MSとYZはKCLとKCL-中国の博士課程のstudentshipsによってサポートされています。 MOは、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会の博士課程の学生の身分によって資金を供給された。私たちは、エレクトロポレーションについて貴重なアドバイス勝岡部と純一宮崎PCX-EGFPプラスミドおよびアランChedotalとアテナイプシランティに感謝します。

この手順では、英国内務省の規制（動物科学手続法、1986）に準拠しています。科学者たちは、彼らの機関や国の動物規制機関によって確立され、承認されたガイドラインに従う必要があります。 1。出生後のエレクトロポレーション 1.1。ガラス管は、DNAソリューションとエレクトロポの調製<ol><li> DNA注入用のプルガラスキャピラリー（0.86ミリメートル：1.5ミリメートル、ID OD）を準備します。 （サッターP-97キャピラリープラーの指標設定は、次のとおりです。熱283; 50を引いて、速度90、タイム50）。約2μLの容量に対応したキャピラリーにマークを作る。 </li><li> 850ミリ秒間隔（100 V、50ミリ秒のONパルスは、850ミリ秒、パルス5をOFFパルス）で、100 Vで5矩形パルス、50ミリ秒/パルスにエレクトロの電圧を設定します。 </li><li> 1〜2μgの/μLの最終濃度になるように、高純度（OD 280分の260&gt; 1.80）エンドトキシンフリーのプラスミドDNAを希釈エンドトキシンフリーのトリス-EDTA緩衝液またはPBSで。それは、DNA溶液（首尾注射した場合に染料が心室に広がる必要があります）に0.1％ファストグリーンを追加することをお勧めします。 </li><li> 5〜7ミリの電極を用意し、電極ゲルと加熱パッドを温める。 </li></ol> 1.2。エレクトロポレーション<ol><li>ケージから生後2マウス子犬を削除して（〜0.6リットル/分の流量で）、イソフルラン吸入によってそれを麻酔。 </li><li>約1分後に、足のピンチ応答を使用して麻酔の状態を決定する。移動が発生しない場合は、室内注射を進める。 </li><li>キャピラリーに接続されている吸引管を用いたDNAの1〜2μlのキャピラリーニードルをロードします。 </li><li>冷光源の下では、親指とあなたの少ない利き手の人差し指で子犬の頭を保持します。少し右に注入点の識別を助けるために頭の上に肌を引き戻す。 </li><li>目とTの間に仮想回線を検討彼は画期的なラムダ（ 図1A）頭骨計測の。ラムダ（ライン中点から約1mm）15からこのラインの長さの約3分の1にキャピラリ針を挿入する。脳内に深く浸透を避けるために確認しながら、約2ミリメートルの深さのキャピラリーを挿入します。 </li><li>口からゆっくりと吹き込んでプラスミドを注入（キャピラリーに接続されたシリンジを使用することもできます）。この手順の間、これが成功したプラスミド注入を防止することができますようにあなたの指が、脳に過剰な圧力を適用していないことを確認してください。 </li><li> DNA溶液の最小量がキャピラリー内で放置されたときに注入を停止する。これは、頭蓋内圧の有害な増加を避けるために、1未満μLを注入することをお勧めします。 </li><li>コート両方の電極をゲルとし、DNAを注入した半球の側方（ 図1A）に正側でそれらを配置します。吻側SVZへのDNA取り込み、わずかに吻側場所電極用注入点。電極位置を変化させることSVZ 22,25のさまざまな分野で、エレクトロポレーションの地域特異性を達成することができます。 </li><li>パルスフットペダルを押すと、現在の転送を開始します。エレクトロポレーションが完了すると、（より低い電圧値が悪いエレクトロポレーション効率と相関するので、電圧値は、90 V以下のであってはならない）エレクトロ·ディスプレイの電圧を確認してください。 </li><li>数分間加熱パッド上に酸素の下に子犬を生き返らせるとケージに戻して、母親から離れて置くこと。母親が子犬を取得し、ごみの残りの部分と一緒に再会を確認してください。エレクトロポレーション後、次のステップの前に4-7日間、自分の母親と子犬のままにしておきます。 </li></ol> 2。急性脳スライス培養の準備 2.1。ソリューションとツールの準備<ol><li>以下の溶液が必要である（それが解剖およびイメージングのための高グルコースDMEMを使用することも可能である17）： 解剖培地（500ml）に をゲイの平衡メディア - 500ミリリットル 45％のグルコース - 5ミリリットル ムービー培地（10ml）に 45％のグルコース - 0.110ミリリットル HEPES、1M - 0.100ミリリットル ペニシリン/ - 0.100ミリリットル FCS - 0.500ミリリットル B27 - 0.100ミリリットル グルタミン - 0.200ミリリットル ダルベッコ改変イーグル培地（フェノールレッドを含まない） - 8.89ミリリットル</li><li> 37℃での映画の媒体を温める</li><li>ミリセルは37℃/ 5％CO 2の加湿インキュベーター中で、映画媒体と場所の1ミリリットルを含む35ミリメートルのガラスボトム培養皿に挿入配置します。 </li><li>ビブラアクセサリー（ねじ回し、チャンバー、かみそりの刃、接着剤）を準備します。 </li><li>はさみ、小さなヘラ、ストレートピンセット：解剖ツールを準備します。 </li><li>スライスを処理するためのツールを準備します。小さな絵筆またはソフト接種ループ（サイズ：10μL）、プラスチック製パスツールピペット、アイスボックスといくつかの6cmのプラスチック製の食器を。 </li><li>解剖媒体を予冷2-4℃で、 </li></ol> 2.2。脳スライスの作製<ol><li>予備冷却解剖培地で6cmディッシュを記入し、（新たにカットスライスを保つために）氷の上に置きます。 </li><li>頸椎脱臼に続いて、マウスの仔を斬首するためにハサミを使用しています。 、メスで頭皮を削除小脳にOBから半ば矢状縫合糸に沿って頭蓋骨をカットし、静かにピンセットを用いて頭蓋フラップを削除します。脳全体が露出していることを確認し、慎重に組織を損傷しないように特別な注意しながら、へらを使用してそれを解剖する。解剖は、慎重に行わなければならないが、同時に非常に迅速に（可能ならば分未満）。医薬品/ガス麻酔薬との終末麻酔は神経芽細胞の遊走特性と動物の犠牲次比較的早く画像化される必要がある脳のスライス培養の健康な状態に影響を与えることができるので、頸椎脱臼は、我々の好ましい方法である。 </li><li> RAZで脳を二等分するまたはブレード（ 図2）。非注入半球を捨てるか、他の実験のために使用します。 </li><li>ビブラホルダーにテープの小片を置き、その上に脳半球（ 図2）を添付する接着剤の必要最小限の量を使用しています。これは、繰り返される接着剤の用途にホルダー表面の損傷防止します。 </li><li>接着剤は数秒間乾燥させます。 </li><li>予備冷却解剖溶液で満たしビブラトームトレイにホルダーを配置します。ブレード（ 図2）に向かって嗅球を指す。 </li><li>適切な設定を用いて脳半球の切断を開始する。以下のパラメータを推奨します。スライス厚さ300μm、スピード〜3月5日;周波数〜9。高周波と低速度がスライスへの損傷を防止することをお勧めします。 </li><li>小さな絵筆またはソフト接種ループを使用してスライスを収集します。のみ表示OB（通常は2〜3スライス/脳）でスライスを保つ。通常、RMS CAの大部分を含むスライスN底面から〜300程度で見つけること。 </li><li> （両サイドに蛍光を確認するためにそれらを裏返しにしてくださいする）GFPシグナルのための標準的な蛍光顕微鏡下でスライスをチェックして、RMSの大部分に沿って明るい蛍光を示すものを選択します。 </li></ol> 2.3。脳スライスを培養<ol><li>細胞培養フードでは、脳切片の最も尾三を切り取るとファインストレートピンセットやマイクロダイセクションメスを使用して、任意の接着剤の痕跡を除去。 </li><li>繊細にして挿入して予め温めミリセルの中心に置きます（これはスライスの損傷を避けることができます、大きな開口部を作成するためにピペットの先端をカット）プラスチック製パスツールピペットを用いてスライスを吸引除去する。 </li><li> （倒立顕微鏡とイメージングのために）を挿入明るい蛍光シグナルを持つ側がミリセルに接触して配置されていることを確認します。 </li><li>ピペットを用いて、インサートの上に余分な解剖ソリューションを削除します。 </li><li>にスライス培養を残す少なくともイメージングの前に1時間、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内で落ち着く。 </li></ol> 3。神経芽細胞遊走のタイムラプスイメージング<ol><li>イメージングの前に少なくとも2時間は、ニコンのTi-Eの顕微鏡を反転パーキンエルマーUltraViewVoX共焦点スピニングディスクシステム、オンにし、浜松C10600-10B（ORCA-R2）は一定に設定されたデジタルCCDカメラと、加熱システム（ソレントSci​​entific）を冷却37℃の温度</li><li> Volocityソフトウェア取得モジュールを開いて、「VIZ」ボタンをクリックし、画像化するためのレーザを選択します。 </li><li>脳スライス標本の2時間以内に、顕微鏡ステージ上で画像化チャンバー内で脳切片を含むガラスボトムディッシュを置く。 </li><li>画像化されるスライスの領域を選択し、集中するための適切な蛍光灯の下でニコンCFIスーパープランフルーアELWD 20X/0.45目標（ 例えば単なる注射部位の後のRMSの最初の下降部分、またはELBOを使用W RMSの領域、または単に肘後神経芽細胞がOBに入る前に）。 </li><li>次のアクションでタイムラプスイメージングを設定します。 <ol><li>顕微鏡では、試料のレーザー走査を可能にするためにL100]ボタンをクリックしてください。 </li><li> Volocityでは、適切なレーザー（GFP用など 488 nmのレーザーを使用）を選択してULTRAVIEWレーザーチェンジャーを開きます。 </li><li>蛍光シグナルの強度に応じて、（通常は100〜500ミリ秒の間）、露光時間とレーザ強度​​（通常20％）を設定します。 </li><li>セルの視覚化を改善するために、画像のデジタルゲインを調整します。 </li><li>脳切片の内部 （通常は100〜120ミクロン間隔での）イメージにzスタック間隔を選択します。 （これは、その後の追跡分析を容易にする）極力可能な重複を避けるために、単離された細胞の適当な数で時間間隔を選択する。 </li><li>各zスタック画像（通常は2〜4程度）の間の間隔を選択します。 </li><li>時間INTを選択してください各zスタックキャプチャ（ 例えば 3分）、総イメージング時間（ 例えば 3時間）の間erval。 </li><li>撮像パラメータの変更を保存し、「保存」アイコンをクリックしてください。 </li><li>イメージングを開始するには録画ボタンを押してください。 </li></ol></li><li>同じ日を通して制御及び実験試料の代替画像（例えば車両/薬物治療または別のエレクトロポレーションしたプラスミド）。 </li></ol> 4。神経芽細胞の移行を分析する<ol><li> Volocity定量モジュールでは、タイムラプス実験を完了した後に作成された目的のライブラリを開きます。左上のボックス（ 図4A、ステップ1）からの「拡張フォーカス」を選択します。 </li><li> （ 図4A、ステップ2）測定ウィンドウを表示し、「測定」タブをクリックします。 </li><li>タスクのリストが画面の左下に表示されます。の下部に向かってドラッグして「トラック」（「その他」の下に存在上の空間のリスト）。これは画面（ 図4（a）、ステップ3）の左上部には「トラック」と呼ばれる新しいウィンドウのオープンを要求されます。 </li><li>トラックウィンドウ（ 図4A、ステップ4）の「入力」タブから「ポイント」を選択します。 </li><li>ポイントツール（ 図4A、ステップ5）をクリックします。 </li><li>細胞体の中央部上をマウスでクリックすることにより移行する神経芽細胞の追跡を開始し、時間経過の最後の時点まで、細胞の動きを追跡しておくに達した（3時間に及ぶ映画のための例のポイント番号61の場合） 。 </li><li>データを得るために測定メニュー（ 図4B、6-7ステップ）から「測定項目の作成 ​​」を選択します。ウィンドウが画面中央に表示されます。 </li><li>このウィンドウでは、 &quot;と呼ばれる新たな測定項目を「選択した（ 図4C、ステップ8）の名前を入力します。 PRの前に「すべての時点」オプションを選択することを忘れないでくださいディエッサー、OK（ 図4C、ステップ9）。測定項目ファイルには、タイムラプスファイルの下に表示され、定量分析のためのパラメータ（ 例えば移動距離、速度、変位、変位速度）が含まれています。 </li><li>ウィンドウ（ 図4D、ステップ10）ようにして開き、測定項目ファイルをダブルクリックします。 </li><li>分析した細胞の単一トラックを視覚化するために、「表示」オプション（ 図4D、ステップ11）から「トラックバック·ポイント」を選択します。 </li><li>右の測定項目ファイルをクリックし、移行パラメータを分析するためのExcelのようなプログラムにインポートすることができ、テキストフ​​ァイルとしてエクスポートします。 </li><li>撮影期間中に各セルによって行われた連続したフレームとポーズの間の動きを測定するために、測定項目ファイルの「表示」オプションの「点」または「集団」とIDをクリックします（すべてのトラックが固有のIDを持っている）から選択する。続行による結果のファイルをエクスポートするステップ4.10で説明したようにING。 </li></ol>

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	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain.">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li><li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions.">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain.">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb.">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury.">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li><li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury.">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li><li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury.">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883 (2008).