この作品は、国立衛生研究所（OJTMへKGP、OJTMとR01HL101972にU54C​​A143906）とオレゴン医学研究財団初期の臨床研究者賞（KGP）からの補助金によって支えられている。 OJTMは米国心臓協会設立調査官（13EIA12630000）です。我々は、この研究で使用した細胞サンプルを調製するための騎士がん研究所の博士エリック·アンダーソンに感謝します。

1。顕微鏡仕様正しい方法でイメージングを行うために顕微鏡は、次の仕様を持っている必要があります。 <ol><li>微分干渉コントラスト（DIC）及び明視野（BF）コントラストの両方を有する。 </li><li>コンピュータ制御のz軸の動きを有する。 </li><li>集光レンズの開口数を変化させるために調節可能な開口絞りを有する。段階的なルールや電子読み出しと開口部が開口数の値を知ることが必要である。開口数はHTDICためNIQPM 0.1から0.9（またはそれ以上）までの範囲でなければなりません。 </li><li>顕微鏡は、明視野イメージングのために利用される狭帯域カラーフィルタを有するべきである。このフィルタは、屈折増分、NIQPための質量密度に位相を変換するために使用される波長依存製作を修正するために必要とされている。 </li></ol> 2。微分干渉コントラスト（DIC）Zスタック取得<ol><li> SlideBookソフトウェアAを開くND画像収集のための新しいスライドを作成します。 </li><li>次に、フォーカスウィンドウを開きます。 フィルタセット ] セクションで、DICを選択します。 [スコープ ] タブで、 凝縮部の下、一番右の位置（すべての道を開く）に絞りスライドバーを調整します。これは、高開口数の照明を提供し、試料の光学切片を高める。 </li><li> DIC対物レンズを用いたサンプルに焦点を当てています。サンプルが簡単に表示されるまでのハロゲンランプ強度を調整します。カメラは飽和していないようにするには、フォーカスウィンドウのカメラタブを選択し、ピクセル強度のヒストグラムが、カメラのダイナミックレンジ内にあることを確認してください。 </li><li>イメージキャプチャ]ウィンドウを開きます。 キャプチャの種類]セクションでは、3Dボックスをチェックしてください。 3Dキャプチャセクションでは、 中心付近の範囲を選択し、 現在の位置に戻る </strongで&gt;ボックスおよびZ方向の範囲、面の数、及びステップサイズを指定する。 Z方向の範囲は、サンプル全体を組み込む必要があります。 </li><li>イメージキャプチャ]ウィンドウの[ フィルタセット]セクションで、DICのチェックボックスをオンにして、露光時間を指定します。 イメージ情報]セクションで、（オプション）イメージに名前を付けて画像化を開始するために[開始]を選択します。 </li></ol> 3。明視野（BF）のZ-スタック獲得<ol><li>顕微鏡は、試料のDICのzスタックの収集が終了したら、フォーカスウィンドウを開き、[フィルタの設定 ] セクションの下の[開く]を選択します。低NAの照明を提供するために、（すべての方法を閉じた）遠い左の位置に絞りスライドバーを調整します。 </li><li>緑に顕微鏡光パスフィルタを変更します。サンプルが表示されるまでのハロゲンランプ強度を調整します。選択して、カメラのない飽和がないことを確認<st栄&gt;カメラのフォーカスウィンドウのタブと画素強度のヒストグラムが指定された範囲内にあることを確認する。 </li><li>イメージキャプチャ]ウィンドウを開きます。 DIC zスタック買収による3Dキャプチャ設定が表示されます。 </li><li>イメージキャプチャ]ウィンドウの[ フィルタセット]セクションで、[開く ]チェックボックスをオンにし、露光時間を指定します。 イメージ情報]セクションで、（オプション）イメージに名前を付け、zスタック画像取得を開始するために[開始]を選択します。 </li></ol> 4。 Z-スタック画像のエクスポート<ol><li> zスタックキャプチャを開きます。 100パーセントにビューを変更します。 0カメラの最大画素値との間に表示される画素値のヒストグラムを調整する（16ビット、12ビットカメラ用4,095、65,535）。 </li><li> [ 表示 ]&gt; [ エクスポート]&gt; [TIFFシリーズを選択します。これはTIFF画像のシリーズとしてzスタックをエクスポートします（それぞれのZ平面に1つ）。終わり（ すなわち 「DICスタック1_ &quot;）にアンダースコアを持つ名前の別のフォルダにTIFFシリーズを保存します。各DICまたはBF zスタックでこれを繰り返します。 </li></ol> 5。体積測定<ol><li> 「JoVE_HTDIC_v1.m」と題しHTDIC MATLABプログラムを開きます。 </li><li> HTDICプログラムのセクション0の下では、依存関係のディレクトリ変数を更新。コピーと「dependencies_directory = &quot;次の一重引用符の間にあるエクスプローラからhilbert_transform_dic.mとsobel_edge_detect.mファイル（PC）を含むディレクトリを貼り付けます。 JoVE_HTDIC_v1.mプログラムのExecuteSection 0。 </li><li>第1に、「images_directory」を更新します。もう一度、一重引用符の間に。TIF形式でスルーフォーカスの画像を含むディレクトリをコピーして貼り付けます。一度だけセクション1を実行します。 </li><li>アライメントとヒルベルトのための画像の回転は実行]コードのセクション2に変換する。 「HTDICパラメータの定義」というタイトルのダイアログボックスが表示されます。五numbeRSは、ユーザーから要求されています。サンプルのDIC画像がフォーカスされている焦点面番号、横方向の解像度（画像中のミクロン/ピクセル）、距離分解能（これは0.1ミクロンの軸ステップで画像取得のために0.1である）、ヒルベルト変換を実行するために必要なDIC画像の回転角、典型的な値は、45および-135である。