The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

注：生きている動物に関わるすべての手順は、実験動物の管理と使用に関するEC指令609分の86 / EECガイドラインに従って行われ、地元の倫理委員会（テューリンゲンのLandesamtエリーゼLebensmittelsicherheitウントVerbraucherschutz）によって承認された。 チミジン類似体の1。腹腔内注射<ol><li>動物に注射前日に秤量する。 10 mg / mlのストック溶液の次の日に計画されたすべての注射に必要なチミジンアナログの量だけでなく、個々の重量調整後の注入量を計算します。 </li><li> 10 mg / mlのチミジンストック溶液を準備します。 （ 注意！チミジン類似体は有毒である。供給業者によって提供される特定化学物質等安全データシート（MSDS）に従う、 すなわち、化学ヒュームフードを使用し、白衣と手袋を着用）。 <ol><li>およそ、冷凍庫からチミジンアナログを取り、RTにそれを持って来る。 21℃。 10 mgの秤量を追加または0.04 NのNaOH（BrdUおよびCldU用）滅菌生理食塩水（滅菌生理食塩水で、IDUのために）、渦。 50℃の水浴ボルテックスで15分毎に2 - - 粉末を溶解するために3分の少なくとも10のために置く。 注：-20℃で、室温で、数週間貯蔵最大24時間のために使用するソリューション。光（アルミホイルでカバー）からソリューションを保護します。常に沈殿物をチェックし、必要に応じて再溶解する。 </li></ol></li><li>首筋によってマウスを拘束し、腹腔内に30 G針で細かい用量シリンジを使用して（室温で）原液の適切な、重量調整済みのボリュームを注入する。 注：場合CldUとIDUは、同じ動物内逐次的に投与されなければならない等モル濃度を注入するために検討して（ 例えば、50mg / kgのBrdUのに対応して42.5 mg / kgをCldUと57.5 mg / kgをIDU、）。したがって、それに応じて10mg / mlのストック溶液の注入量を調整する。 </li></ol> 2.組織の準備<ol><li> Prepa灌流前日に0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）中の4％ホルムアルデヒドに再。 4℃で保存。 </li><li>経心40ミリリットルの氷冷ホルムアルデヒド（流速5ml /分）、次いで10 mlの氷冷PBSで左心室を介して深く麻酔したマウス（3.5％イソフルラン）を灌流する。 4℃で24時間、同じ固定液で脳とポストフィックスを解剖。 </li><li>連続して10％（4℃で24時間）、30％スクロース（脳シンクまでは、約48時間）に脳を転送します。気泡が組織から出なくなるまで凍結のために、ゆっくりと-25℃のイソペンタン中に凍結保護の脳を沈める。 -80℃で保管してください。 </li><li>凍結ミクロトーム上で40μmの厚さの冠状切片カット（-25でブロック温度を-16℃）。 24ウェル細胞培養プレートのウェルを含む不凍液に順次転送部（ 図1参照）。 -20℃で保管してください。 </li></ol><img aLT =「図1」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; 図1. 24ウェルプレートにミクロトームスライスを転送する模式図。A6は、次の行Bに行くなどした後、A1から始まり、A列に後続のスライスを配置します。 D6に達すると、A1に戻って継続する。切片のこの配置は、脳全体のセクション全ての n 番目の定量を可能にする。新生児の細胞の定量化のために（1列の内容に相当）脳切片番目ごとに6を取る、免疫表現型検査のために（1列の2の交互の行の内容に相当）ごとに12 番目のセクションを取る。 3.免疫染色注：セクションは、通常、キャリアプレートとメッシュインサートを装備した6ウェルプレート中で、自由に浮動して処理される。例外として、抗体インキュベーションおよびABC反応メッシュインサート（ワット当たり0.5〜1ミリリットルことなく、12または24ウェルプレートで行われるブロッキングエル）が染色されなければならないスライスの数に応じて、十分である。これらのステップの間に、細いブラシの助けを借りて、転送部は、（それぞれの新しいソリューションでリンス）。すべてのインキュベーションは、連続的に攪拌（最大150回転）で行われます。 <ol><li> 免疫組織化学（ABC法） <ol><li> TBSへの不凍液から転送部と完全に不凍剤を除去するために（一度O / N 4℃で、10分間RTで5回ずつ）徹底的にすすぐ。 </li><li>内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするTBS-T中の1.5％H 2 O 2で30分間インキュベートする。必要に応じてバブリングし、再水没セクションに注意してください。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li> オプション：一方37℃に加熱キャビネットと2NのHClを予熱。 DNAを変性させ、2N HCl中で37℃で30分間、切片をインキュベートする。ブラシの助けを借りて、静かに別々のセクション。 </li><li> オプション：0.1 Mホウ酸緩衝液中で10分間のセクションを中和する8.5、RT。