</li><li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation.">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li><li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis,+spine+density,+synaptic+integration,+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons.">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174 (2012).</li><li>dal Maschio, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960 (2012).</li><li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).</li><li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+cell+migration:+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy.">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30 (2011).</li><li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls:+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis.">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13 (2011).</li><li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington's+disease.">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

RMSに沿って神経前駆細胞の効率的な移行は、機能的なニューロン10に彼らのその後の成熟を ​​保証します。 OBに向けた神経前駆細胞の顕著な流れは、人間の初期の段階で表示され、出生後早期人間の脳の発達27に重要な役割を果たしている可能性が高い。さらに、これらの細胞は傷害および神経変性4,28の影響を受けた脳の部位を標的とすることができます。リアル...

哺乳動物の脳では、新しいニューロン（神経新生）を生成する、2つの領域、側脳室および海馬1の歯状回における下帯の脳室下帯（SVZ）を中心に、出生後に発生します。近年では集まったかなりの証拠は、海馬や嗅球メモリ機能1-3出生後の神経新生の重要な役割をサポートしています。重要なのは、出生後の神経新生はまた、治療のため神経変性疾患との関係の可能性、および脳4-6で負傷部位に移動する神経芽細胞の能力を保持している。 脳室下帯（SVZ）は最近、重要な神経性のニッチとして浮上している。 SVZ由来の神経芽細胞は、この出生後の脳の1,7,8の中で最も長い移行プロセス作り、吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を介して嗅球（OB）に向かって移動。哺乳類SVZ / RMS / OBシステムになっていますこのような増殖、遊走及び分化1,8などの神経発生における様々なステップを、研究するための有用なモデル。多くの増殖因子および細胞外の合図は、RMSに沿って、SVZニューロン新生と移動を調節するが、細胞内の分子メカニズムは今のところ、完全に1,9を理解しているからである。 RMSに沿って適切な移行が新生ニューロン10のその後の成熟のために重要である。さらに、いくつかの研究は、SVZ由来の神経芽細胞は、脳損傷部位4-6,11-13にRMSから移動できることが示されている。このように、神経芽細胞の遊走を制御するシグナル伝達機構を研究することは、神経発生を理解するだけでなく、潜在的な治療用途のみならず基本である。 ここでは、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションによってSVZ神経前駆細胞を標識し、タイムラプス回転するディスク共焦点microscoを使用して急性脳スライス培養のRMSに沿ってそれらの移動を監視するための詳細なプロトコルを記述PY。