験を行った。標的化造影剤は、0.03ミリモルのGd / kgの低用量で有意な腫瘍コントラスト強調を生成するのに有効であった。ペプチド標的化MRI造影剤は、前立腺腫瘍のMR分子イメージングのために有望である。

図1は、標的化造影剤CLT1-DL-（のGd-DOTA）4、実験の全体的なスキームの合成を示す。 CLT1-DL-（GD-DOTA）4臨床のGd-DOTA（表1）よりもはるかに高い緩和度を示しています。 1.5 Tで、PBS（pH7.4）中CLT1-DL-（のGd-DOTA）4のガドリニウム当たりのT 1緩和度のGd-DOTA 10のそれよりも約3倍高い。マエストロイメージングは、非特異的ペプチド（sCLT1-TR）をスク?...

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MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

マウス前立腺癌モデルにおける腫瘍間質内の凝固した血漿タンパク質に特異的な小ペプチド標的化MRI造影剤を用いてMR癌の分子イメージングを実証した。

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

mr-molecular-imaging-prostate-cancer-with-small-molecular-clt1

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K ビュー.  Case Western Reserve University. マウス前立腺癌モデルにおける腫瘍間質内の凝固した血漿タンパク質に特異的な小ペプチド標的化MRI造影剤を用いてMR癌の分子イメージングを実証した。 