最後に、関心の大きさの領域に入る、このパラメータは、その後表示されるボックスの一辺の長さを定義する - 一般的な値は400です。 [OK]をクリックします。 </li><li>焦点面番号で指定されたDIC焦点面の画像は、青色のボックスが表示されます。セル例えば 、関心のある特徴の上に箱を置きます。ボックスは、正方形である必要はありません。ボックスはボックス内に所望の領域をダブルクリックの上に配置された後。 </li><li>別の図は、今表示されます。この図は、前のステップで選択した関心領域のトリミングされたと回転した画像が含まれています。画像のコントラストなものであるべきで明るい特徴が右側に表示されている間、その暗い特徴は、左側に表示されます。関心のある領域の上青いボックスをドラッグし、必要に応じて再構築する。 </li><li>第3節では、zスタックキューブためのマスクを生成します。細胞の周りに長方形、手で目的の細胞の輪郭をフリーハ​​ンドツールを作成する長方形のマスク：利用可能なマスクの2種類があります。 </li><li>長方形のマスク、コメントを外し、ライン167とコメント行170を（その行の先頭に「％」を配置することにより、行をコメントアウト）を生成する。プログラムのセクション3を実行します。画像をクリックして、長方形のマスクの定義を開始するには、マウスをドラッグします。それを受け入れることをボックスをダブルクリックします。 </li><li>手描きのマスク、コメント行167とコメント解除ライン170を生成し、第3節を実行します。クリックして、マウスを使って、所望のマスクを描画します。それを受け入れるためのマスクをダブルクリックします。 </li><li>ヒルベルトを構築4toランセクションは、DICの画像スタックと関心領域の対応するDICの画像スタックを変形させた。3章で構築されたマスクは、DICスタックおよび「maskON」がライン179で1に設定されている正規のDICスタックをヒルベルト変換に適用されます。 0に &quot;maskON&quot;を設定すると、マスクを適用せずに画像スタックを構築します。 </li><li>関心領域のxz断面画像の画像分割を最適化するために、セクション5を実行します。プログラムによって生成され、図500、コントラスト、3つの異なるタイプが表示されます。セルの境界線を見つけるためのアルゴリズムの成功は、使用されたマスク、プログラムの行229の「しきい値」の値の組み合わせに依存している。 0.5の値で始まります。しきい値の値を調整し、適切なアウトラインは、列のいずれかで達成されるまで、プログラムのこの部分を再実行してください。 </li><li>アウトラインは、列1で最高だった場合は、DICの画像分割を使用してボリュームを決定するために、第6節を使用しています。列2は、最適な結果が得られた場合は、ヒルベルト変換された微分干渉画像から細胞容積を決定するために、第7節を実行します。もし3列GAVE最適な結果は、フーリエフィル​​タリングヒルベルト変換されたDICの画像を使用してボリュームを決定するために、セクション8を実行します。 </li><li>立方ミクロン（オンス）で報告された試料の測定された体積は、体積測定が選択されるかに応じて、プログラムによって生成される図600,700、または800のタイトルに提示される。 </li></ol> 6。質量測定<ol><li> 「JoVE_NIQPM_v1.m」と題しNIQPM MATLABプログラムを開きます。 </li><li> NIQPMプログラムの第0の下で、プログラムを実行するのに必要な3つのディレクトリの場所を更新。これらは「dependencies_directory」「brightfield_directory、」と「dic_directory。 &quot; </li><li>次に、第1を実行します。コー​​ドのこのセクションでは、画像のセット全体の完全な視野の明視野像キューブが生成されます。一度だけセクション1を実行します。 </li><li>次に、第2節を実行します。 「NIQPMパラメータの定義」というタイトルのダイアログボックスが表示されます。の明視野像焦点面番号：4つの数字は、ユーザーから要求されるサンプルがフォーカスされている、横方向の解像度（画像中のミクロン/ピクセル）、軸方向の解像度が（これは0.1ミクロンの軸ステップで画像取得のために0.1である）、および金利の大きさの領域は、このパラメータには、の辺の長さを定義しますその後、表示されるボックス - 一般的な値は200です。 [OK]をクリックします。 </li><li>焦点面番号で指定された明視野焦点面の画像は、青色のボックスが表示されます。 <ol><li>画像の焦点が合っていない場合は、青色のボックスを再実行し、セクション2をダブルクリックして、ダイアログボックスで焦点面数を調整してください。 </li><li>画像の焦点が合っている場合は、画像の周囲に青色のボックスをドラッグして、ボックスのノードを選択し、必要に応じてドラッグしてサイズを変更します。関心のある特徴の周りにボックスを配置し、 例えば 、細胞。ボックスは、正方形である必要はありません。それを受け入れることを、ボックス内をダブルクリックします。 </li></ol></li><li>次に、明視野画像のスタックを構築するための実行第3章では、内の領域にトリミングterest。 </li><li>位相マップ、疑似DIC画像、明視野画像と真のDIC画像との比較を生成するには、第4節を実行します。 </li><li>擬似でDICおよび質量密度マップ、総質量、および細胞密度のヒストグラムできるだけ同じ真のDIC画像は、セクション5aと、5bのを実行することによって決定することができる。ライン300で最適化する「閾値」 - - 部5aは、フィールドの自動ボーダー検出を行う典型的な値は0.1〜1の間で変動。しきい値の値を最適化するために、必要に応じてこのセクションを再実行してください。ユーザは、目的の細胞を概説した後部5bは質量決定等を行う。 </li></ol>

