有益なコメントとその建設的な助言のための3つの匿名査読のために技術支援のためのウィリー日博士とクリスGellynckに感謝します。この作業は、サニーブルック聴覚回生イニシアチブによって資金を供給された

マウス組織をマウス12実験動物のケアと使用のための動物実験ガイドラインにカナダ人評議会に従って維持し、安楽死させ-reporter Sox2のEGFPから収穫した。 1.培養胚蝸牛<ol><li> 、DMEMを8.89ミリリットルを混合することにより、ウシ胎児血清（FBS）、100×N2サプリメントを100μl、及び10mg / mlのシプロフロキサシンの10μlを1mlのをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補う。 100％HEPES 5mlで495ミリリットルHBSSを混合することにより、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を補う。 </li><li>ガラス底の培養皿を準備します。 <ol><li>層流フード中で5mlのDMEM中の200μlの基底膜抽出物の基質を懸濁する。 10ミリメートルウェルを有する35mm直径のガラス底の培養皿を準備します。各ガラスの中心にピペット150μlの基質/ DMEMを皿の底。これらの皿は、40分間のインキュベーションの後に使用することができ、またはCO 2に格納することができ</sub&gt;少なくとも1週間35℃でインキュベーター。 注：ガラスの皿を、以下の理由のために使用される底：外植片を容易に位置する領域に定着することができ、皿の中心にうまくを作成するために、皿の底が透明およびイメージングに適していることを確実にするために、最終的に実験後、試料を免疫染色し、その後の分析のために処理することができるので。 </li></ol></li><li>ワークステーションやツールを準備します。 <ol><li>層流クリーンベンチをオンにし、清潔な作業スペースを作成するために70％エタノールでダウンスプレー。 70％EtOH中（エージェント（1部）と木炭粉末（2.5グラム）を硬化、184シリコーンエラストマーのミックス（10部））ピンセット、スプーン、黒184シリコーンエラストマー皿を浸す。 </li></ol></li><li>クリーンなワークステーションでは、実験用の収穫の胚。冷HBSS 1％HEPESを補充した氷の中の適切な妊娠の胚を収集します。 <ol><li>デモンストレーションを行います外部または可視臓器を決定レポーター活性、蛍光実体顕微鏡を用いて、胚を調べます。氷冷HBSSにおけるレポーター活性を示す胚を集めるこれらは実験の対象であるとして、1％HEPESを補充した。 </li></ol></li><li>頭骨を収集します。 <ol><li>クールな光源と細かい鉗子を用いて、迅速に作業し、子犬の頭を収集する。頭骨の損傷を避けるために頸椎時および顎の下にクリップするように注意してください。 </li><li>慎重に頭蓋骨を開きます。脳を外し頭の前部を切り落とす、ときれいな皿に、1％HEPESを補充した新鮮氷冷HBSSに後部頭蓋骨を転送する。慎重にタクトで前庭系を保つように注意しながらピーナッツ形の頭骨を解剖する。 </li></ol></li><li>蝸牛を解剖： <ol><li>氷冷HBSS中で料理をコーティングした黒色のシリコーンエラストマーに頭骨を転送骨の前庭地域をピン、1％HEPESを補充した。で虫ピンを挿入します頭骨を安定させ、鉗子のための部屋を作成するために斜めの角度。頭骨は、それが無傷蝸牛を収穫することは非常に困難であまり移動させることができるかのようにピン止めは、プロセスにおける重要なステップである。 </li><li>慎重に蝸牛周囲の軟骨を取り除く。蝸牛の基部の外縁に軟骨に鉗子の1タインを挿入し、軟骨に穴をクリップ。 </li><li> 、サイドアップフラップをクリップ鉗子の歯を差し込んで、静かに軟骨からダクトの屋根を区切る。上部に水平にクリップや斜めに、そして慎重にカプセルの前部を持ち上げ。残りの軟骨とダクトとの間に鉗子の突起を差し込んで、静かに最後のセクションをオフにクリップ。蝸牛の頂端面は現在公開されます。 </li><li> baseから始まり、ダクトの屋根が蝸牛上皮を満たしているエリアをキャッチし、蝸牛管を開きます。