転送中に、簡単に塩酸残り物を削除するにはペーパータオルの上のセクションを含むメッシュインサートを綿棒。 15分ごとにTBSで2回洗浄します。 </li><li>組織を透過し、非特異的抗体結合部位を、室温で1時間ブロックするTBSplusでインキュベートする。 </li><li> 4℃でTBSplusで希釈した一次抗体、O / Nでインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li> TBSplus、室温で3時間で希釈したビオチン化二次抗体でインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。一方で... </li><li>製造業者のプロトコル（TBS-T中1％A + 1％B）に従って、ABC複合体を準備する。使用前にRTで30分間放置する。室温で1時間のAB試薬中のセクションをインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>それぞれ、二等分し、ピペット4ミリリットルまたは2ミリリットルウェル当たりに分け、6員または12ウェルプレート当たりTBS-Tで50ミリリットル0.5 mg / mlのDABを準備します。 DAB溶液中にセクションを転送（ 注意！DABは有毒である。納入仕様に従ってくださいC すなわち、白衣と手袋を着用し、サプライヤーが提供するMSDSは、）、化学ヒュームフードを使用しています。 </li><li>ペルオキシダーゼ反応を開始するために、各ウェルに、上記のように、残りの25ミリリットルDAB溶液に、0.5ミリリットルの1％H 2 O 2を添加し、混合し、ピペット等量。 12分間インキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>ゼラチン中のスライドにマウントセクション、空気乾燥O / N。永久封入剤とカバーガラス。 </li><li> オプション：カバースリップを配置する前対比（3.5節を参照）。 注：信号対雑音比が高いため、バックグラウンドの低い場合には、AB試薬（ステップ3.1.8）とのインキュベーション後にH 2 O 2処理を繰り返す。 </li></ol></li><li> 複数免疫蛍光 <ol><li> 単一または複数の同時免疫蛍光 <ol><li> TBSへの不凍液から転送部と完全に削除するには（一度O / N 4℃で、10分間RTで5回ずつ）よくすすぐtifreeze。 </li><li> オプション：ステップ3.1.3のように- 3.1.4。 </li><li>組織を透過し、非特異的抗体結合部位をブロックし、室温で1時間するTBSplusでインキュベートする。 </li><li> TBSplus、Oで/ N 4℃で希釈した一次抗体カクテル（ 例えば、ラットα-BrdUを、α-DCXモルモット、ヤギα-GFP）でインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>蛍光色素結合二次抗体のカクテルでインキュベート（ 例えば、ローダミンレッドα-ラット、アレクサ-647α-モルモット、アレクサ-488α-ヤギ、ロバに派生したすべての）TBSplusに希釈した、RTまたはO / Nで3時間4℃で。今から上の光からセクションを保護。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>ゼラチン中のスライドにマウントセクション、空気乾燥O / N。水性マウント培地でカバースリップ。 </li></ol></li><li> 同じ宿主種からの一次抗体を用いたシーケンシャル複数の免疫蛍光 <ol><li> 3.2.1.3 - 3.2.1.1ステップとして。 </li><li> FIのインキュベート第一次抗体（ 例えば、ウサギα-抗原A）、O / Nで4℃で。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>第一の蛍光色素結合二次抗体（ 例えば、ローダミンレッド-CONJ。ロバのα-ウサギ）、3時間RTにインキュベートする。今から上の光からセクションを保護。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>最初の二次抗体にオープンパラトープを飽和させるために3時間RTのための一次抗体と同じホスト（ 例えば、ウサギ血清）から10％正常血清中でインキュベートします。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>でO / N、第二の二次抗体により認識され得るエピトープをカバーするために、一次抗体（ 例えば、αウサギIgG（H + L））のホストに向けられた、50μg/ mlの非抱合型の一価FabフラグメントとTBSplusでインキュベート4°C。 </li><li> TBS中で少なくとも3回洗浄し、一回TBS-Tで10分間ずつた。転送中に、簡単にSWAどんなのFab残り物を削除するにはペーパータオルの上のセクションを含むメッシュインサートB。 </li><li>二次抗体（ 例えば、ウサギα-抗原B）において、O / Nで4℃でインキュベートする。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>第二の蛍光色素結合二次抗体（ 例えば、アレクサ-488-CONJ。ロバのα-ウサギ）、3時間RTにインキュベートする。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。 注：別のホスト種からの抗体と抗原をラベルには、3.2.2.2のステップにそれらを追加し、それぞれの二次抗体は、3.2.2.3に移行する。 </li></ol></li><li> 一次抗体のいずれかと同じ種に由来する二次抗体の一つ 注：このプロトコルは、GFAP、ネスチンGFPとDCXと一緒にBrdUまたはKi67のに対して四重染色に適しています。 <ol><li> 3.2.1.5 - 厳密にプロトコルは3.2.1.1を手順に従ってください。この時点まではTBSplusで唯一のロバ血清を使用しています。 </li><li> T中でインキュベートRTで1時間3％ヤギ血清を含むBSplus。これは、α-ヤギ二次抗体上のオープンパラトープをカバーしています。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li> AMCA-CONJでインキュベートする。 TBSplus、3時間RTまたはO / Nを4℃で希釈したヤギαウサギ。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。 </li></ol></li><li> CldU、IDU同時染色 <ol><li>セクション3.2.1で説明したように（ - 3.2.1.2 3.2.1.1ステップ）のセクションをすすぎ、変性させ、中和する。 </li><li> TBSplus、室温で1時間でαマウスIgG（H + L）を20μg/ mlの非結合体のFab断片とインキュベートします。 TBSで4回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li> （400;精製されたIgG2 1）およびマウスα-のBrdU（1：350）、ラットα-のBrdUを含有する一次抗体のカクテルでインキュベートTBSplus、O中/ N 4℃で希釈した。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li> （1ビオチン化ロバのα-ラットを含む二次抗体カクテルでインキュベート：500）、およびFITC-CONJ。ロバαマウスFab断片（1：100）。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>ローダミンレッド-CONJでインキュベートする。ストレプトアビジン、RTで2時間。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。 </li></ol></li><li> ネスチンGFPマウスにおける蛍光シグナルの増幅 <ol><li>ヤギα-GFPは、一次抗体カクテルに追加。 </li><li> （そのようなアレクサ488 CONJとして。α-ヤギロバ）をGFPに類似したスペクトル特性を持つ蛍光色素結合二次抗体を追加し、二次抗体カクテルに。 </li></ol></li></ol></li><li> エピトープ回復 <ol><li>不凍液を洗い流した後、エピトープ回復を行ってください。 99°C（約25分） - 0.1Mクエン酸緩衝液pH6.0〜95を含有する6員または12ウェルプレートと予熱蒸し器。 </li><li> （プラスチックリットルとしてアルミホイルでプレートを覆い、30分間ホットクエン酸緩衝液と蒸気にセクションを移すIDS）は、耐熱性ではありません。 </li><li>すぐに冷却する氷浴中にプレートを配置。これは、出生後の動物の脳切片を扱うときに特に重要である、組織形態を保護するのに役立つ。 </li><li>すすぎとクエン酸を中和し、染色を続けるために10分間TBSで3回ずつ洗浄します。 </li></ol></li><li> マウス組織上のマウス抗体 <ol><li>第1ブロッキングステップ（ 例えば、ステップ3.1.5または3.2.1.3）に、αマウスIgG（二次抗体と同じホスト-種H + L）を20μg/ mlの一価のFab断片を追加します。 </li><li> TBSで4回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ、それぞれのプロトコルを進める。 </li></ol></li><li> クレシルバイオレット対比 <ol><li> （ガラス瓶）で60℃に予熱クレシルバイオレット溶液。 3分間の高温溶液中でスライドをインキュベートする。 </li><li>水溶液中ですすいでください。 DEST。 70％、96％、100％イソプロパノールで1分間ずつ2回脱水する。 </lI&gt; <li> 6キシレンで分または互換性のある永久封入媒体とのキシレン代替とカバースリップ - 5クリア。 </li></ol></li></ol> 4.データ解析<ol><li>歯状回の全体吻側尾側範囲に沿ってすべての6 番目のセクションにペルオキシダーゼ染色新生児細胞を数える。 400Xの倍率で光学顕微鏡を使用してください。 </li><li>新生児の細胞の総数の推定値を得るために交差間隔で得られた細胞数を掛け。 </li><li>適切なレーザーおよびフィルターシステムを備えた共焦点レーザー顕微鏡で画像蛍光標識セクション。 400Xの倍率で歯状回の全範囲に沿ってランダムな位置で画像スタックを取り、他のマーカーとの同時標識のために半球あたりの関心の少なくとも50ランダムに選択された細胞を分析する。 </li><li>絶対計算するために新生児の細胞の総数で同時標識された細胞（/ 100％）が得られた割合を乗算特定の新生児細胞集団の番号。 </li></ol>