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	<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung.">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+contrast,+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects.">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Phase.">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li><li>Smith, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li><li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinterf&#233;rom&#232;tre+diff&#233;rentiel+&#224;+ondes+polaris&#233;es.">Microinterf&#233;rom&#232;tre diff&#233;rentiel &#224; ondes polaris&#233;es.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li><li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy.">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li><li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-enhanced+contrast,+differential+interference+contrast+(VEC-DIC)+microscopy:+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris.">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image+processing+greatly+enhances+contrast,+quality,+and+speed+in+polarization-based+microscopy.">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li><li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+shape+change+and+spreading.">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li><li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+microscopy+and+mass+determination.">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li><li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractometry+of+living+cells.">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li><li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy.">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li><li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy.">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li><li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide&#8208;field+differential+interference+contrast+microscope.">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide&#8208;field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li><li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+(TI-DIC)+microscopy+for+quantitative+phase+imaging.">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering-phase+theorem:+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media.">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li><li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Carr&#233;+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude.">Quantitative Carr&#233; differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li><li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+phase+microscopy.">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li><li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light.">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li><li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=non-iterative+phase+retrieval+by+Green&#8217;s+functions.">non-iterative phase retrieval by Green&#8217;s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li><li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+quantification+of+cellular+mass,+volume,+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient.">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li><li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single+cell+refractive+index,+dry+mass,+volume,+and+density+using+a+transillumination+microscope.">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li><li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum.">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li><li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cell+membrane+tension.">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics.">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li><li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+phase+microscopy.">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li><li>Charri&#232;re, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy.">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li><li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging.">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li><li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+interference+microscopy.">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li><li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems.">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li><li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics.">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li><li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li><li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

著者は、提示され、作業には金融利害関係はありません。

一般的に、NIQPMは0.25から44.7までの光路長で検証回折限界的な技術である。検証は、Fluoromount G（データは示さず）に懸濁0.11-9.8ミクロンより= nの上に、直径1.596の範囲のポリスチレン球を行った。細胞はほぼ0〜7までの範囲の光路長を有している。 試料の濃度分布を測定する場合、1は密度マップは、不要なバックグラウンドの寄与を保有しながら、擬似DIC画像が正常に見?...

