我々は技術的なアドバイスと支援のために-20 Montojo、J·レイエス、とM.アーマーに感謝します。この作品は、（DALに）F31 NS063550を許可米国国立衛生研究所によって（SB）にKlingenstein基金とNARSADからバジルオコナースターター学者賞、助成金をサポートされていました。 SBは医学研究のWMケック識別若い学者で。

動物に使用標準ケアと使用するプロトコルのための制度的動物実験委員会の認可を受けなければならない。現在のプロトコルは、前述したように、5.5から10週齢の大人のC57BL6 / Jマウスに焦点照射研究のために開発された（ 図2）2。しかし、他の年齢や小さな動物種（ラット、ハムスター、ジリスなど ） を用いることもできるが、有効な麻酔プロトコルおよび関心領域（ROI）の同定を可能にする放射線基準アトラスが利用可能であることを条件とする。 1。 CTガイド下放射線プラットフォームのキャリブレーション使用されるX線管フィルタの各コリメータのサイズと種類を事前に放射線プラットフォーム上で放射線量のためのフィルムベースのキャリブレーションを実行します。放射線用量計画ソフトウェア49を使用してご利用でき、所望の標的部位でのアーク照射ビームを標的化するために放射線量に基づいて、必要な配信時間を計算するために、ほとんどの市販の放射線プラットフォームで電子、マウスのCTスキャン、ロボットプラットフォームの回転速度に基づいて、関心領域（ROI）の深さが、これについての詳細が省略されているこのプロトコルは、それらが放射プラットフォーム間で異なるように。 CT撮影で腹側視床下部2（ 図3）可視化の目的のためには1mmのAl濾過と0.4 mmの焦点スポット100のkVpのビームエネルギーでX線管を動作させる。 HPZの焦点照射には、治療上の0.6cmの組織深さでの放射線10Gyのを提供するために、225のkVp、13ミリアンペアでのX線管、および0.15ミリメートルのCuのろ過と1 mmの焦点スポットを運営4.6分の時間。異なるROI間標的にすることは様々なパラメータを計算することが必要になります。 <ol><li>以前に2を説明したように正中隆起内の神経発生に高脂肪食の影響を研究した場合は、4週齢の雌C57Bを取得ジャクソンマウスの実験室からL6 / Jマウス、およびケージ当たりの家4匹のマウス。 5週齢の高脂肪食への通常の固形飼料から食品に切り替える。マウスは新しい住宅や食品に順応することができます。 5.5週齢でCFIR処理を行う。放射線のプラットフォームが含まれている手術室への搬送対象。転送中のストレスレベルを最小限に抑えます。イソフルランガス麻酔室を準備します。その後、チャンバー内に一匹のマウスを追加します。並行して、後の処理のために加熱パッド（低設定）を準備する。 </li><li>マウスが下にあり、もはやフットパッドの圧縮に対応したら、ロボットステージの固定ベッドで放射線プラットフォームと場所に主題を持っていません。一口ガード（ 図1D）にノーズコーン麻酔カップに被験者の口を配置し、歯。固定ベッドの上で平らにマウスを置くと、それが無反応性を維持し続けているかどうかを確認。もしそうであれば、ガーゼテープでベッドにマウスを下にテープで固定します。ベッドにマウスを下にテーピングしながら、、ヘッドが水平面に平らにされていることを確認。これは、耳を引き上げ、それらが平準化されている場合を見ることによって決定することができる。マウスが正しい位置にあると、リード保護シールドを閉じます。 </li><li>マウス、被写体の3次元解剖学的構造上のスキャンを提供し、実験者の放射線プラットフォームのオンボードソフトウェアを使用して、コンピュータ断層撮影（これはプラットフォーム間で異なります）を取得。マウスヘッドが水平面に平らにされているかどうかを確認してください。被験者の頭部が平準化されるまで、1.3 - そうでない場合は、手順1.2を繰り返します。 </li><li> CT画像でROIを特定します。 図3Eに示すように、水平面に対して45°の角度を用いて頭蓋骨の表面にROIからの距離を算出する。 </li><li>オンボードソフトウェアを用いて、 図4Aに示すように、上方からのマウス被写体のX線を取る。次に、放射線プラットフォームからマウスを削除し、加熱パッド上に置かれ、アクティブになるまで監視します。 </li><li>冠状CT画像から、送達用量を決定するために、少なくとも3匹のマウスの平均ROI解剖深さを計算する。照射10Gyのは腹側視床下部に投与した以前の研究2からの例として、（45°の角度から）頭蓋骨からROIの深さが0.66センチメートル（ 図3Eを参照）。それを知って、研究者は、ROIに所望の投薬量を達成するために、治療の適切な回転数と長さを計算するために、それらの放射線プラットフォームにインストール用量計画ソフトウェア（DPS）を使用した。 </li><li>用量計画ソフトウェアで処理期間とロボットステージの回転速度を決定した後、水等価プラスチックモックマウスモデルに埋め込まGAFchromic感放射線性フィルムと計算されたパラメータの線量分布を測定する。これを行うには、4垂直に積み重ね水等価プラスチックブロック29などの間で3 GAFchromic放射線感応膜を埋め込 ​​む図4Bに示す。 </li><li>ロボットステージ上GAFchromicフィルムを含む模擬マウスモデルを配置し、新たに計算されたパラメータを使用して焦点照射ビームを実行します。例えば、腹側視床下部、入力を対象とする0.15ミリメートルの銅フィルター、225のkVpのパラメータ、ROIを達成するための13ミリアンペア、1 mmの直径の放射ビームの設定、45°のガントリ角度、1.3°/秒の回転、および4.6分10 Gyの放射線の線量。 </li><li>照射後、放射線量のパターンと強度のための映画をチェックしてください。腹側視床下部をターゲットにリストされたパラメータを持つ360度の角度の回転、アイソセンター上のフィルム中の暗いリング、アイソセンターフィルムに小さな鮮明なスポットと、コーンに対応するアイソセンター下のフィルムが軽くリング用照射ビームの投与は、（ 図4B）が観察される。 </li><li>パラメータはCALそのうちからマウス被験者のX線を介してアイソセンターGAFchromicフィルムを重ね合わculated。 図4Cに示すように、アイソセンタにおける照射の焦点は、所望のROI領域と重なるべきである。 </li></ol>別の方法：脳のROIをターゲットにすることが困難が解消されない場合は、ヨード造影はCT画像の下に脳室の可視化を強化するために髄腔内注射し使用しています。簡潔にするために、この手順は、このプロトコルのうち残っている、これまで35、50に記載されている。ヨード造影は、追加の心室のランドマーク（ 図5A）を提供します。 2。照射ビームの精度を決定するさらなる組織2、35、51における放射ビームの直接可視化によってCFIRビーム精度を確認。これを行うには、γH2AX51、ヒストンタンパク質とDNA二本鎖切断の早期マーカーを検出するための免疫組織化学を行う。マウスの被験者は、経心的に灌流し、照射後1時間以内に修正する必要があります。次irradiΥH2AxのATION、DNA修復急速に続いて起こる、とのレベルは35著しく低下。 <ol><li> 1.3 - を繰り返して、1.1を繰り返します。 </li><li>ターゲットは、CT上で確認された後、マウスの被写体が放射線照射ビームで、この目標を整列するロボット制御の下で移動される。入力は、用量計画ソフトウェアへのステップ1.6からパラメータ（所望の投与量を達成するための治療の回転速度と長さ）を計算し、治療を開始。治療はガントリと共に配信されたマウスは、垂直配向軸を中心に回転しながら垂直から45°まで指摘した。 </li><li>照射後、マウスのテーマについて腔的灌流を行う。 1時間52以内に灌流を行う。灌流後、浸漬を4％PFA / PBSに脳を固定し、ゆっくりと4℃で一晩揺する</li><li>翌朝は、パラホルムアルデヒド固定液を除去して、PBSで3回に5分を洗う。その後、4℃でロッカー上1X PBS中30％スクロース中に浸す</li><li>静かに4℃（私たちにロックually 12〜16時間）、脳はチューブの底に沈むまで。これは凍結保護ステップとして機能します。脳が沈むと、余分な30パーセントのsucrose/1x PBS転送を防止するための穴あきスプーンで脳を削除します。すぐにドライアイス上で凍結培地に埋め込む。ピペットチップで凍結培地を旋回し、プラスチック金型内で脳の位置を合わせます。 </li><li>一度完全に凍結、保存するときは-20℃の冷凍庫に脳のブロックを転送。 </li><li>免疫組織が実行される日には、セクションでは、冠状に40μmの厚さで、細い絵筆でPBSを含む24ウェルプレートに浮かんでいる。切片は、標的領域の照射範囲を決定するために免疫染色の正しいシリアル順序に保たれるべきである。 </li><li>抗原回復工程の準備のために水浴中で80℃に予熱し0.01 Mクエン酸ナトリウム溶液。同時にながらクエン酸ナトリウム、0.01 M PBSで3×5分間の洗浄を行い、加温されている。 </li><li>クエン酸ナトリウム溶液を80℃になったら、脳切片を水没iをnはクエン酸ナトリウム緩衝液。 1時間80℃の水浴中のままにしておきます。 </li><li>部を除去し、クエン酸ナトリウム溶液が室温に到達できるように、次いで0.01 M PBS中で3〜5分間の洗浄を行う。 </li><li> 5％正常ヤギ血清を含むPBS-トリトン中で1時間、脳切片をブロックします。 </li><li> 4℃でマウス抗ホスホ-H2AX一次抗体の1:700濃度の5％正常ヤギ血清を含むPBS-トリトンで一晩脳切片をインキュベート</li><li>次の日、15分間の洗浄を0.01MのPBS-トリトンで3倍行う。 </li><li> PBS-トリトンで2時間1:500濃度で488nmのフルオロフォアとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体とともに5％正常ヤギ血清を含有する脳切片をインキュベートする。 </li><li> 15分間の洗浄を0.01M PBS-トリトンで3倍を実行します。 </li><li>核を可視化するために10分間、4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）染色（PBS中1:5,000）を行う。その後、PBSで5分間、脳切片を洗浄する。 </li><li>静電気的にCHのマウントarged顕微鏡は、PBS中の浮遊手段によりスライドさせる。過剰のPBSをふき取り、スライドを乾燥させる。封入剤を使用してスライドをカバーガラスとスライドを室温で一晩、暗所で乾燥させます。 </li><li>蛍光顕微鏡で連続冠状断面の写真を撮る。 ΥH2Ax免疫染色（緑）は、照射の部位を示す。 DAPI（青）は、核染色（ 図5B）である。 </li></ol> 3。マウスの作製は、焦点照射のための題材 ΥH2Ax免疫染色の結果を確認します。キャリブレーションに満足し、照射ビームの標的化したら、実験を進める。この時点で、（動物のセットアップからビーム搬送完了までの）マウスを治療するのに必要な総時間は1mmのビームを10 Gyの治療のための約10〜15分である。 <ol><li>ジャクソンマウスの実験室から4週齢のC57BL6 / J雌マウスを注文。ケージ当たりハウス4マウス、および通常の餌から餌を切り替える5週齢の高脂肪食に。耳パンチマウスは、それらに固有の識別マークを得た。日々のマウスの健康状態を監視します。注：これらは、CT上の成果物をストリーキングになりますように金属製のマーカーを使用することはできません。 </li><li>放射線や偽処置の前日、マウスの重量を量る。分割放射線または偽処置のための2つのコホートにマウスをコホート間の重量に有意差がないことを保証する。治療の日に、マウスは6週齢である場合には、すべてのマウスを再秤量し、その質量を記録する。優しく放射線プラットフォームに両コホートを輸送する。ストレスレベルを最小限に抑えるように注意してください。 </li><li>イソフルランガス麻酔室を準備します。シャム対照群では2匹のマウス、所定の照射グループ内の1つの麻酔、もう。術後の治療のための低設定で設定した加熱パッドを準備します。 </li><li>照射を受けるため、マウス用の1.4 - 手順1.2を実行します。治療の進行中、偽のマウスの場合は、麻酔チャンバー内でマウスを保持します。シュールを作るターゲットは、CT上で確認された後、周囲の放射線への影響は、放射線照射ビームで、この目標を整列するロボットに制御されているマウスの件名を動かし、インチ織り込まれているので、Eという麻酔室がCFIRプラットフォームの近くにあります。入力は、用量計画ソフトウェアにパラメータ（回転速度、治療の長さ）を算出した。 </li><li>照射処理が完了すると、加熱パッドに偽と照射されたマウスの両方を返し、彼らが目を覚ますまで監視します。 </li><li>動物施設に偽と照射されたマウスの両方を返します。毎日監視します。すべての半分の週のマウスの重量を量る。初期のBrdU曝露後のBrdUおよび神経マーカー1月の免疫組織化学colabelingによるグループ間の目標と視床下部の増殖ゾーンの照射を確認するために、BrdUを腹腔内注射を投与し（50 mg / kg）を3日後に治療や検査する神経発生します（ 図6） 2。 </li></ol>