優しくトリミング、屋根をはがし必要な場合、それが完全に除去されるまで。ダクトの内側に残された膜の任意の部分を切り落とす。過剰間葉組織のダクトを清掃し、前庭系からダクトを取り外してください。 </li></ol></li><li>文化植片： <ol><li>慎重に液体のすべてをオフに描き、2分間のまま、基板コーティングされたガラス底の培養皿の中央に、外植片、管腔側表面を上にして置きます。 DMEMを滴下外植片に、それを邪魔しないように注意しながら補足し150μlのを追加します。外植片は、無料のフロート鉗子で再配置するが、それは基板に取り付けることができるように、外植片は皿の底に落ち着くことに注意する必要があります。 </li><li>湿度を維持するための滅菌水小皿で、深い直径12cmシャーレにガラスボトムディッシュを置きます。外植片が基板に付着し平坦化するために、一晩、35℃のインキュベーターにで文化を置く。 </li></ol></li></ol> 2.ライブ画像の再生ING <ol><li>外植片のサンプルを選択します。各外植蝸牛の状態を評価するために、蛍光立体顕微鏡を使用してください。ダクトは無傷で、ベースから頂点にガラスに付着している外植片をのみを選択します。 </li><li>文化蝸牛組織への5％のCO 2で35℃のインキュベーターを設定します。インキュベーター顕微鏡に文化を置く： <ol><li>優しく補充されたDMEMをオフに吸引し、少なくとも500μlの新鮮な培地と交換してください。 6日までイメージングするために、1〜1.5ミリリットルが良いです。外植片が緩く接続されているケースでは、皿の縁の周りのメディアの輪​​をピペット。この余分な液体は、それがマトリックスにアタッチし続けている間に外植片を乱すことなく、ミニチュアの「加湿チャンバー」を行います。 <ol><li>別の方法として、使用は試薬が画像コレクションの間隔の間に交換する必要がある場合に、皿を顕微鏡でのフィッティングに留まりながら、料理は蓋を開くためにカバーしてヒンジ付き。ヒンジ付きの皿カバーは蓋をすることを可能にするサンプルを乱すか、その設定から食器を削除せずにオープンしました。これは、次の画像キャプチャの彼らの正確な位置を維持しています。 </li></ol></li><li>試料皿ホルダーに適切なサンプルを含むガラスボトムディッシュを挿入します。この例では、顕微鏡は8 35mmのサンプル皿を保持している回転台を持っています。 </li><li>層流フードの下にガラス蓋付きのプラスチックの蓋を交換し、試料皿ホルダーに料理を挿入します。皿の底から外植片を取り除くために、またはメディアを乱さないように注意しながらインキュベーター内部の試料皿ホルダーを置きます。 </li></ol></li><li>イメージング·ルーチンを設定します。 <ol><li>顕微鏡、UVランプとカメラに切り替え、イメージングソフトウェアを開きます。 </li><li>試料の位置を確認し、シーケンス内の各ディッシュの露光時間を、撮像エリアを選ぶ焦点面と調整。始動時の外植片の観点だけでなく応じて焦点面を選択しますが、アルそう、組織がどのように移動するかを念頭にしてどのくらいの時間経過が実行されます。 </li><li>蛍光チャネルで選択された焦点面を中心に、Zスタックを設定します。実験のためのサンプリングの頻度と長さを設定します。サンプリング周波数は、画像を収集するのにかかる時間によって制限されるので、これは視野を選択し、Zスタックを設定した後に決定されるべきである。この場合、サンプリングは5日間にわたり30分毎に行われます。実験期間は14日間までであることができる。 </li></ol></li><li>ムービーを生成します。 <ol><li>時間の経過期間の終了時にイメージファイルを開く。逐次収集ポイントをオープンする。この場合、MetaMorphソフトウェアを使用する。フレームごとに、関心のある細胞集団を示すための最良の焦点面を選択します。 </li><li> .aviファイルにこれらの画像を変換する、または複数のフォーマに開放し、分析する画像処理ソフトウェアで、または変換することができる一連の画像を生成するために、モンタージュとして書き出すビデオ処理ソフトウェアを使用してtsが。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