光学顕微鏡を使用することになりました細胞生物の調査に遍在です。 、可視光スペクトルにわたって、その低い内因性の吸光度と弱い散乱特性のために、細胞が強く、それらを横断する光波の振幅に影響を与えるため、標準的な明視野顕微鏡で画像化したときに半透明表示されません。細胞の標本は、しかしながら、直線状の光が通過する空間の特定の領域における局所質量密度の量に関連する様式でそれらを通過する光波が遅くない。この不均一タイムラグまたは顕微鏡標本を透過した光の波の「位相」プロファイルの利用は最初のフリッツゼルニケ1によって1935年に記載され、実験的にZernikein 1942 2を実現した。ゼルニケは、この達成のために1953年にノーベル賞を受賞しました。ツァイスは1945年3この様式を商品化しました。 1955年に、スミスとNomarsk私は、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡、コントラスト機構としての位相の空間勾配を使用していますモダリティの使用4と理論5上での初期の作品を提供してしまい。 DICは、ノマル6と1965in緊密に連携ツァイスによって商品化されました。 1981年に、2研究所は、DIC顕微鏡7、8の光学列にビデオカメラを組み込むことで最初に記録された生きた細胞のDIC画像を示した。生細胞イメージングの時代が誕生しました。 この時以来、商業顕微鏡に位相差およびDICの両方の実行はほぼ横ばいとなっている。形態学のモニタリング、細胞内構造の追跡、および膜9のダイナミクスの研究：これらの方法は、主に定性的な目的のために、細胞の画像を生成する生物によって利用される。これらの技術は、位相とDIの両方としての「既製の」構成で定性的でC画像は、任意の光源強度の関数、照明光学系の設定、およびCCDカメラゲイン、ガンマ、および露光設定である。 物理学者や光学技術者の小さな軍団は、市販の画像診断法は、定量するために努めてきました。最初の努力の中で自然に2文字は、医師出身の生物物理学者ロバートBarer、市販の位相差顕微鏡を用いてこれらの細胞型を介して位相シフトを推定することによって細胞の細胞乾燥質量を測定するために位相差顕微鏡の使用を実証した1952年、1953年であった10、11。位相差顕微鏡10,11、微分干渉顕微鏡12から17と、光路長、相、質量を決定するために、明視野18〜22歳 ：フィールドは、3つの基本的なラベルフリーコントラストメカニズムをベースにその後の年間の技術を多数開発してきました密度、屈折率、および細胞容積。 パラ中llel、カスタム光学機器の大規模なコレクションには、1950年代から開発されており、寄生虫の成長23でのアプリケーションから、赤血球25の膜動態を調査し、細胞周期24を文書に至るまで光学測定を遠大てきた。具体的には、過去10年間では、回折位相差顕微鏡26の形で断層位相差顕微鏡27、デジタルホログラフィック顕微鏡28、位相敏感光コヒーレンス顕微鏡29、空間光干渉顕微鏡30、ヒルベルトのラベルフリー定量的顕微鏡の富を見ている位相差顕微鏡31、および定量的な位相差顕微鏡32。彼らの集団的成功にもかかわらず、これらの商品は、その複雑な計測および計算要件に、大部分は、生物学による研究者の大きな分野に普及していない。 本明細書で我々は、dは明視野及びDICの画像を組み合わせて質量、体積、および細胞標本上の濃度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用を傍接させる。体積を決定するために、全細胞質量及び細胞内濃度分布の測定を行うために、noninterferometric定量的位相顕微鏡（NIQPM）及びヒルベルト微分干渉コントラスト顕微鏡（HTDIC）を形質転換：つの主要なアプローチが提示される。 NIQPMとHTDICの主な利点は、その技術、アクセシビリティに横たわっていた。彼らの正常な実行に必要な撮影条件は、ほとんどの市販の顕微鏡の通常の操作の範囲内である。さらに、後処理アルゴリズムは、安定した迅速、かつ堅牢である - 可能な限り高速フーリエ変換（FFT）に基づくアルゴリズムを用いて変換MATLABにおいて実施された。 NIQPMは位相およびCELの軸方向に一体化質量密度を再構築する方法であり、明視野画像からlular標本。試験片の面積に対するこの軸方向に一体化質量密度の総和は、試料の全乾燥質量含有率を提供します。それは、細胞の位相プロファイルは、サンプルのスルーフォーカス明視野画像から再構成することができることが実証された- - NIQPMプロトコルはPaganinおよびニュージェント18,19によって敷設基礎実験に基づいており、フランクの理論的研究、Altmeyer、およびウェルニッケ20 -効率的なFFTベースの方法で、近軸波モデルの解決に。乾燥質量密度相の接続はBarer 10、11とポペスク33により作業に基づいています。 ボリュメトリック情報は、光軸に沿って試料の光学切片を有効に高NAの照明条件の下でスルーフォーカスDICの画像から得ることができる。ヒルベルトDIC画像スタックに変換処理を大幅に強化バックグラウンドとは、試料の強度のグレー値を分離することにより三次元の検体の境界線の局在化のためのエッジ検出アルゴリズム。我々は、コントラストとサンプルの自動化された容積測定分析のためのソーベルベースのエッジ検出方法を強化するために、両方のフーリエフィルタリング方法を導入しているが、この作品は、Arinson ら 34で発信する。また、回折限界から最大直径36〜20μmの大きさの範囲のポリスチレン球で以前HTDICを検証しています。 NIQPMとHTDIC両方が商業顕微鏡上での開発のために技術的にアクセス可能である一方で、これらの方法は、基本的に顕微鏡自身のハードウェア構成によって制限されます。これらの技術の主な制限は2倍以下のとおりです。商業スコープの遅いzスタックの取得時間による全体試料ステージの翻訳にだけ、対物レンズとは対照的に、現在、より速くおよそ1フレーム/分以上の現象の調査を制限し、第二に、回折効果はそれぞれ、直径10〜20μmの最大0.2のサイズの範囲のオブジェクトにNIQPMとHTDICの有用性を制限する。したがって、関心のある試料とそれに関連する時間のダイナミクスは、典型的な「既製の」楽器でこれらのメソッドを使用できるようにするために一定の大きさと時間的な制約を満たす必要があります。おもしろいこと、ほとんどの固定、携帯の標本は容易にこれらの方法を用いて調査されています。 NIQPMとHTDICプロトコルの概要を図1に示す。 図2に、我々は、明視野およびDICの画像の両方のための低と高の両方のNA照明条件の下で最適と部分最適スルーフォーカスイメージングを示しています。3と4は、成功と失敗の実装を強調しNIQPMアルゴリズムのパラメータ依存性を実証する図 。 <strong&gt;図5はHTDIC画像処理アルゴリズムに含まれるステップを示しており、細胞の体積を決定するためのアルゴリズムの最適な実装を示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

我々は、明視野および微分干渉コントラスト画像の組み合わせを介して質量、体積、および細胞標本上の濃度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用を記載している。全細胞集団および細胞内濃度分布の測定を行うために、noninterferometric定量的位相顕微鏡（NIQPM）及びヒルベルト体積を決定するために、微分干渉コントラスト顕微鏡（HTDIC）を形質転換：つの主要なアプローチが提示される。低開口数（NA）は、照明、弱い散乱、試料による光の弱い吸収：NIQPMが波の伝播を単純化したモデルに基づいており、3基礎的前提で、近軸近似と呼ばれる。幸いなことに、無染色細胞の標本は、これらの仮定を満たし、低NAの照明は簡単、市販の顕微鏡で達成される。 HTDICは、高NAのillumin下のスルーフォーカスDICの画像からの体積情報を取得するために使用されているATION条件。高NA照明は光軸に沿った試験片の強化された切片を可能にします。ヒルベルトDIC画像に対して変換処理を大幅にスタックすることは、背景とは、試料の強度のグレー値を分離することにより、三次元での検体の境界線の局在化のためのエッジ検出アルゴリズムを強化する。 NIQPMとHTDICの主な利点は、「既製」顕微鏡を使用して自分の技術、アクセシビリティに横たわっていた。商業スコープの遅いzスタックの取得時間は、現在より速く1フレーム/分以上の現象の調査を抑止する、第二に、回折効果を10まで0.2からオブジェクトへNIQPMとHTDICの有用性を制限します。これらのメソッドの二つの基本的な制限がありますそれぞれ直径（NIQPM）と20（HTDIC）程度、。したがって、関心のある試料とそれに関連する時間ダイナミクスは、これらのメソッドの使用を可能にするために一定の大きさと時間的な制約を満たす必要があります。おもしろいこと、ほとんどの固定蜂巣r個の試験片を容易に、これらの方法で調査している。

スルーフォーカス画像取得中に正しいサンプル照明はNIQPM ND HTDICアルゴリズムの実装を成功させるために重要である。 図2に、我々は2C、2I、図2A。DICおよびポリスチレン球とヒト大腸腺癌細胞株SW620用明視野コントラストの両方で低域と高NAの照明を示しており、2Kは NIQPMに最適なイメージングを示しています。2F、2Hを、図2Nと2Pは HTDICに最適?...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K ビュー.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

マクロを含む光の組織ファントムの作製と評価

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...