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus.">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li><li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain.">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li><li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning?+evidence+from+animal+research.">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li><li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li><li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus.">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li><li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li><li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination.">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li><li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+protein:+the+immaculate+deception.">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice.">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment.">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis.">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li><li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2.">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46 (2012).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li><li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry:+a+concise+review+with+practical+considerations.">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

新生児細胞の亜集団の定量および同定は、成人の神経発生研究の中心的な課題である。大人の神経発生の特定の段階の間に発現タンパク質に対する増殖マーカーおよび抗体を組み合わせることにより、これらの亜集団の免疫組織化学的検出を可能にする。抗体または抗体の組み合わせのいくつかは、特定の染色条件を必要とする。 合成チミジン類似体の分裂細胞の標識?...

二つの脳領域を構成的生涯を通じて新しいニューロンを生成し、側脳室の脳室下帯と海馬歯状回（DG）の下帯（SGZ）。新生ニューロンは、神経前駆細胞から派生し、成熟1,2に到達する前に形態学的および生理学的な開発のさまざまな段階を経る。ゆっくり分裂放射状グリア様幹細胞（タイプ1）から、トランジットの連続した​​ステージは、中間前駆細胞を増幅が生じる。より未分化のサブタイプ（タイプ2aおよび2b型）が短く、接線プロセスとの不規則な形状を有する。彼らは徐々に未熟ニューロン（樹状突起と分子層の方に延長）になるために細胞周期を終了し、最終的に成熟した顆粒細胞などの海馬ネットワークに統合する神経芽細胞（タイプ3）を生成します。それらの特定の生理学的特性には、これらの細胞は、強化された可塑3 suggesで回路を提供ティン海馬機能で独自の役割。実際には、最後の十年の研究では、成人の神経新生が空間記憶、パターン分離と情動行動4,5に寄与することを実質的証拠を生成した。 成体神経新生は、異なるアプローチを用いて研究することができる。チミジン類似体は、細胞周期のS期の間にDNAに組み込むと新生児の細胞6-8の誕生デート、定量化と運命分析を可能にする。別のチミジン類似体（ 例えば、CldU、EDUのまたはIDU）を順次適用は、細胞の代謝回転または実験9の経過中の異なる時点で生まれた細胞集団を研究するために使用することができる。代替、細胞増殖のための内因性のマーカーはKi67のです。これは、細胞周期（G1、S、G2、M）休止期を除く（G0）及びG1 10,11の先頭のすべての段階の間に分裂する細胞において発現される。成人における新生児細胞集団の表現型を解析するために、dentat電子状回いくつかの段階特異的な分子マーカーは、GFAP、ネスチン、およびNeuNのDCX 1,6として使用することができる。 GFAPは成熟したアストロサイトのマーカーであるだけでなく、大人の前脳における放射状グリア細胞様細胞に発現している。ネスチンは、放射状グリア様細胞および初期の中間前駆細胞に特異的な中間径フィラメントである。 DCXは、中間前駆細胞、神経芽細胞と未熟ニューロンにおいて発現微小管結合タンパク質である。 +、ネスチン- 、2A型（GFAP - 1型（GFAP +、ネスチン+、DCX）：これらの3つのマーカーと4の異なる前駆細胞のサブタイプを識別できる標識された細胞の形態学的特徴の（共）式に基づいて、 、DCX - ）、2B型（GFAP - 、ネスチン+、DCX +）とタイプ3（GFAP - 、ネスチン- 、DCX +）1。一緒に有糸分裂後ニューロンに発現しているのNeuN、とDCXの同時標識、immaturの分化を可能にする電子（DCX +、のNeuN +）および（DCX - 、のNeuN +）成熟顆粒ニューロン。 上述したマーカーは、しばしば、新生児細胞の数および同一性を分析するために免疫蛍光同時標識およびその後の共焦点顕微鏡検査のために使用される。これは、典型的には望ましくない抗体の交差反応性を防止するために、異なる宿主種由来の抗体を必要とする。しかし、神経発生の研究に適した一次抗体の大部分は、どちらウサギまたはマウス（ 例えば、マウスα-BrdUを、マウスα-のNeuN、ウサギα-Ki67の、ウサギα-GFAP）で飼育されている。これは、単一のスライスで評価することができる抗原の数との組み合わせで重大な制約をもたらす。これは、複数の染色を実行しなければならないように、染色の労力を増加させるだけでなく、結果の信頼性を損なう可能性だけでなく。さらに、いくつかの抗原は、ホルマリン固定誘導性エピトープマスキング（ 例えば、Ki67の影響を受けやすい、ネスチン）。私たちはここに、これらの問題の多くを克服古典的な単一および複数の免疫標識プロトコル（ 例えば、エピトープ回復、複数の連続免疫染色、ネスチン-GFPトランスジェニックマウス12の使用）からの変更について説明します。特に、複数のシーケンシャル免疫プロトコルは、抗体の一部は、同じ宿主に由来する場合であっても、最大4つの異なる抗原に対する染色を可能にする。これは、同時タイプ1、タイプ2aと2b型と3型前駆細胞の検出、ならびに単一セクション内のそれらの増殖活性を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

成体神経新生は、新しいニューロンが次第にコミット中間前駆体サブタイプを介して活性化神経幹細胞から生成された高度に調節され、多段階プロセスである。これらのサブタイプの各々は、一緒に、特定の形態学的基準とのそれらの同定のために使用することができる特定の分子マーカーの組を表す。典型的に、免疫蛍光技術は、エキソヌクレアーゼまたは内因性の増殖マーカーと組み合わせてサブタイプに特異的な抗体を含む適用される。私たちはここに大人の海馬の神経新生のすべての段階の検出および定量のための方法を免疫標識について説明します。これらは、チミジン類似体、腔的灌流、組織処理、熱誘導性エピトープ回復、ABC免疫組織化学、複数の間接的免疫蛍光、共焦点顕微鏡法および細胞定量化の適用を含む。さらに私たちは、問題のuを回避するシーケンシャル複数の免疫蛍光プロトコルを提示sually同じ宿主種に上げ、一次抗体を使用する必要性から生じる。これは、単一のセクション内増殖マーカーと一緒にすべての海馬前駆細胞サブタイプの正確な同定を可能にする。これらの技術は、並列に異なる前駆体サブタイプの調節、脳の病理への関与、特定の脳機能におけるそれらの役割を研究するための強力なツールである。

我々は、上記の方法は、出生後および成体海馬における新生児の細胞を定量し、特徴付けるために適用される。したがって、我々は、野生型および神経発生欠損サイクリンD2は、神経新生の速度（ すなわち、富化環境、EE）13,14に影響を及ぼすことが知られている条件下で飼育（CCND2 KO）マウスをノックアウト使用。 Ki67に、BrdUを、CldUまたはIDUのいずれに対して?...

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Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K ビュー.  Jena University Hospital. This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

ビデオ: Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

神経科学

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.