エレクトロポレーションは広く、胚から成体の段階14〜18までの発達の研究に使用されている。それは、SVZ神経前駆細胞を標的とし、操作するための強力なツールであり、ウイルスベクターやトランスジェニックモデル1,15,19,20の世代の定位注入に安く、かなり高速な代替を表しています。これは、手術を必要とし、高い生存率を有していない比較的簡単な手順である。 loxPシステムを用いたマウスでのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーション遺伝モデルは、従って、成体神経新生のための有用なツールを表すこと21,22を研究し 、目的の遺伝子を標的とするか、SVZ前駆細胞の永久的な標識化を達成するために使用することができる。 無傷の脳内でのイメージングのRMS神経芽細胞の遊走は、現在の技術的な制限のため、依然として困難である。しかしながら、この方法は適切なシステム経験を提供する急性脳切片の共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いてモニターすることができるEMは、密接に薬理学的操作23,24にも適用できるin vivoでの条件に似ている。タイムラプスイメージングを用いたin vivo生後のエレクトロポレーションでの結合は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構の理解を容易にし、脳の修復を促進するための新しいアプローチの開発に貢献していきます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の主要な神経性のニッチの一つです。ここで、神経前駆細胞は増殖し、嗅球（OB）に向かって吻側細胞移動（RMS）に沿って移動することができる神経芽細胞を生じさせる。この長距離移動は、OBにおける新生ニューロンのその後の成熟に必要であるが、このプロセスを制御する分子メカニズムは未だ不明であるされている。神経芽細胞の運動性を制御するシグナル伝達経路を調査すると、神経発生における基本的なステップを理解するのに役立つだけでなく、治療上の再生能力を持っている、損傷、脳卒中、または変性の影響を受けた脳の部位を対象とし、これらの神経芽細胞の能力を与えられたことだけではなく。 本稿では、我々はin vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよびマウスのRMSにおける神経芽細胞の遊走のその後のタイムラプスイメージングのための詳細なプロトコルを記述します。出生後のエレクトロポレーションを効率的にSVZ前駆をトランスフェクトすることができる今度は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を生成する細胞が、。急性脳スライス培養での共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いて、神経芽細胞の遊走は、密接に、生体内の条件に似た環境で監視することができます。また、神経芽細胞の運動性を追跡し、定量的に分析することができる。一例として、我々は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を標識し、可視化するために、GFP発現プラスミドのin vivo出生後のエレクトロポレーションを使用する方法について説明します。 loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーションはまた、目的の遺伝子を標的化するために使用することができる。急性脳切片培養物の薬理学的操作は、神経芽細胞遊走における異なるシグナル伝達分子の役割を調べるために行うことができる。タイムラプスイメージングと生体内エレクトロポレーションに結合させることにより、我々は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構を理解し、開発に貢献したいと考えてい小説のMENTは、脳の修復を促進することに近づく。

SVZ由来の神経芽細胞遊走の標識は、通常、4〜8日に成功し、エレクトロポレーション（ 図1B）の後に、RMSに沿って観察することができる。長い時間点も選択することができますが、それらのほとんどは、OBを入力してするので、少ない細胞は、RMSに記載されています。神経芽細胞は、約2〜3週間後にエレクトロポレーション（図示せず）のOBでの成熟顆粒細胞の典型的な形態や機?...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K ビュー.  King's College London. 神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量?...

ビデオ: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

神経科学

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...