JWはXstrahl社との研究資金と相談契約を締結している

CTガイド下焦点照射（CFIR）は、CT-32のガイダンスを使用してロボットに制御されている小動物のターゲットに放射線場を提供することができる新規および完全なシステム·アプローチである。小動物モデルに非常に集束ビームを提供するCFIRの能力は実験室での研究と臨床の翻訳を埋めるために新たな研究の機会を提供します。本稿では、特に、視床下部の神経前駆細胞集団を...

最近の発見は、成体哺乳類の脳の可塑性の顕著度を受けることができることを実証した。アダルト生まれのニューロンは、哺乳類の脳1の専門のニッチで成人期を通じて生成されます。これらのアダルト生まれのニューロンの機能は何ですか？そしてより多くのように、彼らは生理学および行動の役割を果たしているのですか？このトピックに関する研究は、伝統的に側脳室および海馬の下帯の脳室下帯に焦点を当てているが、最近の研究では、このような哺乳動物の視床下部2などの他の脳領域で神経新生を特徴としている。神経発生は、出生後および成体視床下部2-10に報告されており、これらの新生児の視床下部ニューロンの機能は、調査の活性領域のままである。 アダルト生まれのニューロンの機能的特徴は、一般的な神経科学分野のための重要な課題である。スペックの選択的阻害IFIC神経前駆細胞集団の単一の神経前駆細胞集団11に固有の利用可能な分子マーカーの不足によって制限されたままである。このように、遺伝的標的を経由して、これらの神経前駆細胞からアダルト生まれのニューロンの選択的削除が困難なまま。同様に、成人生まれのニューロンを標的とするウイルス送達は、このような環境12への傷害や炎症を導入するなどの潜在的な交絡変数の影響を受けている。 新しい放射線のツールは、1がこれら交絡を回避し、小型の動物での正確かつ精密な解剖学的な標的を介してこれらの質問を調査できるようにするということが、浮上している。電離放射線は、新しい神経細胞の誕生と分化を阻害し、神経前駆細胞集団13〜15を対象とする非侵襲的な方法を可能にする。最近、我々は（HPZ）2視床下部増殖ゾーンと呼ばれる哺乳類の視床下部正中隆起（ME）の胚領域に記載され</suP&gt;。私たちは、若い成体雌マウスに高脂肪食（HFD）を与えられたとき、HFDを与えたマウスでは神経新生のレベルは、このME地域2で供給を制御し、それらの通常の固形飼料（NC）よりも実質的に高いことがわかった。視床私の中の大人の神経新生が代謝と体重を調節するかどうかテストするために、我々はこのプロセスを混乱させるように努めた。正中隆起は、規制のホルモンが放出されるから、第三脳室の底部にある小さな一方的な構造です。この脳領域の他の生理機能を変えることなく、増殖およびその後の神経新生を阻害するために、我々は、選択的に、視床下部正中隆起2で新たに生まれた成体ニューロンの誕生を阻害するための非侵襲焦点照射技術を開発した。 グループの数は、標準領域14-28における神経発生を抑制するための放射線を用いている。しかし、以前の放射線のアプローチは、一般的に広い領域を対象とするか、ofteているN無意識にも困難を明確に特定の神経前駆細胞集団の欠陥で観察あらゆる行動の欠陥を関連付けすること、神経発生が報告されている複数の脳領域を対象とした。よりターゲットを絞った照射のための機能が29-36を対象とした 、正確な解剖学的を有効にするには、F OCALビーム赤外放射（CFIR）配信を持つC omputer断層撮影ガイド下イメージングを組み合わせた放射線のプラットフォームで提供されています。直径0.5mmと小さい放射線ビームは、特定の神経前駆細胞集団35を標的とするために利用可能である。この方法論は、私たちは、視床下部MEを対象と増殖を阻止し、小型の動物で神経新生をブロックすることができます。これらの前駆細胞集団上で放射線治療後の、生理学的および行動試験は、成人生まれ細胞のポテンシャル関数を照明するために行うことができる。焦点ターゲティングは、以来、我々のアプリケーションのために特に重要です下垂体は、視床下部正中隆起の近くに位置しています。下垂体の照射は、ホルモンの機能に影響を与え、その後、結果を混乱させることがあります。 照射後の神経新生を抑制するための生物学的基礎は依然として不明のままである。以前の放射線の研究は、大面積のビームに頼っており、神経新生の抑制は、炎症反応14、37を介して媒介されると結論している。このように、それは相当な炎症応答を誘発しないため、非常に焦点照射は、神経新生を抑制することができるかどうかは不明である。しかし、海馬における古典的な神経形成領域の私たちのグループによる最近の研究では、10 Gyでの線量の高い焦点照射は、照射35後少なくとも4週間は神経発生を抑制できることを実証した。 正中隆起の成人生まれの視床下部ニューロンの機能を調べるために、我々は、高精度放射線dを使用するMEの神経新生を阻害するために小径の放射線ビームと組み合わせてCT撮影を送達することができるevice。 360度の範囲にわたって回転するガントリに取り付けX線管を使用して、我々は、放射線治療中の動物被験体の回転を可能にするロボット制御試料台（ 図1）を用いてアークビームマイクロ照射ビームを送達。高分解能X線検出器は、ガントリ33が水平位置にあるときに画像を取得するために使用される。この研究では、CT画像を0.20ミリメートルの等方性ボクセルサイズで再構成した。動物が治療位置にある間、オンボードCTイメージングは​​、標的の同定を可能にした。ターゲットは、当社の市販の放射線プラットフォームに含まれていた、CTナビゲーション用量計画ソフトウェアを使用して、ローカライズされた。 CTイメージングにより、当社のROIをローカライズした後、動物を4度を持つロボット試料ステージによって適切な治療位置に移動した自由リース（X、Y、Z、θ）。ガントリーロボットステージ角度の組み合わせにより、ビームは、動物に対して、ほぼすべての方向から送達することができ、定位円弧状の治療が可能である29。これらおよび他のすべてのイメージング研究のために、マウスの動きを制限しながら、イソフルラン麻酔ガスを送達することを可能にする固定装置内に配置した。固定床は、CT互換性があり、かつ、ロボット試料ステージ34に接続します。 私たちは、CFIRは、研究領域の数の概念的な進歩を提供することを期待しています。我々はこの技術の原理の証明として、視床下部正中隆起の放射線ターゲティングを使用していますが、CFIRは原則的に任意の小さなモデル生物の体の任意の領域を標的とするために使用することができます。神経科学において、例えば、我々は、この技術がexisに提案されている能動的に増殖前駆細胞集団の機能を評価するために使用することができる思い描くこのような最後野38、39、脳弓下器官40、および下垂体41などの他の室周囲の臓器、中のT。大人の神経新生の機能的役割について、そして行動の因果的役割を特定する長年の論争にも今より良い対処することができる。小鳥では、この技術は、選択的、特定の脳領域において神経新生を阻害する能力によって妨げられてきた鳥の鳴き声42の堅牢で季節の動作を維持するのに大人の神経新生の役割に取り組むかもしれません。この堅牢なビヘイビア·モデルを理解することは、他の性的二型行動を調節する神経新生の役割に新たな洞察を当てることがあります。代わりに、代謝分野において、CFIRは、肝細胞増殖の役割と代謝とエネルギーバランスにおけるその役割の側面を探求するために使用される可能性があります。複数の研究分野の概念を予めための可能性は、この技術を導入することによって増強される。 43、44を達成することができるようになりました、市販されている。したがって、我々はすべての研究のプラットフォームではなく、SARRPに特異的なもののために必要な手順でこのCFIRプロトコルを一般化する。神経新生を阻害するための以前の放射線学的アプローチよりCFIRの利点は、この技術は局在化のための三次元ボリューム画像ガイダンスを可能にし、投与量の標的化、コンフォーマルな線量が非標的脳領域への曝露を最小限に抑え、高精度なビーム形状を有するコンフォーマルな線量分布を可能にすることである鋭いビームの境界。我々は、特定の解剖学的領域であり、そうする際に用量を標的とするためにCTガイド下イメージングを使用する方法を概説し、放射線を可視化する方法組織中に直接線量分布γ-H2AX、DNA二本鎖切断の35マーカーについての免疫組織化学的染色を使用して、45〜48。神経性のニッチを選択的に照射するためのこのアプローチの使用は、生理学および疾患に対する新たな大人の生まれのニューロンの機能的役割を明らかにすることの重要な意味があるかもしれません。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

アダルト生まれのニューロンの機能解析は重要な課題である。浸潤性ウイルス送達またはトランスジェニック動物を介した大人の神経新生を阻害するアプローチは、これらの研究から、難しい結果の解釈をする可能性のある交絡を持っています。新しい放射線のツールは、1が非侵襲的に小動物での正確かつ精密な解剖学的ターゲティングを通して、成人生まれのニューロンの選択のグループの機能を調べるために可能にする、しかし、浮上している。焦点電離放射線は、新しいニューロンの誕生および分化を阻害し、特定の神経前駆領域の標的化を可能にする。大人の視床下部ニューロン新生が生理的プロセスの調節に果たしている可能性のある機能的役割を照明するために、我々は選択的に視床下部正中隆起における成人生まれのニューロンの誕生を阻害する非侵襲的な焦点照射技術を開発しました。我々は、Cの omputer方法を説明断層誘導小動物ターゲティング精密かつ正確な解剖学的を有効にするには、F OCAL IR放射線（CFIR）配達。 CFIRローカリゼーションのための三次元ボリューム画像ガイダンスを使用し、放射線量の標的、非標的脳領域への放射線被曝を最小限に抑え、シャープなビーム境界のコンフォーマルな線量分布を可能にする。このプロトコルは、1が大人生まれのニューロンの機能に関する質問をすることを可能にするだけでなく、放射線生物学、腫瘍生物学、免疫学の分野での質問にエリアをオープンします。これらの放射線のツールは、ベッドサイドにベンチでの発見の翻訳を促進します。

CTガイド下標的化および精度を評価システムの機械的校正は、様々な角度からのビームすべてが一点で交差することを確保するために重要です。較正は、エンドツーエンドの位置合わせ精度が0.2mm 29であることが測定された半自動イメージングに基づく方法を用いて達成した。視床下部正中隆起構造体の体積が2小さいので、この精度は非常に重要です。こ?...

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Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

アダルト生まれの哺乳動物の神経細胞の機能は、調査のアクティブエリアのまま。電離放射線は、新たな神経細胞の誕生を阻害する。コンピュータ断層撮影誘導焦点照射（CFIR）を用いて、特定の神経前駆細胞集団の三次元解剖学的ターゲティングは現在、成体神経新生の機能的役割を評価するために使用することができる。

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

functional-interrogation-adult-hypothalamic-neurogenesis-with-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K ビュー.  California Institute of Technology. アダルト生まれの哺乳動物の神経細胞の機能は、調査のアクティブエリアのまま。電離放射線は、新たな神経細胞の誕生を阻害する。コンピュータ断層撮影誘導焦点照射（CFIR）を用いて、特定の神経前駆細胞集団の三次元解剖学的ターゲティングは現在、成体神経新生の機能的役割を評価するために使用することができる。 

ビデオ: Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli. We will use somatosensory stimuli to locate the hand somatosensory areas, auditory stimuli to locate the auditory cortices, visual stimuli in four quadrants of the visual field to locate the early visual areas. These type of experiments are used for functional mapping in epileptic and brain tumor patients to locate eloquent cortices. In basic neuroscience similar experimental protocols are used to study the orchestration of cortical activity. The acquisition protocol includes quality assurance procedures, subject preparation for the combined MEG/EEG study, and acquisition of evoked-response data with somatosensory, auditory, and visual stimuli. We also demonstrate analysis of the data using the equivalent current dipole model and cortically-constrained minimum-norm estimates. Anatomical MRI data are employed in the analysis for visualization and for deriving boundaries of tissue boundaries for forward modeling and cortical location and orientation constraints for the minimum-norm estimates.

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to map brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli.

同時MEGおよびEEGとの機能的マッピング

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

神経科学

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

ハイフィールドのfMRIを使って大人の猫における聴覚皮質の機能イメージング

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) characterization of primary motor cortex (M1) excitability and inhibition. Motor response inhibition prevents unwanted actions and is abnormal in several neuropsychiatric conditions. TMS is a non-invasive technology that can quantify M1 excitability and inhibition using single- and paired-pulse protocols and can be precisely timed to study cortical physiology with high temporal resolution. We modified the original Slater-Hammel (S-H) stop signal task to create a &#34;racecar&#34; version with TMS pulses time-locked to intra-trial events. This task is self-paced, with each trial initiating after a button push to move the racecar towards the 800 ms target. GO trials require a finger-lift to stop the racecar just before this target. Interspersed randomly are STOP trials (25%) during which the dynamically adjusted stop signal prompts subjects to prevent finger-lift. For GO trials, TMS pulses were delivered at 650 ms after trial onset; whereas, for STOP trials, the TMS pulses occurred 150 ms after the stop signal. The timings of the TMS pulses were decided based on electroencephalography (EEG) studies showing event-related changes in these time ranges during stop signal tasks. This task was studied in 3 blocks at two study sites (n=38) and we recorded behavioral performance and event-related motor-evoked potentials (MEP). Regression modelling was used to analyze MEP amplitudes using age as a covariate with multiple independent variables (sex, study site, block, TMS pulse condition [single- vs. paired-pulse], trial condition [GO, successful STOP, failed STOP]). The analysis showed that TMS pulse condition (p&#60;0.0001) and its interaction with trial condition (p=0.009) were significant. Future applications for this online S-H/TMS paradigm include the addition of simultaneous EEG acquisition to measure TMS-evoked EEG potentials. A potential limitation is that in children, the TMS pulse sound could&#160;affect behavioral task performance.

We describe an experimental procedure to quantify excitability and inhibition of primary motor cortex during a motor response inhibition task by using Transcranial Magnetic Stimulation throughout the course of a Stop Signal Task.

反応抑制に関連する皮質の生理学を測定するためのオンラインの経頭蓋磁気刺激プロトコル

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...