培養物を確立し、長期的画像化するためにタイムラプス顕微鏡を設定する際にされているときに考慮すべきいくつかの技術的なポイントがある。 我々は、蝸牛外植片を培養するための基質として基底膜マトリックスを使用するが、基質は、細胞型に適合させるべきである。例えば、画像ニューロン培養物には、フィブロネクチンのコーティングを提供することが望まし?...

哺乳類の蝸牛は非常に規則正しい複雑な器官である。出生後早期の段階での日に耳胞からプリミティブ内耳の出現E11と発達プログラムの完了との間に、マウスでは、細胞のシグナル伝達および遺伝子発現の協調変化の複数の波が起こる。ベースから蝸牛管の頂点に実行すると、感覚上皮を検出する音、またはコルチ器官である。コルチ器官の開発は絶妙開発の終わりまでには、内有毛細胞の単一の行で構成されように制御され、外有毛細胞の3つの行は、支持細胞の5行（柱状セルの二行三に散在ダイテルス「セルの行）1。 、難聴起源感覚epithemlium 2のパターニングofthe studyeの重要性をheighlightingでこの正確な順序結果からの偏差。 胚性マウスCOCHの体外培養においてLEAは、コルチ器官の発達のメカニズムを研究する上で不可欠なツールです。この技術は1974年に設立され、過去40年間で、感覚上皮が指定され、コルチ器官は3が確立されたメカニズムの多くを解明するために使用されてきた。蝸牛は、動的な発生過程との複雑な器官である。操作1をマニフェストに限り、7日間かかる場合があります。 E13での蝸牛外植片培養物にGSK3βの阻害剤を追加する場合、例えば、化合物の強固な効果を観察するための最適なインキュベーション期間の6日4である。 現像蝸牛のライブイメージングは​​、コルチ器官の形態の変化、遺伝子発現の変化、細胞を、移行増殖性または死亡の追跡調査を可能にし、それはリアルタイム薬剤の結果の観察およびシグナリングの中断を可能にする経路。今までは、蝸牛のイメージングを生きる主に短時間5-8上コルチ器官の画像小領域に、共焦点顕微鏡を使用して実行するが、この技術は、外植片生存率による制限を有するされている。遅い発達プロセスにおける長期的な操作の効果の撮影では、撮影環境が重要である。通常、共焦点ライブイメージング·システムは、顕微鏡に座って、加湿プラスチックの箱を使用しています。暑さと湿度は、アクセス窓から、ヒンジ付きの開口部を通って、そのような客観的または光源としてmicroscope-のさまざまな部分の周りの隙間を通って、顕微鏡テーブルを満たすインキュベートボックス内の隙間を通って逃げることができる。これは、2つまたは3つ以上日間健康な外植片を維持するために最適ではない。 我々は、標準的なCO 2インキュベータ内に封入され、倒立顕微鏡ではなく、顕微鏡を中心に構築され、インキュベーターとして「インキュベーター顕微鏡&#39;を定義。インキュベーター顕微鏡事後むしろ二、三日間のイメージングより、サンプルは2週間まで撮像することができるように、実験の寿命がある。インキュベーター顕微鏡は文化や標準制御された条件を外植する最小限の妨害で、細胞の増殖および分化のための優れた環境を提供します。複数日にわたって行われた研究では、培養器からそれらを除去し、倒立蛍光顕微鏡にそれらを実施することによって、日常的に画像化サンプルに頼るのが一般的である。このアプローチは働くことができる一方で、インキュベータから皿を除去することに敏感な開発組織のストレスを負わせる。原因インキュベーターから取り出し、温度における培養培地および変動の酸性度の変化は、次善の開発や不健康な組織になることができます。あらゆる時点において同じ焦点面と同じ方向に同じ領域を撮像することは極めて困難である。インキュベータ内で自動化システムを使用することにより、健康維持することができる組織は、複数の時点での画像を収集するために、同じ領域が全てのフレームに取り込まれることを確実にする。近年、いくつかの統合された顕微鏡組織インキュベーターが開発されており、これらは、臨床診療9にも、幹細胞および癌研究10,11のみならず、有用であった。 ここでは、マウス胎児蝸牛外植片の長期ライブイメージングのためのプロトコルを提示する。我々は、設定された時点で複数のサンプルの画像を捕捉する能力を有する標準的なCO 2インキュベータの内部に自動顕微鏡システムを使用する。システムは、インキュベータ内にセットし、倒立顕微鏡で構成されています。サンプルは、各時点で複数のサンプルの画像化を可能にする回転壇上に配置されている。照明、画像キャプチャ、および演壇の回転は、MetaMorphソフトウェアを介して操作の自動化システムによって制御される。オペレーティングソフトウェアを用いた撮像ルーチンを設定することにより、我々は、twの最大のために実行するための実験を​​設定することができ最小限の人間の介入と週O。この例では、大規模な成長と転位蝸牛の、具体的には、prosensory領域を示すために、明視野および蛍光の両方を使用する。この実験では、蝸牛は胎生E13にSox2のEGFPレポーターマウスから解剖されます。 インビトロ培養が確立した後、5日間にわたり画像化されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

ここでは、ライブ胚のマウス蝸牛外植片の長期的なタイムラプスイメージングのための方法を提示する。約10日間の哺乳類蝸牛が進むの非常に規則正しい、複雑な構造を構築するための責任が発生プログラム。この期間にわたって遺伝子発現の変化および医薬品または遺伝子操作に対する反応を研究するために、長期的画像化が必要である。以前は、ライブイメージングは​​、典型的には、標準的な顕微鏡の上の加湿チャンバー内で移植組織の生存度によって制限されてきた。湿度および温度に関して培養増殖のための最適な条件を維持することが困難で画像化実験の長さに制限を置いている。修正された組織培養インキュベーターに統合顕微鏡は、長期的なライブイメージングのための優れた環境を提供します。この方法では、我々はマウス胎児蝸牛外植片を確立する方法と時間経過のimagiを実施するインキュベーター顕微鏡を使用する方法を示し5日間にわたり、典型的な胚日（E）13蝸牛外植片及びSox2の、蝸牛のprosensory細胞のマーカーの挙動を調べるために、明視野および蛍光顕微鏡の両方を使用してngの。

ここでは、モンタージュ（ 図1）およびE13.5上に播種した場合、典型的な器官蝸牛外植片が成長する方法を示す映画（ 図2）を示す。 Sox2のレポーターマウスprosensory領域を可視化するために使用された。映画は蝸牛成長と収束と拡張子を受けることを示し、緑のSox2のドメインの横の領域内のセルは、それが拡大し、周囲の組織のように分割していないよ?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K ビュー.  Sunnybrook Research Institute. 手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。 

ビデオ: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

神経科学

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

自由に行動するマウスで長期的な感覚の衝突

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Methods Article

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング