グラントサポート：NIH CA165263、NIH CA150197、NIH CA150197S1（HJクン）、NIH CA150197S1（CA Changou）、NSF PHY-0120999 バイオフォトニクス科学技術 （DLウォルフソン、FYS荘）、DOD PC073420（RJ太字）、研究センターノルウェーの評議会、Leivエリクソントラベルグラント209286/F11（BSアルワリア）。 HJクンもオーバーンコミュニティがん基金基金の支援を認めるものです。 RJ太字またJ.マクドナルド寄付の支援を認めるものです。 私たちは、ADIの寛大な供給のためDesigneRx博士ジェニー魏ジェンクン博士とボル·ウェンウーに感謝します。

1。パート1：細胞培養​​および免疫蛍光標識<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを含有するRPMI（メディアテック、VA）を6ウェルプレートに配置されたガラスカバースリップ（＃1.5、または170ミクロンの厚さ）にCWR22 Rv1ないヒト前立腺腫瘍細胞を成長させる。 </li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）中のアルギニンデイミナーゼ（ADI、0.3μgの/ ml）で選択されたサンプルを処理することによってオートファジー誘導する。 </li><li>カバースリップあたり100μlを、室温で10分間、PBSで希釈し、4％パラホルムアルデヒド（PFA、フィッシャーサイエンティフィック、NH）で細胞を固定します。 </li><li> 1ミリリットルHBS / BSAで3回細胞を洗浄。 </li><li>室温で15分間HEPES（HBS）/ BSA、カバースリップあたり100μL、0.05％サポニン（シグマ、MO）で細胞を透過性。 </li><li>以前は免疫標識、HBS / BSA、カバースリップあたり100μlの、で2.5％カゼイン（シグマ、MO）と室温で1時間ブロックサンプルに。 </li><li> 2.5％カゼイン/ HBS / BSA、coversl当たり100μlの希釈した一次抗体を用いて固定した細胞をインキュベート4でIP、O / N°C. </li><li> 1ミリリットルHBS / BSAで3回細胞を洗浄。 </li><li>室温で1時間、2.5％カゼイン/ HBS / BSA、カバースリップあたり100μlの希釈二次抗体と固定された細胞をインキュベートする。 </li><li> 1ミリリットルHBS / BSAで3回細胞を洗浄。 </li><li> 4を含むSlowFadeゴールドまたは延長Gold退色防止試薬（Invitrogen社、CA） &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）との定期的なガラス顕微鏡スライド上に準備されたカバースリップをマウントします。 </li><li>マニキュアでカバースリップの端をシールします。最高のイメージングの結果を得るためには、徹底的に細胞に浸透し、アンチフェードメディアのための時間を（理想的には、O / N）を許可。 </li><li>メタノールおよび/またはクロロホルムでカバースリップの表面を清掃してください。 </li><li> 60X 1.42 NAの対物レンズ（オリンパス、日本）に浸油（屈折率1.520で37イメージング°C、または1.516室温でイメージング）を追加します。 </li><li>位置は、顕微鏡ステージ上のスライドと目的の細胞に焦点を確立します。 </li></ol> 2。パート2：ライブイメージングのための準備の細胞<ol><li> CWRを育てる10％を35ミリメートルにFBSと1％抗生物質ポリ-D-リジンコーティングガラスボトム文化皿（マテック、マサチューセッツ州）を含むRPMI培地中で緑色蛍光タンパク質共役型軽鎖3（LC3-GFP）を発現する22 Rv1ない細胞。細胞は、急速な普及を促進するために十分な密度でプレーティングではなく、そんなに細胞が生い茂ったと撮影時で凝集していること。すべきである</li><li> PBS中ADI（0.3μgの/ ml）で選択された細胞サンプルを扱う。 </li><li>イメージングの前に約1時間は、20ミリリットルRPMIでLysoTrackerレッドDND-99の1.5液（Invitrogen社、CA）を希釈してください。 10％FBSおよび1％抗生物質を含む。選択された試料についてのADIを含む溶液を使用してください。 °Cの前培養皿に追加する37にすべてのメディアを温める。 </li><li> RPMI、37℃で15-45分間LysoTrackerレッドDND-99を含有する細胞をインキュベート</li><li>イメージングの前に約30分で、ウェザーステーション環境エンクロージャをオンにして37に平衡化させ℃、5％CO 2（humidifとIED空気）。 </li><li> PBSで細胞を洗浄し、標準RPMIだけ10％FBS、1％の抗生物質を含有する培地を交換してください。示されるように、サンプルにADIを追加します。 </li><li>マウント35ミリメートルは、カバーガラス底培養カスタマイズアダプター（プレシジョン社、WAを応用）で料理し、顕微鏡ステージ上の位置。 60X 1.42 NA対物レンズにイマージョンオイル（屈折率1.520）を使用して、ステージ上にマウントされた培養皿を置く。 </li></ol> 3。パート3：デコンボリューション顕微鏡と分析このセクションのプロトコルがDeltaVision個人DVデコンボリューション顕微鏡と関連SoftWorXアプリケーションスイート（アプライドプレシジョン社、WA）の使用を前提としています。 <ol><li>取得ワークステーションと機器コントローラを含む、顕微鏡システムの電源をオンにします。顕微鏡のステージを初期化し、キ​​セノン光源をオンにするResolve3Dアプリケーションを開きます。光源のための10分のウォームアップと安定した状態に到達することができます。 </li><li>加える液浸油滴60X 1.42 NAの対物レンズと、対物レンズを介して中央のスライド標本（下カバーガラス面）上の（37でのライブサンプルに対する屈折率1.520°Cまたは室温で固定したサンプルに対して1.516）。 </li><li>液浸オイルのビードが反転カバーガラスに接触するまでのどちらか明視野または外部照明と粗ピント調整ノブを使って、ゆっくりと対物レンズを上げる。 （この時点から、細胞層はファインフォーカスノブを調整してから数ターン内で焦点に来る必要があります）。スライド上に固定された試料を用いて作業を行う場合、それは泡で、任意の領域内またはその付近の細胞を避けることをお勧めします。ガラスボトムディッシュライブサンプルを表示しているときに、ガラスカバースリップの境界の外側に対物レンズを移動させることは避けてください。 </li><li>オートファゴソームがeGFPの信号（緑）によって識別することができます。リソソームはLysoTracker赤（ライブサンプル）または抗ランプ1蛍光抗体（固定サンプル）によって識別されます。細胞核をDAPI第によって識別されるaining（固定サンプル）。 </li><li>所望の視野を選択します。理想的には、細胞は、すべての適切なチャネルで良い蛍光シグナルを示すべきであり、十分に取り付けられており、細胞内の内容が可視化しやすいように、カバーガラス表面上に広がる。横方向のx、y、およびz焦点の微調整をAcquire3Dインタフェースを用いてコンピュータによって制御することができる。表示の目的のフィールド（複数のセルがビニング2x2のに設定されている分野で見ることができます）に応じて、1x1のまたは2x2のにビニングを設定します。 </li><li>セルの中央部を介して与えられた画像については、最大ピクセル強度は3,000カウントを超えないように露光パラメータ（ 例えばパーセント送信電力と露光時間）を設定する。一般に、％透過率が1秒にわたって対応する露光時間を上昇させることなく、可能な限り低く設定する必要がある。最高品質の画像を得るために撮像される毎に蛍光色のために、ビューの各個別分野について、この手順を繰り返します。 </li><li> Uを設定するそれぞれ、細胞試料の頂部および底部上でわずかにフォーカスを調整することにより、ZスタックのPPERと下限。所与のZスタック内の画像の総数は、このように、これらの制限によって、層（：0.2μmのデフォルト値）の間隔によって決定される。 </li><li>画像取得時のモーションアーチファクトを最小限に抑えるために、我々は、固定された試料についての &quot;その後波長zスタック&quot;、および &quot;次にzスタック波長&quot;ライブサンプルのために画像取得モードを設定することをお勧めします。 </li><li>蛍光画像をSoftWorX（アプライドプレシジョン、WA）を使用して、デコンボリューションおよびそれ以降（パーキンエルマー、MA今、Improvision）VoloCITYを用いて分析している。 </li></ol> 4。パート4：超解像、構造化照明（OMX）顕微鏡このセクションのプロトコルは、OMX構造化照明顕微鏡の使用（アプライドプレシジョン、WA）に適用されます。 <ol><li>主電源と希望レーザー（410 nmで、488 nmであり、および/または532 nm）をスイッチオン。 20マイルを待つnは熱的に安定するレーザー用。 </li><li> 60X 1.42 NA対物レンズにイマージョンオイル（室温で固定したサンプルのための屈折率1.516）を追加します。気泡が油滴で見ている場合は、目的をきれいにし、再びオイルを追加。 </li><li>ステージ上で、必要に応じてサンプルスライドを置き、細胞のための10分でカバースリップに落ち着くことができます。 </li><li>取得プログラムを初期化します。セルのシャープな輪郭を見ることができるまでフォーカスを調整する蛍光照明を使用してください。 （注意が実際の画像取得まで、蛍光励起への細胞の曝露を最小限にするため、すべての回で取られるべきである）。 </li><li>螺旋モザイクスキャンは、目的の細胞または領域を選択するために試料のより大きな領域をプレビューする得ることができる。これは、試料をスキャンや目標を見つけながら、短い露光時間（1-10ミリ秒）と低励起パワー（0.1から1パーセント透過）を使用することをお勧めします。 </li><li> GFP-LC3の蛍光によってオートファゴソームを識別します。アレクサフルーア555抗LAMPによるリソソームを識別（リソソーム関連膜タンパク質）およびDAPI（固定サンプル）を用いて細胞核。 </li><li>励起波長、画像領域（ 例えば 512×512）、スタックの厚さは、露光時間、およびレーザー透過率を含む実験条件を選択してください。スーパー解決画像では、構造化照明オプションが有効になっていることを確認。 OMX上のデコンボリューション顕微鏡は、従来の照明オプションを選択します。 </li><li>最高の復興の結果を得るには、最大強度のカウントが取得中10,000と15,000の間にあるような実験条件を選択します。光退色が問題になる場合、低い露光（5,000〜10,000カウント）での画像化を用いることができる。理想的には、カウントが全体取得中に2倍以上に減少させるべきではなく、4倍以上低下は避けるべきである。必要であれば、持続的な強度カウントを確保するために、スタックの厚さを減少させる。カメラがでそう最大、64,000カウントで飽和tensityは、これを超えてはなりません。良いサンプルについては、我々は、1％のレーザー伝送と10なるように実験条件〜50ミリ秒の露光時間を見つけました。繰り返し撮像することができる明るく、光安定試料が好ましい。安定した汚れは、時間経過、スーパー解決画像のために必要です。 </li><li> 2ミリ秒以上のノイズ、95MHzの読み出し速度（中速·オプション）、取得時間を短縮することをお勧めします。サンプルが取得中に移動したときに増加したアーティファクトは、再構築された画像形成さで得られる。この影響により、短期のエクスポージャーは非接着や動きの速い細胞をお勧めします。 </li><li>マルチチャネル画像化は、同時にまたは連続して行うことができる。シーケンシャルモード利回り少ないクロストークとは、このようにお勧めします。 </li><li>退色軽減するために、それは一般的に最初の長い励起波長（532 nmで、488 nmであり、その後410 nm）を用いて画像をお勧めします。しかし、 図3に示す実験結果を得るために、この順序は逆であったこの特定のサンプルの光安定のためにD（ すなわち 48 nmで、532 nmおよび410 nm）を。 </li><li>細胞のトップ/ボトムが出てピントが少しになるまで、顕微鏡のステージを移動することにより、Z-スタックの上限/下限を設定します。復興ソフトウェアはデフォルトとして、この値を取るように各画像間の所望の距離は、超解像イメージングのための0.125程度で一定に保持されるべきである。 </li><li> SoftWorX（アプライドプレシジョン、WA）を用いた画像スタックを再構築VoloCITY 6.0（パーキンエルマー、MA）を使用して分析する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

LC3に対する蛍光プローブで標識された細胞の直接観察が広くオートファジー応答6を確認するための標準的な方法として認められているが、定量的な3D同じシステムのイメージング（私たちが行ったように）、細胞オートファジーの複雑なプロセスについて前例のない情報と詳細を提供。特に、我々は、生細胞におけるオートファゴソームの数百（そうでなければ数千）オートファジ?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

手術はインポテンスや失禁の重大なリスクを運ぶ一方、前立腺がんは米国の男性の間で悪性腫瘍の主要な形式であり、従来の化学療法のアプローチは主に成功していない。ホルモン療法は、早期に有効であるが、多くの場合、ホルモン不応性腫瘍の最終的な開発に失敗する。我々は、腫瘍細胞の特異的な代謝不足を標的治療薬の開発に興味を持ってきた。我々は、最近、前立腺腫瘍細胞を特異的アミノ酸アルギニン1の合成に関与する酵素（アルギニノコハク酸シンターゼ、またはASS）を欠いていることを示した。この条件は、外因性アルギニンに依存するようになるために腫瘍細胞を生じ、遊離アルギニンはアルギニンデイミナーゼ（ADI）1,10でなくなった時点で、彼らは、代謝ストレスを受ける。実際、我々は、ヒト前立腺癌細胞を効果的にCWR22 Rv1のカスパーゼ非依存性アポトーシスおよび積極的なautophaでADIによって殺されていることが示されているGY（またはマクロオートファジー ）1,2,3。オートファジーは、細胞が4,5栄養飢餓時のリソソーム分解により不要なタンパク質を代謝することができます進化的に保存されたプロセスである。この経路の必須成分は、6,7,8,9十分に特徴付けられているが、分子機構の多くの側面は、まだ不明である-特に、ADI処理後の前立腺癌細胞の死応答におけるファジーの役割は何か？この問題に対処するために、我々は細胞内のオートファジー応答のレベルと範囲を測定するための実験方法を必要とし - そして、正確に、このプロセスを追跡することができます知られて分子マーカーが存在しないので、我々が使用して、イメージングベースのアプローチを開発することを選んだん定量的な3D蛍光顕微鏡11,12。 オートファゴソームとリソソームのための蛍光プローブと特異的に標識CWR22Rv1細胞を使用して、我々は3次元画像スタックがWiどちらで取得することを示すdefieldデコンボリューション顕微鏡（以降では、超解像と、構造化照明顕微鏡）が明らかにオートファジー誘導の初期段階をキャプチャすることができます。市販のデジタル画像解析アプリケーションにより、我々は容易にオートファゴソームとリソソーム数、大きさ、分布、および任意の画像化された細胞からの共局在化の程度に関する統計情報を取得することができます。この情報は、私たちは正確に生細胞におけるオートファジーの進行状況を追跡することを可能にし、癌化学療法におけるオートファジーの役割への当社の継続的な調査を可能にします。

図1に示す画像シーケンスは、ファジー誘導の最初の80分間にCWR22細胞内で発生する物理的変化を示している。これと他の研究（図示せず）で、我々は一貫して観察された：核の（1）の変位距離、セル中心から、接着斑点の（2）の削減、およびの中心に向かってオートファゴソームとリソソームの（3）一般的な転セル。さらに、我々はまた、後の時点において、オートファゴ（?...

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Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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17.8K ビュー.  University of California, Davis. オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。

ビデオ: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

生物学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

オートファジーの解析で<em&gt;ペニシリウム·クリソゲヌム</em&gt;蛍光顕微鏡と組み合わせて飢餓パッドを使用した

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...